病毒的實驗室診斷與防治第1頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月

病毒感染的實驗室檢查包括病毒分離與鑒定、病毒核酸與抗原的直接檢出以及特異性抗體的檢測。臨床醫(yī)師根據流行病學資料，疾病的癥狀與體征綜合判斷可能為何種病毒感染，留取適宜的標本送檢。第2頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月一、檢材的采集與送檢病毒性疾病通常采集血液、鼻咽分泌液、痰、糞便、腦脊液、皰疹內容物等。供送檢的標本的要求：盡早采取、部位適宜、冷藏速送第3頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）盡早采取在發(fā)病初期（急性期）采取，較易檢出病毒，越遲陽性率越低。第4頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）部位適宜由感染部位采取，如呼吸道感染采取鼻咽洗漱液或咯痰；腸道感染采取糞便；腦內感染采取腦脊液；皮膚感染采取病灶組織；有病毒血癥時采取血液。第5頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）冷藏速送病毒離活體后在室溫下很易死亡，故采得檢材應盡快送檢。若距離實驗室較遠，應將檢材放入裝有冰塊或干冰的容器內送檢。污染檢材，如鼻咽分泌液、糞便等應加入青霉素、鏈霉素或慶大毒素等，以免雜菌污染細胞或雞胚，而影響病毒分離。第6頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月二、病毒的分離與鑒定（一）病毒的分離

病毒分離的一般程序是：

檢驗標本→殺滅雜菌(青、鏈霉素)→接種易感的動物→出現病狀

→鑒定病毒種型(血清學方法)雞胚→病變或死亡細胞培養(yǎng)→細胞病變第7頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月無菌標本(腦脊液、血液、血漿、血清)可直接接種細胞、動物、雞胚；無菌組織塊經培養(yǎng)液洗液洗滌后制成10～20%懸液離心后，取上清接種；咽洗液、糞便、尿、感染組織或昆蟲等污染標本在接種前先用抗生素處理，殺死雜菌。第8頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月1．細胞培養(yǎng)用分散的活細胞培養(yǎng)稱細胞培養(yǎng)（Cellculture）。所用培養(yǎng)液是含血清（通常為胎牛血清）、葡萄糖、氨基酸、維生素的平衡溶液，pH7.2～7.4。細胞培養(yǎng)適于絕大多數病毒生長，是病毒實驗室的常規(guī)技術。第9頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月原代細胞培養(yǎng)(Primarycellculture)二倍體細胞培養(yǎng)(Diploidcellcultune)傳代細胞培養(yǎng)(Continouscellculture)淋巴細胞培養(yǎng)（Lymphocyteculture）第10頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月原代細胞培養(yǎng)(Primarycellculture)

用胰蛋白酶將人胚（或動物）組織分散成單細胞，加一定培養(yǎng)液，37℃孵育1-2天后逐漸在培養(yǎng)瓶底部長成單層細胞，如人胚腎細胞、兔腎細胞。原代細胞均為二倍體細胞，可用于產生病毒疫苗，如兔腎細胞生產風疹疫苗，雞成纖維細胞產生麻疹疫苗，猴腎細胞生產脊髓灰質炎疫苗。因原代細胞不能持續(xù)傳代培養(yǎng)，故不便用于診斷工作。第11頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月二倍體細胞培養(yǎng)(Diploidcellcultune)

原代細胞只能傳2-3代細胞就退化，在多數細胞退化時，少數細胞能繼續(xù)傳下來，且保持染色體數為二倍體，稱為二倍體細胞。二倍體細胞生長迅速，并可傳50代保持二倍體特征，通常是胚胎組織的成纖維細胞。第12頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月二倍體細胞一經建立，應盡早將細胞懸浮于10%二甲基亞砜中，大量分裝安瓿貯存于液氮（-196℃）內，做為“種子”，供以后傳代用。目前多用二倍體細胞系制備病毒疫苗，也用于病毒的實驗室診斷工作。第13頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月傳代細胞培養(yǎng)(Continouscellculture)

通常是由癌細胞或二倍體細胞突變而來染色體數為非整倍體，細胞生長迅速，可無限傳代，在液氮中能長期保存。目前廣泛用于病毒的實驗室診斷工作，根據病毒對細胞的親嗜性，選擇敏感的細胞系使用。第14頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月淋巴細胞培養(yǎng)（Lymphocyteculture）

