第二章蛋白質與酶學基礎第1頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月酶促反應動力學研究酶促反應的速度以及影響酶促反應速度的各種因素，包括底物濃度、酶濃度、pH、溫度、激活劑與抑制劑等。2.4、酶促反應動力學第2頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月酶促反應動力學基本公式

催化反應進行中的[ES]量恒定，也就是說[ES]的生成量等于其消失量；[ES]的生成量等于k1[E][S][ES]的消失量則有兩個方向：等于生成量，則可以得到上圖其一當然是變成了[E]+[P]，受到k3的控制；因此其消失量為k3[ES]；另一個消失方式為退回去成為[E]+[S]，即為k2[ES]。

因此，得到（I）式第3頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月酶促反應動力學基本公式另外，我們定義總酶量[Et]等于自由的酶[Ef]加上已經與基質結合的酶[ES]，因此可以得到(II)式另外，我們定義總酶量[Et]等于自由的酶[Ef]加上已經與基質結合的酶[ES]，因此可以得到(II)式另外，我們定義總酶量[Et]等于自由的酶[Ef]加上已經與基質結合的酶[ES]，因此可以得到(II)式另外，我們定義總酶量[Et]等于自由的酶[Ef]加上已經與基質結合的酶[ES]，因此可以得到(II)式另外，我們定義總酶量[Et]等于自由的酶[Ef]加上已經與基質結合的酶[ES]，因此可以得到(II)式另外，我們定義總酶量[Et]等于自由的酶[Ef]加上已經與基質結合的酶[ES]，因此可以得到(II)式另外，我們定義總酶量[Et]等于自由的酶[Ef]加上已經與基質結合的酶[ES]，因此可以得到(II)式第4頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月酶促反應動力學基本公式催化反應整體表現(xiàn)出來的速率vo決定于后半段的反應，也就是說只要看生成物的產量[ES]→[E]+[P]；因此vo可以說是k3[ES]，得到(III)式。第5頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月酶促反應動力學基本公式所有的酶[Et]都變成[ES]時，將會達到想象中的最高速率Vmax，則可寫成(IV)式Vmax=k3[Et]。所有的酶[Et]都變成[ES]時，將會達到想象中的最高速率Vmax，則可寫成(IV)式Vmax=k3[Et]。所有的酶[Et]都變成[ES]時，將會達到想象中的最高速率Vmax，則可寫成(IV)式第6頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月酶促反應動力學基本公式第7頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月vo=Vmax[S]Km

+

[S]KmVmax&E1E2E31storderzeroorder直接做圖雙倒數(shù)做圖與底物的親和力催化的最大速率活性單位改變底物濃度[S]觀察vo的改變可以作圖法求得Vmax

和Kmk3[Et]kcatCatalyticnumberkcat

/

KmActivityUnit1mmolemin比活性unitmgSignificance第8頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月催化常數(shù),kcatvo

=Vmax

[S]Km

+

[S](vo)E+SES

E+Pk2k1k3Whensubstrateexcess,

k3

=

kcat,catalyticnumberWhen[substrate]islow=k3[E][S]Km

+

[S]=Kmk3[E][S]Omitthe[substrate]SubstratespecificityStartfromM-Meq.Secondorder(IV)第9頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月一些酶的催化常數(shù)過氧化氫酶

H2O2碳酸酐酶

HCO3-乙酰膽堿酯酶

Acetylcholine40,000,000400,000140,000b-內酰胺酶

Benzylpenicillin2,000延胡索酸酶

Fumarate800

ATP酶

ATP0.4酶底物kcat

(s-1)每一分子酶每秒鐘所能轉換底物分子的數(shù)目第10頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月

O

R

OH3C–C–N–C–C–O–CH3

H

H=–=––胰凝乳蛋白酶對不同底物的kcat

/

Km–HGlycinekcat/Km1.3╳10-1–CH2–CH2–CH3Norvaline3.6╳102–CH2–CH2–CH2–CH3Norleucine3.0╳103–CH2–Phenylalanine1.0╳105(M-1·s-1)R=用kcat/Km可以同時同時監(jiān)視酶對基質的親和力，以及該酶的Vmax(kcat)，是一個比較理想的酶行為指標；此一比值越大者，有越好的催化力。第11頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月

