嘌呤霉素（Puromycin）篩選穩(wěn)定細(xì)胞株的步驟及方法Puromycin是來源于Streptomycesalboniger的一種氨基核苷類抗生素，中文名為嘌吟霉素，常用于篩選能夠表達(dá)pac基因（puror）的細(xì)胞。pac基因表達(dá)嘌吟霉素N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（PuromycinN-acetyl-tranferase），如果該基因表達(dá)，就會(huì)對(duì)嘌吟霉素產(chǎn)生抗性，這一特性目前普遍應(yīng)用于篩選表達(dá)pac基因的哺乳動(dòng)物穩(wěn)定細(xì)胞株。目前，很多商業(yè)化的慢病毒載體都攜帶pac基因（一般在質(zhì)粒圖譜上標(biāo)記為puror），可以利用嘌吟霉素的篩選，得到特定基因穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株。嘌吟霉素也可以用來篩選表達(dá)pac基因的大腸桿菌菌株、酵母菌株等。Puromycin不僅能用于穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選，也用于穩(wěn)定細(xì)胞株的維持。Puromycin的作用特點(diǎn)是快速作用于細(xì)胞，一般2天內(nèi)可以殺死99%的不表達(dá)pac基因的細(xì)胞。本產(chǎn)品濃度為10mg/ml，已過濾除菌，可以直接用于細(xì)胞培養(yǎng)。使用說明：一、 推薦工作濃度：推薦的作用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的嘌吟霉素濃度一般為1-10四/ml,但最佳工作濃度需要通過劑量反應(yīng)曲線來確定。二、 嘌吟霉素劑量反應(yīng)曲線的確定（以shRNA）轉(zhuǎn)染或者慢病毒感染為例）：:嘌吟霉素的有效篩選濃度與細(xì)胞類型、生長(zhǎng)狀態(tài)、細(xì)胞密度、細(xì)胞代謝及細(xì)胞所處細(xì)胞周期等因素相關(guān)。為了篩選到穩(wěn)定表達(dá)的shRNA或感染病毒的細(xì)胞株，確定殺死未轉(zhuǎn)染/感染細(xì)胞的最低濃度嘌吟霉素非常重要。對(duì)于初次使用的細(xì)胞，一般需要通過實(shí)驗(yàn)來確定適合自身實(shí)驗(yàn)體系的劑量反應(yīng)曲線(dose-responsecurveorkillcurve)。1、 第一天：24孑L板中以5-8x104cells/孔的密度接種細(xì)胞，接種夠量的孔以便進(jìn)行后續(xù)的劑量梯度實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜。2、 第二天：在培養(yǎng)過夜后的細(xì)胞中更換新鮮配制的篩選培養(yǎng)基，該篩選培養(yǎng)基為含不同濃度嘌吟霉素的新鮮培養(yǎng)基(如0、1、2.5、5、7.5、10pg/ml等)，更換培養(yǎng)基后在細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。3、 第三天后：由于嘌吟霉素可以快速作用于細(xì)胞，一般2天內(nèi)可以殺死99%的未表達(dá)pac基因的細(xì)胞，所以在加嘌吟霉素后的1-2天就可以進(jìn)行觀察細(xì)胞存活率，從而確定有效殺死正常細(xì)胞的藥物最低濃度。如果細(xì)胞耐藥性比較強(qiáng)，需要每日觀察，一般4-1。天內(nèi)即可確定嘌吟霉素的最低濃度。三、哺乳動(dòng)物穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的篩選：轉(zhuǎn)染含有pac基因的質(zhì)粒或者感染含有該基因的病毒后，即可篩選穩(wěn)定表達(dá)株。1、細(xì)胞轉(zhuǎn)染或感染48小時(shí)后，將細(xì)胞置于含有適當(dāng)濃度嘌吟霉素的新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)，此為處理組。注意:當(dāng)細(xì)胞處于分裂活躍期時(shí)，抗生素作用最明顯。細(xì)胞過于密集，抗生素產(chǎn)生的效力會(huì)明顯下降，所以細(xì)胞的過密度最好不超過25%。建議同時(shí)做一個(gè)正常細(xì)胞的對(duì)照組。轉(zhuǎn)染或感染48小時(shí)后，如果細(xì)胞過密也可以消化后重新接種細(xì)胞，培養(yǎng)過夜后即可進(jìn)行嘌吟霉素篩選。2、 每隔2-3天，更換含有嘌吟霉素的培養(yǎng)基。3、 篩選7天后，對(duì)照組正常細(xì)胞應(yīng)該100%死亡，處理組中存活的細(xì)胞為表達(dá)pac基因的細(xì)胞。然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行多克隆或單克隆細(xì)胞的篩選。要注意：每日進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的觀察。嘌吟霉素的篩選至少需要24小時(shí)，有效濃度嘌吟霉素的篩選周期一般在2-10天。4、 待細(xì)胞可以