枯草芽胞桿菌bacillussubilisbsd-2中ybfb基因敲除及抗真菌活性恢復(fù)

植物病害一直是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的一個(gè)重要問(wèn)題。其中，灰葡萄菌是一種氣傳植物的致病性真菌。導(dǎo)致的灰霉菌有200多種作物，包括蔬菜和水果（如茄子、黃瓜、茄子和草莓）等。這是給收錢和造成巨大經(jīng)濟(jì)損失的常見疾?。╰enheret等人，1998；sgon等人，2007）。隨著人們對(duì)自身健康及環(huán)境保護(hù)等方面的逐漸重視,化學(xué)殺真菌劑的使用越來(lái)越受到限制(Huaetal.,2008)。生物防治逐漸成為人們的研究熱點(diǎn),其中芽胞桿菌因其可產(chǎn)生芽胞,抗逆性強(qiáng),產(chǎn)品耐儲(chǔ)存等優(yōu)點(diǎn)從而得到廣泛關(guān)注?？莶菅堪麠U菌(Bacillussubtilis)是目前研究最多應(yīng)用最廣泛的生防菌,它能分泌多種抗菌肽,包括iturin、fengycin、surfactin等(Stein,2005),對(duì)多種致病真菌均顯示出很強(qiáng)的抗真菌活性。Surfactin是一種生物表面活性劑,具有抗菌和抗病毒的能力,與iturinA或fengycin聯(lián)合應(yīng)用表現(xiàn)出很強(qiáng)的協(xié)同作用(Maget-Danaetal.,1992;Romeroetal.,2007)。fengycin對(duì)絲狀真菌表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗真菌活性(Vanittanakometal.,1986;Stein,2005)。除了其直接的抗微生物活性,surfactin和fengycin已被確定可以作為細(xì)菌誘導(dǎo)子誘導(dǎo)宿主植物增強(qiáng)抗性(Ongenaetal.,2007)。目前人們對(duì)枯草芽胞桿菌的研究主要集中在其代謝產(chǎn)物及作用機(jī)制方面,對(duì)其抑菌分子機(jī)制及抑菌相關(guān)基因克隆和功能分析等研究較少。B.subtilisBSD-2是本實(shí)驗(yàn)室分離得到的一株拮抗菌(胡瑞萍等,2011),該菌株可以產(chǎn)生surfactin等多種抗菌物質(zhì),其抑菌譜廣,對(duì)蔬菜灰霉病防治效果顯著,前期通過(guò)構(gòu)建突變體庫(kù)的方法,發(fā)現(xiàn)ybfB基因可能與其抗真菌活性相關(guān)。為進(jìn)一步研究該基因?qū)莶菅堪麠U菌生物活性的影響,本研究采用同源重組法敲除其ybfB基因,對(duì)突變體進(jìn)行抑菌活性測(cè)定,并采用生物信息學(xué)方法對(duì)其編碼蛋白質(zhì)序列進(jìn)行理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)域、二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè),為進(jìn)一步研究其具體功能提供基礎(chǔ)。1結(jié)果與分析1.1ybfb基因及kana抗性基因的擴(kuò)增以枯草芽胞桿菌BSD-2菌株基因組為模板,用ybfB-5、ybfB-3引物PCR擴(kuò)增出ybfB基因,以提取的質(zhì)粒pEASY-T1為模板用kana-5、kana-3引物擴(kuò)增出kana抗性基因,分別將所得兩基因克隆到pTG19-T載體,構(gòu)建pTG19-ybfB和pTG19-kana重組載體,進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證,并進(jìn)行了序列測(cè)定(圖1)。1.2pb-ybfb重組質(zhì)粒的構(gòu)建將pTG19-ybfB重組質(zhì)粒和質(zhì)粒pBluSKM,經(jīng)KpnⅠ和SacⅠ雙酶切,凝膠回收后,用T4連接酶進(jìn)行連接,構(gòu)建pB-ybfB重組質(zhì)粒;提取pTG19-kana重組質(zhì)粒與pB-ybfB重組質(zhì)粒,分別用MunⅠ進(jìn)行單酶切(圖2),回收kana片段和pB-ybfB大片段,用T4連接酶進(jìn)行連接后,轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α,用卡那抗性平板篩選陽(yáng)性菌進(jìn)行PCR并測(cè)序(圖3),構(gòu)建pB-Y-k重組質(zhì)粒。1.3枯草芽胞桿菌ybfb基因缺失菌株的構(gòu)建利用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法將pB-Y-k轉(zhuǎn)入枯草芽胞桿菌BSD-2菌株,利用同源重組法敲除枯草芽胞桿菌ybfB基因,構(gòu)建B-Y-k突變子。kana抗性平板篩選陽(yáng)性重組子,菌落PCR擴(kuò)增重組后ybfB基因長(zhǎng)度約為2000bp(圖3)。1.4b-y-k菌株的抗菌活性檢測(cè)以灰葡萄孢霉為指示菌,采用平板對(duì)峙法對(duì)野生BSD-2菌株和突變株B-Y-k進(jìn)行抑菌活性的測(cè)定(圖4)。突變株B-Y-k無(wú)抑菌活性。1.5回復(fù)突變株的構(gòu)建將構(gòu)建的pB-Y重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入B-Y-k突變株中,從無(wú)抗性平板上挑選菌落進(jìn)行菌落PCR,篩選回復(fù)突變株B-Y,擴(kuò)增其ybfB基因,目的片段大小應(yīng)為1251bp(圖5)。