影響酶反應速率的主要因素分類影響速率的主要因素從其研究可獲得的信息濃度因素酶濃度、底物濃度、產物濃度、效應物濃度反應機理、反應速率常數(shù)(速率參數(shù))外部因素(反應環(huán)境)溫度標準熱力學量及活化熱力學量;速率參數(shù)的物理意義等pH對反應有貢獻的活性解離pK值及解離熱(溫度對pK值的效果);解離基團的種類及其作用離子強度鹽類濃度的影響溶劑介電常數(shù)隨著反應產生的靜電變化(電荷分布狀態(tài)的變化)內部因素(結構因素)底物或效應物的結構底物、效應物和酶相結合的性質;酶活性部位的結構等酶的結構酶的催化活性以及同底物結合，必要的氨基酸殘基；活性必需的立體結構等第12頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月vo=Vmax[S]Km

+

[S]KmVmax&E1E2E31storderzeroorderCompetitiveNon-competitiveUncompetitive直接做圖雙倒數(shù)做圖雙底物反應也可應用在M-M公式，但在測定時另一個底物的濃度要飽和與底物的親和力催化的最大速率酶抑制活性單位改變底物濃度[S]觀察vo的改變可以作圖法求得Vmax

和Kmk3[Et]kcatCatalyticnumberkcat

/

KmActivityUnit1mmolemin比活性unitmgSignificance第13頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月酶的抑制可逆性抑制不可逆抑制抑制劑與酶非共價結合抑制劑與酶共價性修飾競爭性非競爭性反競爭性Penicillin青霉素重金屬(Hg,Pb)DFP,TPCKSarin(-Ser)PCMB(-Cys)第14頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月競爭性非競爭性反競爭性EEDifferentsiteCompeteforactivesiteInhibitorSubstrate[I]bindstofree[E]only,andcompeteswith[S];increasing[S]overcomesInhibitionby[I].[I]bindstofree[E]or[ES]complex;Increasing[S]cannotovercome[I]inhibition.[I]bindsto[ES]complexonly,increasing[S]favorstheinhibitionby[I].E+S

→

ES

→

E+P+

I↓EI

←

↑E+S

→

ES

→

E+P++

I

I↓↓EI

+

S

→EIS

←

↑

↑E+S

→

ES

→

E+P+

I↓EIS

←

↑X圖解抑制基理及說明酶的抑制(機制)第15頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月酶的抑制(做圖)競爭性非競爭性反競爭性Vmax

和

Km

都變小Km[S],mMVmaxIKm’Vmax’ITwoparallellines1/[S]1/Km1/

Vmax1/voKmVmax[S],mMvoIVmax’Vmax

變小Km

不變IIntersectatXaxis1/vo1/

Vmax1/[S]1/Km=

Km’VmaxKmKm’[S],mMvoIVmax

不變Km

變大I1/[S]1/Km1/vo1/

VmaxIntersectatYaxis雙倒數(shù)做圖直接做圖第16頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月競爭性抑制SuccinateGlutarateMalonateOxalate琥珀酸脫氫酶底物競爭性抑制劑產物C-OO-

C-H

C-H

C-OO-

C-OO-

H-C-H

H-C-H

C-OO-

C-OO-

H-C-H

H-C-H

H-C-H

C-OO-C-OO-

C-OO-

C-OO-

H-C-H

C-OO-為何是抑制劑而非底物？第17頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月磺胺類藥也是一種競爭性抑制劑-COOHH2N--SONH2H2N-前體葉酸四氫化葉酸Sulfanilamide磺胺類藥(消炎藥)對氨基苯甲酸(PABA)細菌的葉酸合成需要PABA磺胺類可分別抑制二氫葉酸合成酶與二氫葉酸還原酶,妨礙葉酸代謝,最終影響核酸合成,從而抑制細菌的生長和繁殖。第18頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月抑制劑Inhibitor胰蛋白酶Trypsin不可逆的蛋白酶抑制劑第19頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月HIV蛋白酶與天冬氨酸蛋白酶

不對稱單體↓

HIV蛋白酶

(同源二聚體)

HIV蛋白酶

抑制劑可抑制HIV增殖對稱二聚體Aspsubunit2↑天冬氨酸蛋白酶(單體)subunit1Aspdomain1domain2AspAsp第20頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月天冬氨酸蛋白酶以天冬氨酸吸住水分子此水分子將參與水解反應第21頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月設計專一性的抑制劑HIV病毒存活需要Asp蛋白酶人類也有類似的Asp蛋白酶病毒蛋白酶活性會受抑制劑干擾設計抑制劑藥物只會攻擊病毒人體不會受害第22頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月分子對稱的HIVProtease抑制劑Drugdesign藥物設計CombinatoryChemistry組合化學HIV蛋白酶第23頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月青霉素Penicillin抗生素●細菌細胞壁合成：酶GT

