基因工程藥物的分離純化技術(shù)

1ppt課件基因工程藥物的特點(diǎn)目的產(chǎn)物在初始物料中含量低含目的產(chǎn)物的初始物料組成復(fù)雜目的產(chǎn)物的穩(wěn)定性差種類繁多（多糖、多肽、蛋白質(zhì)、抗體、疫苗等）應(yīng)用面廣，對(duì)其質(zhì)量、純度要求高，甚至要求無菌、無熱源等2ppt課件下游技術(shù)指從發(fā)酵液中分離和純化產(chǎn)品的技術(shù)過程，包括固液分離技術(shù)（離心、過濾、沉淀等）、細(xì)胞破壁技術(shù)（超聲、高壓剪切、滲透壓、表面活性劑和溶壁酶等）、蛋白質(zhì)純化技術(shù)（沉淀法、色譜分離法和超濾法等），最后還有產(chǎn)品的包裝處理技術(shù)（真空干燥、冰凍干燥等），是運(yùn)用生物化學(xué)、物理學(xué)方法分離、純化產(chǎn)品，最終將產(chǎn)品推向市場(chǎng)并獲得社會(huì)或經(jīng)濟(jì)效益的過程。3ppt課件基因工程產(chǎn)業(yè)化除上游構(gòu)建工程菌之外,下游必須建立生產(chǎn)規(guī)模的發(fā)酵工藝、離心、細(xì)胞破碎、目的產(chǎn)物的分離、純化、恢復(fù)表達(dá)產(chǎn)物的天然結(jié)構(gòu)使之具有生物活性、表達(dá)產(chǎn)物的修飾加工等。就基因工程產(chǎn)業(yè)化而言,下游技術(shù)的研究與建立是十分重要的,又是十分耗時(shí)的,需要遠(yuǎn)比上游研究多得多的投資。4ppt課件（一）、建立工藝需了解各種因素含目的產(chǎn)物的初始物料的特點(diǎn)物料中雜質(zhì)種類和性質(zhì)目的產(chǎn)物特性產(chǎn)品質(zhì)量要求5ppt課件與傳統(tǒng)方式相似,重組蛋白的分離純化也是利用其物理和化學(xué)性質(zhì)的差異,在進(jìn)行任何一種蛋白質(zhì)純化工藝設(shè)計(jì)之前,都需要盡可能多地先對(duì)提純的體系,目標(biāo)蛋白和雜質(zhì)的性質(zhì)進(jìn)行了解。如目標(biāo)蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、疏水性、帶電性、碳?xì)滏溁蜃杂蓭€基存在情況等。另外還需對(duì)影響目標(biāo)蛋白活性的因素有了解,如溫度、ｐH、有機(jī)溶劑、蛋白變性劑、重金屬離子、機(jī)械剪切力等,以保證純化后的蛋白活性。當(dāng)前蛋白質(zhì)的純化主要是依靠色譜（層析技術(shù)）和電泳技術(shù)。由于重組蛋白在組織和細(xì)胞中仍以復(fù)雜混合物的形式存在,因此到目前為止還沒有一個(gè)單獨(dú)或一整套現(xiàn)成的方法把任何一種蛋白質(zhì)從復(fù)雜的混合物中分離出來,而只能依據(jù)目標(biāo)蛋白的物理化學(xué)性質(zhì)摸索和選擇一套綜合上述方法的適當(dāng)分離程序,以獲得較高純度的制品。6ppt課件（二）、分離純化的基本過程細(xì)胞破碎固液分離濃縮與初步純化高度純化直至得到純品成品加工7ppt課件（三）、細(xì)胞的破碎方法物理破碎法：高壓勻漿法、高速珠磨法、超聲破碎法、高壓擠壓法化學(xué)破碎法：滲透沖擊、增溶法、脂溶法生物破碎法：酶溶法8ppt課件（四）、固液分離沉淀：鹽沉淀、有機(jī)溶劑沉淀、等電點(diǎn)沉淀、熱變性沉淀離心：高速離心和超速離心膜過濾：微濾、超濾和反滲透雙水相萃取