利用平板對(duì)峙法對(duì)B-Y菌株進(jìn)行抑菌活性測(cè)定(圖6),回復(fù)突變株抑菌活性得到恢復(fù)。1.6ybfb基因及序列生物信息分析1.6.1開放閱讀框式將克隆得到的ybfB基因進(jìn)行序列測(cè)定,用ORFFinder軟件進(jìn)行開放閱讀框分析(高娃等,2015),獲得一條完整的1251bp的開放閱讀框,其中包含起始密碼子和終止密碼子(圖7)。該基因經(jīng)BLAST比對(duì),與其它枯草芽胞桿菌的序列同源性在92%~100%之間,與BacillussubtilisHJ5(CP007173.1)、BacillussubtilisXF-1(CP004019.1)ybfB基因序列相似性為100%(圖8)。1.6.2fb基因編碼蛋白氨基酸組成及理化性質(zhì)分析利用ProtParam(Gasteigeretal.,2003;韓麗珍等,2014)預(yù)測(cè)ybfB基因編碼的蛋白氨基酸組成及理化性質(zhì),結(jié)果顯示該基因編碼氨基酸數(shù)為416個(gè),分子式為C為進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)果,用ProtScale(KyteandDoolittle,1982)再次對(duì)蛋白質(zhì)親疏水性進(jìn)行分析(圖9),結(jié)果顯示基線上部曲線明顯多于基線下部曲線,表明大部分氨基酸表現(xiàn)為疏水性,該蛋白為疏水性蛋白。1.6.3跨膜蛋白ldf通過(guò)TMHMMServerv.2.0(Ikedetal.,2002)預(yù)測(cè)ybfB基因編碼蛋白發(fā)現(xiàn)該蛋白存在12個(gè)跨膜螺旋區(qū)(圖10),推測(cè)該蛋白為疏水性跨膜蛋白,用于物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)。SignalP4.1預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),該蛋白不存在信號(hào)肽序列,這與跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致,表明該蛋白為一疏水性跨膜蛋白。用SMART(Schultzetal.,1998)進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè),ybfB基因編碼蛋白第10~276個(gè)氨基酸為MFS-1結(jié)構(gòu)域(圖11),該蛋白為細(xì)胞膜組成成分,負(fù)責(zé)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),屬易化子家族。1.6.4ybfb基因編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)利用蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件PSIPRED進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè),結(jié)果顯示,ybfB基因編碼的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)以α螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲為主(圖12)。用SWISS-MODEL軟件以1pw4.1.A蛋白為模板,對(duì)其三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)(圖13)。2枯草芽胞桿菌ybfb基因編碼及代謝產(chǎn)物的表達(dá)枯草芽孢桿菌是抑制植物病原菌的重要生防制劑之一,其已顯示在菌絲生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)和減速番茄灰霉病發(fā)生等方面有很強(qiáng)拮抗作用(Walkeretal.,1998;Touréetal.,2004;Cawoyetal.,2015)。本研究以枯草芽胞桿菌BSD-2菌株為目標(biāo)菌株,采用同源雙交換突變技術(shù)對(duì)其ybfB基因進(jìn)行突變,構(gòu)建ybfB基因缺失菌株B-Y-k,采用平板對(duì)峙法測(cè)定其抑菌活性,結(jié)果顯示該突變株抗真菌活性缺失,通過(guò)回復(fù)突變得到菌株B-Y,對(duì)該菌株抑菌活性進(jìn)行測(cè)定,其抗真菌活性恢復(fù)到野生型水平,推測(cè)ybfB可能是枯草芽胞桿菌抗真菌活性中重要的調(diào)控基因。因此,利用生物信息學(xué)軟件對(duì)ybfB基因及編碼蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)分析,為下一步改造該基因提供參考。本研究從枯草芽胞桿菌BSD-2菌株中克隆到y(tǒng)bfB基因,序列分析顯示該基因全長(zhǎng)1251bp,編碼416個(gè)氨基酸,具有12個(gè)跨膜螺旋區(qū),蛋白疏水性分析顯示其為疏水性,推測(cè)該蛋白為一疏水性跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)顯示ybfB基因編碼蛋白第10~276個(gè)氨基酸為MFS-1結(jié)構(gòu)域。