正常成熟的淋巴細胞不經特殊處理不能在體外傳代培養(yǎng)。然而EBV感染的B淋巴細胞卻能在體外持續(xù)傳代，這是病毒轉化細胞的例證，也是分離出EBV的標志。T淋巴細胞在加入T細胞生長因子（IL-2）后可在體外培養(yǎng)，為研究人類逆轉錄病毒（HIV、HTLV）提供了條件，HIV在T淋巴細胞培養(yǎng)物中增殖形成多核巨細胞。第15頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月2．動物試驗

這是最原始的病毒分離培養(yǎng)方法。常用小白鼠、田鼠、豚鼠、家兔及猴等。接種途徑根據各病毒對組織的親嗜性而定，可接種鼻內、皮內、腦內、皮下、腹腔或靜脈，例如嗜神經病毒（腦炎病毒）接種鼠腦內，柯薩奇病毒接種乳鼠（一周齡）腹腔或腦內。接種后逐日觀察實驗動物發(fā)病情況，如有死亡，則取病變組織剪碎，研磨均勻，制成懸液，繼續(xù)傳代，并作鑒定。第16頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月3．雞胚培養(yǎng)

用受精孵化的活雞胚培養(yǎng)病毒比用動物更加經濟簡便。根據病毒的特性可分別接種在雞胚絨毛尿囊膜、尿囊腔、羊膜腔、卵黃囊、腦內或靜脈內，如有病毒增殖，則雞胚發(fā)生異常變化或羊水、尿囊液出現紅細胞凝集現象，常用于流感病毒及腮腺炎病毒等的分離培養(yǎng)；但很多病毒在雞胚中不生長。第17頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）分離病毒的鑒定1．病毒在細胞內增殖的指征2．病毒感染性的定量測定3．病毒形態(tài)與結構的觀察4．血清學鑒定第18頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月1．病毒在細胞內增殖的指征（1）細胞病變作用(Cytopathogeniceffect,CPE)（2）紅細胞吸附現象（Hemadsorptionphenomenon）（3）干擾現象

(Interferencephenomenon)第19頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月（1）細胞病變作用(Cytopathogeniceffect,CPE)

病毒在細胞內增殖引起細胞退形性病變，表現為細胞皺縮、變圓、出現空泡、死亡和脫落。某些病毒產生特征性CPE，普通光學倒置顯微鏡下可觀察上述細胞病變，結合臨床表現可做出預測性診斷。第20頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）紅細胞吸附現象（Hemadsorptionphenomenon）

流感病毒和某些副粘病毒感染細胞后24-48小時，以細胞膜上出現病毒的血凝素，能吸附豚鼠、雞等動物及人的紅細胞，發(fā)生紅細胞吸附現象。若加入相應的抗血清，可中和病毒血凝素、抑制紅細胞吸附現象的發(fā)生，稱為紅細胞吸附抑制試驗。這一現象不僅可作為這類病毒增殖的指征，還可作為初步鑒定。第21頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月（3）干擾現象(Interferencephenomenon)

一種病毒感染細胞后可以干擾另一種病毒在該細胞中的增殖，這種現象叫干擾現象。第22頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月2．病毒感染性的定量測定（1）空斑形成單位(Plaque-formingunit,PFU)測定（2）50%致死量（LD50）或50%組織細胞感染量（TCID50）的測定第23頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月（1）空斑形成單位(Plaque-formingunit,PFU)測定這是一種測定病毒感染性比較準確的方法。將適當濃度的病毒懸液接種到生長單層細胞的玻璃平皿或扁瓶中，當病毒吸附于細胞上后，再在其上復蓋一層溶化的半固體營養(yǎng)瓊脂層，待凝固后，孵育培養(yǎng)。第24頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月當病毒在細胞內復制增殖后，每一個感染性病毒顆粒在單層細胞中產生一個局限性的感染細胞病灶，病灶逐漸擴大，若用中性紅等活性染料著色，在紅色的的背景中顯出沒有著色的“空斑”，清楚可見。由于每個空斑由單個病毒顆粒復制形成，所以病毒懸液的滴度可以用每毫升空斑形成單位（PFU）來表示。第25頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）50%致死量（LD50）或50%組織細胞感染量（TCID50）的測定本法可估計所含病毒的感染量。方法是測定病毒感染雞胚，易感動物或組織培養(yǎng)后，引起50%發(fā)生死亡或病變的最小病毒量，即將病毒懸液作10倍連續(xù)稀釋，接種于上述雞胚，易感動物或組織培養(yǎng)中，經一定時間后，觀察細胞或雞胚病變，如絨毛尿囊膜上產生痘斑或尿囊液有血凝特性，或易感動物發(fā)病而死亡等，經統(tǒng)計學方法計算出50%感染量或50%組織細胞感染量，可獲得比較準確的病毒感染性滴度。第26頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月3．病毒形態(tài)與結構的觀察