把短鏈多肽▲接到細胞壁●不可逆性抑制攻擊活性區(qū)！共價性修飾第24頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月細菌細胞壁含有短鏈氨基酸SugarchainGlycopeptideTranspeptidase(GT)把短鏈多肽接到多糖五肽骨架tetrapeptidepentaglycine第25頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月青霉素Penicillin抗生素●細菌細胞壁合成：酶GT

把短鏈多肽▲接到細胞壁●→青霉素類似酶GT

底物D-Ala-D-Ala(木馬屠城)→青霉素與酶GT

活性區(qū)Ser-OH

反應(捕鼠器)●化學修飾劑：→共價修飾活性區(qū)上的氨基酸，抑制酶活性。[E]-Cys-SH...PCMB←人造的proteaseinhibitor↓[E]-Ser-OH...DFP,TPCK(抑制胰凝乳蛋白酶);TLCK(胰蛋白酶)→

Sarin神經毒氣(抑制乙酰膽堿酯酶)不可逆性抑制攻擊活性區(qū)！共價性修飾第26頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月Penicillin與酶GT活性區(qū)結合第27頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月Penicillin構形類似細菌多糖四元環(huán)糖肽骨架第28頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月化學性共價修飾劑第29頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月有些毒氣是酶抑制劑第30頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月RegulatorysubunitPRR+orinhibitorproteolysisphosphorylationcAMPorcalmodulinorregulatoreffectorP(-)(+)InhibitorProteolysisPhosophorylationSignaltransductionFeedbackregulation2.5、酶的活性調控第31頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月

酶原(zymogen)：酶的無活性的前體

酶原的激活：由無活性的酶原轉變?yōu)橛谢钚缘拿傅倪^程。

酶原激活的意義：在特定的環(huán)境和條件下發(fā)揮作用；避免細胞自身消化；有的酶原可以視為酶的儲存形式。（一）蛋白質裂解：不可逆的共價性修飾

第32頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月

酶原激活的機理:酶原分子構象發(fā)生改變形成或暴露出酶的活性中心

一個或幾個特定的肽鍵斷裂，水解掉一個或幾個短肽在特定條件下第33頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月一些蛋白質裂解的例子●

胰島素Insulin(非酶):Achain&Bchain；Cchain●凝血機制Fibrin←Thrombin←←←←←傷口以cascade(梯瀑式)誘發(fā)極為危險的凝血反應●蛋白酶原活化機制Trypsin,Chymotrypsin,ElastaseCT切出新的N-端(Ile16)可結合Asp194→定位Ser195Zymogen酶原(危險的酶)→以胞器隔離之第34頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月胰島素分子含有A、B兩條多肽鏈，鏈間以2對二硫鍵相連。A鏈內還有1對二硫鍵。611S-SSSSS720197ArgArgArgLysS-SSSSS胰島素C肽+胰島素原前胰島素原是胰島素原的前體。前胰島素原與胰島素原相比，比胰島素原在N端多了一個肽段。此肽段稱為信號肽。第35頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月凝血機制是一連串蛋白酶的作用

第36頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月都是蛋白酶纖維蛋白原纖維蛋白第37頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月怪頭博士的絕妙發(fā)明

第38頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月CascadenSnP1Enzyme梯瀑式放大效應一傳十十傳百第39頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月蛋白酶之間互相裂解活化胰蛋白酶原胰蛋白酶腸激酶胰凝乳蛋白酶原π胰凝乳蛋白酶α胰凝乳蛋白酶彈性蛋白酶原彈性蛋白酶羧肽酶原羧肽酶第40頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月賴纈天天天天甘異賴纈天天天天纈組絲SSSS46183甘異纈組絲SSSS腸激酶胰蛋白酶原活性中心胰蛋白酶原的激活過程胰蛋白酶第41頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月R15-I16Chymotrypsinogen(inactive)p-Chymotrypsin(active)S14-R15T147-N148Trypsina-Chymotrypsinogen(active)p-ChymotrypsinI16L13A149Y146DisulfidebondsChymotrypsin要先經裂解后才有活性第42頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月Asp102His57Ser195Asp194Gly193Ile16+NH3CatalyticTriad新的Ile16N端可以穩(wěn)定Asp194第43頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月