9ppt課件（五）、重組蛋白質(zhì)的分離純化分離純化主要依賴色譜層析分離方法。分為離子交換色譜、疏水色譜、反相色譜、親和色譜、凝膠過濾色譜及高壓液相色譜等色譜技術(shù)是醫(yī)藥生物技術(shù)下游過程精制階段的常用手段，其優(yōu)點(diǎn)是該法具有多種多樣的分離機(jī)制、設(shè)備簡(jiǎn)單、便于自動(dòng)化控制和分離過程中無發(fā)熱等有害效應(yīng)10ppt課件2011-10-3011基因工程下游技術(shù)11ppt課件離子交換層析離子交換層析(ionexchangechromatography，IEC）是以蛋白質(zhì)分子凈電荷和表面電荷分布為分離基礎(chǔ)的。具體就是利用蛋白質(zhì)帶電性的差異,在離子吸附劑上靜電吸附能力不同,用不同的pH/離子強(qiáng)度洗脫液洗脫,從而使蛋白質(zhì)分離的柱層析方法。12ppt課件離子交換色譜分辨率高、容量大、操作容易，為多肽、蛋白質(zhì)、核酸和許多發(fā)酵產(chǎn)物分離純化的一種重要方法離子交換又分為：陽離子交換劑和陰離子13ppt課件疏水層析疏水層析(hydrophobicinteractionchromatography，HIC）是利用蛋白質(zhì)表面的疏水區(qū)域與固定相上疏水性基團(tuán)相互作用力的差異，對(duì)蛋白質(zhì)組分進(jìn)行分離的層析方法廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)類大分子的分離以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和折疊機(jī)制的研究等14ppt課件在高鹽濃度時(shí)，蛋白質(zhì)與固定相疏水締合；鹽濃度降低時(shí)蛋白質(zhì)疏水作用減弱，目的蛋白質(zhì)被逐步洗脫下來疏水色譜回收率較高，蛋白質(zhì)與固定相的疏水作用力較弱，蛋白質(zhì)變性的可能性小，蛋白質(zhì)活性在層析分離過程中不易喪失15ppt課件親和層析親和層析(affinitychromatography，AC）是利用固定化配體與目的蛋白質(zhì)之間非常特異的生物親和力進(jìn)行吸附，這種結(jié)合既是特異的，又是可逆的，改變條件可以使這種結(jié)合解除16ppt課件親和色譜是分離純化蛋白質(zhì)、酶等生物大分子最為特異而有效的層析技術(shù)，分離過程簡(jiǎn)單、快速，具有很高的分辨率，在生物分離中有廣泛的應(yīng)用。同時(shí)也可用于某些生物大分子結(jié)構(gòu)和功能的研究17ppt課件凝膠過濾層析凝膠過濾層析(gelfiltrationchromatography）又稱為凝膠排阻層析、分子篩層析，是以多孔性凝膠填料為固定相，按分子大小對(duì)溶液中各組分進(jìn)行分離的液相層析方法。填料有一定大小范圍的孔徑，大分子進(jìn)不去先洗脫，小分子進(jìn)入孔徑而后被阻滯，不同的蛋白質(zhì)根據(jù)它們大小和形狀的不同在層析柱中被分離18ppt課件優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、樣品回收率高、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好、不改變樣品生物學(xué)活性等缺點(diǎn)：分辨率較低，尤其是相對(duì)分子質(zhì)量相近的分子之間19ppt課件廣泛用于蛋白質(zhì)(酶）、核酸、多糖等生物大分子的分離純化用于蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定、脫鹽、樣品濃縮等20ppt課件（六）、非蛋白質(zhì)類雜質(zhì)的去除DNA的去除：離子交換層析、親和層析、疏水層析熱原質(zhì)的去除：最好的方法是防止產(chǎn)生熱原質(zhì)，陰離子交換層析法，疏水層析法，親和層析法（多黏菌素B）病毒的去除：色譜分離、紫外線照射和過濾21ppt課件根據(jù)產(chǎn)物表達(dá)形式來選擇根據(jù)分離單元之間的銜接選擇根據(jù)分離純化工藝的要求來選擇（七）、選擇分離純化方法的依據(jù)22ppt課件7.1根據(jù)產(chǎn)物表達(dá)形式來選擇分泌型表達(dá)產(chǎn)物：濃縮處理（沉淀和超濾）可溶性表達(dá)產(chǎn)物：親和層析，離子交換周質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物：低濃度溶菌酶處理后，采用滲透壓休克的方法23ppt課件包涵體：對(duì)蛋白質(zhì)分離純化有兩方面的影響，一是它可以很容易地與胞內(nèi)可溶性蛋白雜質(zhì)分離，蛋白純化較容易完成；另一方面產(chǎn)物經(jīng)過了一個(gè)變性復(fù)性過程，較易形成產(chǎn)物的錯(cuò)誤折疊和聚合體

24ppt課件選擇不同機(jī)制的分離單元組成一套分離純化工藝，盡早采用高效分離手段，將含量最多的雜質(zhì)先分離去除，將最昂貴、最費(fèi)時(shí)的分離單元放在最后階段7.2根據(jù)分離單元之間的銜接選擇25ppt課件先運(yùn)用非特異、低分辨的操作單元，如沉淀、超濾和吸附等，盡快縮小樣品體積，提高產(chǎn)物濃度，去除最主要的雜質(zhì)隨后采用高分辨率的操作單元，如離子交換色譜和親和色譜最后選用分離規(guī)模小、分離速度慢的操作單元如凝膠排阻色譜，可以提高分離效果26ppt課件色譜分離次序的選擇經(jīng)鹽析得到的液體不適宜于離子交換層析，可直接應(yīng)用疏水層析離子交換色譜之后進(jìn)行疏水層析比較合適親和層析多放在第二步以后凝膠過濾色譜放在最后一步27ppt課件要具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性要盡可能減少組成工藝的步驟組成工藝的各技術(shù)或步驟之間要能相互適應(yīng)和協(xié)調(diào)，工藝與設(shè)備也能相互適應(yīng)，從而減少步驟之間對(duì)物料的處理和條件調(diào)整7.3根據(jù)分離純化工藝的要求來選擇

28ppt課件在工藝過程中要盡可能少用試劑，以免增加分離純化步驟，或干擾產(chǎn)品質(zhì)量工藝時(shí)間要盡可能短（生物活性收率會(huì)降低）工藝和技術(shù)必須高效，收率高，易操作，對(duì)設(shè)備要求低，能耗低具有較高的安全性29ppt課件（八）、產(chǎn)品的保存目的產(chǎn)物失活受多種理化因素的影響，保存時(shí)要根據(jù)其不同特性，采取不同的措施，防止變性、降解，保護(hù)其活性液態(tài)保存和固態(tài)保存30ppt課件液態(tài)保存低溫保存：液態(tài)蛋白質(zhì)樣品在-20--10℃以下冷凍保存在穩(wěn)定pH條件下保存：蛋白質(zhì)較穩(wěn)定的pH一般在等電點(diǎn)附近高濃度保存加保護(hù)劑保存：糖類、脂肪類、蛋白質(zhì)類、多元醇及有機(jī)溶劑等31ppt課件固態(tài)保存固態(tài)蛋白質(zhì)比液態(tài)穩(wěn)定，一般蛋白質(zhì)含水