病毒懸液經高度濃縮和純化后，借助磷鎢酸負染及電子顯微鏡可直接觀察到病毒顆粒，根據大小、形態(tài)可初步判斷病毒屬那一科。還可用分子生物學技術分析病毒核酸組成、基因組織構、序列同源性比較加以鑒定。第27頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月4．血清學鑒定

用已知的診斷血清來鑒定。補體結合試驗可鑒定病毒科屬；中和試驗或血凝搗蛋制試驗可鑒定病毒種、型及亞型。從病人檢材中分離出病毒株，應結合臨床癥狀，檢材來源及流行季節(jié)等加以綜合分析，并應注意混雜病毒、隱性感染或潛伏病毒的混淆，須用病人急性期與恢復期雙份血清作血清學試驗，血清抗體滴度有≥4倍以上增高，才有意義。第28頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月三、病毒核酸及抗原的直接檢出（一）直接檢出病毒核酸1．核酸雜交（Nucleicacidhybridization）2．多聚酶鏈反應(Polymerasechainreaction,PCR)（二）直接檢測病毒抗原1．免疫熒光（IF）技術2．免疫酶法（IEA）3．放射免疫測定法（RIA）4．酶聯免疫吸附試驗（ELISA）第29頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月1．核酸雜交（Nucleicacidhybridization）臨床病毒學中快速診斷方法通常是檢測標本中的病毒抗原，然而核酸分子雜交具有高度敏感性和特異性，斑點雜交(Dothybridization)廣泛用于檢測呼吸道標本，尿標本中的病毒核酸。第30頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月標本滴加到硝酸纖維素膜上，病毒DNA結合到膜上，在原位進行堿變性處理后，有放射標記的已知病毒DNA片段雜并，兩條單股核酸按堿基到補原則結合成雙股，經放射自顯影，陽性結果出現斑點狀雜交信號。第31頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月含輪狀病毒的糞便標本經熱變性處理，點到膜上，使用輪狀病毒體外轉錄的放射標記探針做斑點雜交，敏感性高于ELISA（酶聯免疫吸附劑測定enzymelinkedimmunosorbentassay

）。腸道病毒也可用互補的DNA探針做斑點雜交。第32頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月目前核酸分子雜交不但用來檢測急性病人標本中的病毒DNA，也用于檢測不易分離培養(yǎng)的慢性感染、潛伏感染、整合感染病人標本中的病毒DNA。第33頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月2．多聚酶鏈反應(Polymerasechainreaction,PCR)

一種體外基因擴增法。將擴增的基因經瓊脂糖電泳，可見到溴化乙錠染色的核酸條帶，擴增片段的大小取決于兩引物的間距。此法較核酸雜交敏感、快速，已用于肝炎、AIDS、皰疹病毒感染診斷，尤其適用于不易分離培養(yǎng)及含量極少的病毒標本，有較大應用前景。第34頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）直接檢測病毒抗原1．免疫熒光（IF）技術如前所述IF可用于細胞培養(yǎng)病毒的鑒定，也適用檢測臨床標本中病毒抗原，具有快速、特異的優(yōu)點。直接免疫熒光技術是用熒光素直接標記特異性抗體，檢測病毒抗原；間接免疫熒光技術是先用特異性抗體與標本中抗原結合，再用熒光素標記的抗體與特異性抗體結合，從而間接識別抗原。第35頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月2．免疫酶法（IEA）原理與應用范圍同免疫熒光技術，IEA是用酶（通常是過氧化物酶）取代熒光素標記抗體，酶催化底物形成有色產物，在普通光學顯微鏡下清晰可見，不需熒光顯微鏡，便于推廣使用。第36頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月3．放射免疫測定法（RIA）有競爭RIA和因相RIA二種方法。競急RIA是同位素標記的已知抗原與標本中未標記的待檢抗原競爭性結合特異性抗體的試驗，將形成的復合物分離出來，用放射免疫檢測儀測定放射活性，同時與系列稀釋的標準抗原測定結果進行比較，確定出待檢抗原的濃度。第37頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月因相RIA是用特異性抗體包被因相以捕獲標本中的抗原，然后加入放射性標記的特異性抗體與抗原結合，測定放射活性，得知抗原的量。RIA是最敏感的方法，已用于測定糞便中甲肝病毒、輪狀病毒抗原及血液中乙肝病毒抗原。第38頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月4．酶聯免疫吸附試驗（ELISA）先將特異性抗體包被（吸附）到塑料微培板孔中以捕捉標本中相應抗原，然后加入酶標特異性抗體，相應抗原被夾在抗體之間，當加入酶的底物后顯色，顯色程度直接反映了標本中病毒抗原的量。因其敏感性接近RIA，又不接觸放射性物質，已被多數實驗室采用。第39頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月此外，對難以分離培養(yǎng)，形態(tài)特殊且病毒數量較多的標本，可用電鏡或免疫電鏡法直接觀察，是一種快速診斷與鑒定病毒的方法，如輪狀病毒、乙肝病毒。第40頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月四、特異性抗體的檢測特異性抗體的檢測病毒感染后通常誘發(fā)針對病毒一種或多種抗原免疫應答，特異性抗體效價升高或lgM抗體出現有輔助臨床診斷的價值。（一）補體結合試驗（CF）（二）中和試驗（NT）（三）血凝抑制試驗（Hemagglutinationinhibitiontest,HIT）（四）lgM捕捉第41頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）補體結合試驗（CF）