ChargeRelayinActiveSiteSer195His57Asp102H–O–CH2OC–O

-=ActiveSerH–NNCCCHHCH2Ser195His57Asp102-

O–CH2OC–O–H=NN–HCCCHHCH2第44頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月通過其它酶對其多肽鏈上的某些基團進行可逆的共價修飾，使酶處于活性/非活性的互變狀態(tài)，從而調節(jié)酶的活性。（二）可逆的共價修飾第45頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月酶酶-P蛋白激酶，磷酸化磷酸酶，脫磷酸化酶的活性形式：可能是磷酸化也可能是脫磷酸化由核苷三磷酸（ATP）提供磷酸基第46頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月生理條件下：幾乎所有的蛋白激酶都以ATP為磷酸基的供體，幾乎所有的磷酸化反應都需Mg2+。（1）Thr、Ser、Tyr、Asp、Glu┉P-O鍵連接（2）Lys、Arg、His┉P-N鍵連接底物蛋白質被磷酸化的氨基酸殘基有兩類：第47頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月第48頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月磷酸化造成劇烈的構形變動Cyclin-dependentkinase磷酸片段被正電荷抓住周期蛋白依賴性激酶第49頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月第50頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月鈣調蛋白的作用模式鈣調蛋白激酶II鈣調蛋白第51頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）別構調控（allostericregulation）

1、定義別構調節(jié)：酶分子的非催化部位與某些化合物可逆地非共價結合后發(fā)生構象的改變，進而改變酶活性狀態(tài)。別構酶：具有別構現(xiàn)象的酶。別構劑：能使酶分子發(fā)生別構作用的物質。第52頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月別構酶ATCase（天冬氨酸轉氨甲酰酶）InactivetenseformATPCTPNucleicacidmetabolismFeedbackinhibitionCTPCTPCTPCTPCTPCTPCCCRRRRRRCCCCatalyticsubunitsCatalyticsubunitsRegulatorysubunitsQuaternarystructure+ActiverelaxedformATCase

COO-

CH2HN-C-COO-

H

H----OH2N-C-O-PO32-=天冬氨酸鹽氨基甲酰

磷酸鹽氨基甲酰天冬氨酸鹽OH2N-C-=

COO-

CH2N-C-COO-H

H-----CTP第53頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月ATCase分子構形改變影響活性TenseforminactivedRelaxedformactived第54頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月ATCase分子構形變化情形TenseformRelaxedform第55頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月●

Aspartate

transcarbamoylase:

(ATCase)→

其下游產物CTP

回饋抑制酶活性(-)→ATP會增加ATCase的活性(+)→

ATP與CTP競爭同一調節(jié)區(qū)(R)→

底物Asp的動力學作圖得S形曲線(sigmoidal)→

ATCase乃合作式協(xié)力現(xiàn)象cooperative→ATCase的分子構形有relax(active)

及tense◆S形曲線轉折點可看做酶對基質濃度的感應點(開關）別構酶的回饋控制可逆性非共價修飾Allostericenzyme:

酶的代謝物會影響該酶的活性第56頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月

S型曲線可以感受底物的濃度SigmoidalcurveExaggerationofsigmoidalcurveyieldsadrasticzigzaglinethatshowstheOn/OffpointclearlyPositiveeffector(ATP)bringssigmoidalcurvebacktohyperbolicNegativeeffector(CTP)keepsConsequently,AllostericenzymecansensetheconcentrationoftheenvironmentandadjustitsactivityNoncooperative(Hyperbolic)Cooperative(Sigmoidal)CTPATPvovo[Substrate]OffOn第57頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月[S]vo別構酶的作用模型實例AI[S]vo[S]vo(+)(-)XXXR=Relax(active)T=Tense(inactive)AllostericsiteHomotropic(+)ConcertedHeterotropic(+)SequentialHeterotropic(-)ConcertedAllostericsiteKineticsCooperationModels(-)(+)(+)第58頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月2.6、酶的穩(wěn)定性酶的穩(wěn)定性（enzymestabilization）是指酶蛋白抵抗各種不利因素的影響，維持一定的空間結構，保持其生物活性的能力。酶的穩(wěn)定性是基礎酶學與應用酶學重要的研究內容。酶的穩(wěn)定性除受分子組成和結構的影響外，還與其所處的微環(huán)境有關。通常酶處于天然細胞或體液環(huán)境中較為穩(wěn)定，但酶工程主要研究體外操作環(huán)境，如溫度、極端pH、氧化劑及變性劑等的影響。第59頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月影