CF分二個階段：1.抗原與抗體（一個為已知，一個為待檢）混合，加入定量補體，若抗原與抗體相對應，則補體被消耗；第42頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月2.在上述混合物中加入溶血素致敏的綿羊紅細胞，若補本已與抗原抗體復合物完全結合，沒有剩補體存在，那么綿羊紅細胞不會溶血，結果為陽性，說明待檢標本中有特異性存在，出現陽性結果時血清標本最高稀釋度為抗體的效價。反之為陰性結果。由于補體結合抗體產生早，消失快，適于診斷病毒近期感染。第43頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）中和試驗（NT）在活體或活細胞內測定病毒被特異性抗體中和、而失去致病力的試驗。試驗時：①須先測出病毒的半數致死量（LD50）或半數感染量（ID50）；②隨即取活病毒與被試血清按不同比例混合，放置1～2小時讓其充分中和；第44頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月③將病毒與血清混合液注入各組動物、雞胚或組織細胞培養(yǎng)管內培養(yǎng)；④根據動物、雞胚死亡數或細胞病變的管數，計算出百分比（%），然后再計算這些試驗對象中的半數免于死亡或免于致病所需要的最少量血清（或最大量的病毒），就是該血清的中和抗體效價（稱為50%終點的中和效價）。第45頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月診斷病毒性疾病時，須取病人雙份血清同時做對比試驗，病后血清的中和抗體效價也必須超過病初血清4倍以上，才能確診。用此法鑒定病毒時，須將病毒分別與免疫血清及血清正常血清（對照）混合做對比試驗，免疫血清比正常血清多中和50～100倍劑量的病毒，才能斷定是該病毒。第46頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月病毒中和抗體的特異性高，持續(xù)時間久，以往受顯性或隱性感染后，血中可長期存在中和抗體，所以適用于流行病學調查或人群免疫水平研究，但因試驗方法繁雜，耗用動物、雞胚或細胞培養(yǎng)較多，故一般不作常規(guī)使用。第47頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）血凝抑制試驗（Hemagglutinationinhibitiontest,HIT）某些病毒（流感病毒、副流感病毒、腮腺炎病毒、腦炎病毒等）能凝集紅細胞，而抗體與這些病毒結合后卻能阻止它們的凝集，若雙份血清有≥4倍以上滴度增高，也可用于診斷這類病毒感染。本法簡便、快速、經濟、特異性高，常用于流行病學調查等。第48頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月（四）lgM捕捉特異性lgM出現于病毒感染的早期或病毒感染的活動期，因此可從急性期病人單份血清中檢出特異性lgM，這是病毒感染實驗室早期診斷的可靠方法?，F已廣泛用于病毒病的早期診斷。在先天性感染中，lgM檢測有特殊意義，因lgM不能通過胎盤，新生兒血清中發(fā)現抗病毒lgM提示為宮內感染。第49頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月病毒感染的防治原則第50頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月一、免疫預防1．減毒活病毒疫苗（Liveattenuatedvirusvaccines）

2．滅活病毒疫苗(Killedvirusvaccines)3．亞單位疫苗(Subunitvaccines)4．基因工程疫苗第51頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月1．減毒活病毒疫苗（Liveattenuatedvirusvaccines）選用抗原性與野毒株一致而穩(wěn)定無毒或顯著減毒的活病毒突變株做為疫苗?？珊Y選自然減毒株，或在多種宿主中連續(xù)傳代培養(yǎng)誘導出減毒株。接種活病毒疫苗近似自然感染，在宿主中可繁殖，僅接種一次便可較長時間刺激抗體產生及細胞介導的免疫應答，并可產生局部抗體。第52頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月活疫苗的不利之處在于：①在接種者體內增殖中有恢復毒力的潛在危險性；②野毒株感染可干擾疫苗株的免疫效果；③老年人、免疫缺陷者不宜接種；④保存期、有效期有限。第53頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月2．滅活病毒疫苗(Killedvirusvaccines)

將純化的病毒用甲醛處理滅活其感染性，而不損傷病毒結構蛋白，做為一種疫苗。滅活病毒疫苗是完整的病毒，可誘生循環(huán)抗體，獲得一定程度的免疫力。第54頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月應注意的是：①制備中確保無殘留的活病毒；②加強免疫或后續(xù)病毒感染時可能出現對外源性蛋白質的超敏反應；③對呼吸道、消化道感染的病毒病預防效果不佳，不能產生足夠的局部免疫力；④細胞介導的免疫應答較差。第55頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月3．亞單位疫苗(Subunitvaccines)

用化學試劑裂解病毒，提取囊膜或衣殼的蛋白質亞單位，除去核酸而制成亞單位疫苗。目前用基因克隆到原核或真核表達載體中，并在原核或真核細胞中得到表達，經純化制備出亞單位疫苗。4.基因工程疫苗第56頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月二、藥物治療（一）化學療劑病毒性疾病目前尚缺少特效治療藥物，原因是病毒在細胞內增殖，凡能殺死病毒的藥物，同時多對宿主細胞也有損害。隨著分子病毒學研究的進展，目前能對藥物抑制作用的確切靶位作出鑒定。第57頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月理論上，病毒復制的任何環(huán)節(jié)均是抗病毒治療的作用靶位?，F已發(fā)現一些藥物有治療價值，允許使用的有無環(huán)鳥苷，金剛胺、碘苷、三氟尿苷、腺苷、病毒唑、疊氮胸苷等，使用范圍有一定局限性，且或多或少有細胞毒性作用。第58頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月1．核苷類似物無環(huán)鳥苷（Acycloguanosine,Acyclovir）為脫氧鳥苷的類似物，該藥被病毒編碼的胸苷激酶（TK）磷酸化，借助病毒DNA多聚酶，摻入病毒DNA中，阻斷DNA鏈的延伸。對編碼TK的單純皰疹，水痘帶狀皰疹病毒感染有治療作用，而對不編碼TK的巨細胞病毒、EB病毒不敏感。磷酸化的無環(huán)鳥苷對宿主細胞DNA多聚酶親和力較低，較少影響宿主細胞。第59頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月已用于治療原發(fā)性皰疹性角膜炎，但對復發(fā)性皰疹損傷治療效不佳；全身用藥可預防潛伏感染的復燃，對處于免疫抑制狀態(tài)病人的活動性皰疹感染也有治療作用。第60頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月此外，與無環(huán)鳥苷類似的甲基鳥嘌呤衍生物丙氧鳥苷(Ganciclovir,dihydroxypropoxymethylguanine,DHPG)，體外實驗表明對巨細胞病毒有明顯抑制作用，在巨細胞病毒嚴重感染的病人取得了較好的效果，機理不詳。第61頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月疊氮胸苷(Azidodeoxythymidine,AZT)

為合成胸腺嘧啶核苷的類似物，阻斷前病毒DNA合成，從而抑HIV的復制。HIV逆轉錄酶對該藥的敏感性較細胞DNA多聚酶高100倍，對AIDS病人有治療作用，但該藥有較多毒付作用，包括骨髓抑制，停藥后可恢復。第62頁，課件共70頁，創(chuàng)作于2023年2月阿糖腺苷(Adeninearabinoside,ara-A)

為腺嘌呤的衍生物，作用機理不詳，可能是抑制病毒多聚酶，阻斷病