MFS超家族蛋白(majorfacilitatorsuperfamily)和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP-bindingcassettetransporter)是目前已知的在整個(gè)生物界廣泛存在的兩個(gè)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(DeanandAllikmets,1995;GoswitzandBrooker,1995),其中MFS超家族蛋白中有16個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)已經(jīng)得到解析,MFS超家族蛋白大多數(shù)具有400~600個(gè)氨基酸殘基,N端、C端均位于胞內(nèi),二級(jí)結(jié)構(gòu)大多具有12個(gè)跨膜螺旋區(qū)(鄧東和顏寧,2015)。該家族蛋白通過(guò)不同的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制可以轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸、糖類、多肽、藥物分子等多種小分子,研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的氨基酸Asp、Glu及Arg可能與其轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制相關(guān)(Yenetal.,2010)?？莶菅堪麠U菌BSD-2菌株中ybfB基因編碼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與已報(bào)道的MFS超家族蛋白結(jié)構(gòu)類似,且該基因缺失菌株失去其抗真菌活性,推測(cè)該基因參與枯草芽胞桿菌活性物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)?？莶菅堪麠U菌surfactin生物合成的過(guò)程已十分明確,surfactin是由非核糖體多肽合成酶(NRPS)催化合成的,surfactin合成酶為一多酶復(fù)合物,含三個(gè)酶亞基,可以說(shuō)surfactin是以酶為模板來(lái)合成的,其相關(guān)的基因?yàn)榫幋a多功能酶的srfA操縱子(Nakanoetal.,1988)。之前對(duì)枯草芽胞桿菌代謝產(chǎn)物的研究主要集中在分離純化、特性研究及鑒定,目前已深入到遺傳代謝和對(duì)其進(jìn)行理性改造等方面(Heinzmannetal.,2006;Koumoutsietal.,2007)。已有研究表明,遺傳改良的方法可以使iturinA和Mycosubtilin的分泌量增加3倍和15倍(Tsugeetal.,2001)。對(duì)生防菌株進(jìn)行遺傳改良,利用分子生物學(xué)手段提高其抗真菌活性是未來(lái)主要的研究方向。本研究對(duì)篩選到的抑菌相關(guān)基因利用生物信息學(xué)手段進(jìn)行分析,為下一步對(duì)其相關(guān)基因進(jìn)行改造,從而達(dá)到提高其抗真菌活性的目的提供了一定的基礎(chǔ)。3材料和方法3.1試劑和試劑盒本研究所用菌株B.subtilisBSD-2、E.coliDH5α以及所用質(zhì)粒pBluSKM、pEASY-T1和pTG19-T,均為本實(shí)驗(yàn)室保存。限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、感受態(tài)DH5α、DNA凝膠回收試劑盒均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;枯草芽胞桿菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司,大腸桿菌質(zhì)粒提取采用上海生工生物工程有限公司試劑盒,其它化學(xué)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純或進(jìn)口分裝。3.2引用產(chǎn)品所用引物序列及設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)列于表2。引物合成、基因測(cè)序由蘇州金唯智生物科技有限公司(北京)完成。3.3測(cè)試方法3.3.1ptg19-ybfb基因回復(fù)突變體的構(gòu)建根據(jù)GenBank提供的其它枯草芽胞桿菌ybfB基因及上下游序列設(shè)計(jì)2對(duì)寡核苷酸引物ybfB-5和ybfB-3。引物上分別添加KpnⅠ和SacⅠ酶切位點(diǎn)(下劃線所示)。以提取的枯草芽胞桿菌BSD-2菌株基因組DNA為模板,PCR擴(kuò)增ybfB基因,將其與pTG19-T載體進(jìn)行TA連接,轉(zhuǎn)化DH5α,藍(lán)白斑篩選選擇陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌落PCR,并測(cè)序驗(yàn)證,構(gòu)建pTG19-ybfB重組質(zhì)粒。PCR引物列于表2。ybfB基因PCR擴(kuò)增條件:94℃,5min;94℃,45s;60℃,45s;72℃,50s;30個(gè)循環(huán);72℃延伸10min。根據(jù)質(zhì)粒pEASY-T1上的kana抗性基因序列設(shè)計(jì)寡核苷酸引物kana-5和kana-3并在兩端加上MunⅠ酶切位點(diǎn)(下劃線所示)以提取的質(zhì)粒pEASYT1為模板,擴(kuò)增kana抗性基因,將擴(kuò)增片段與pTG19-T載體進(jìn)行TA連接,轉(zhuǎn)化DH5α,藍(lán)白斑篩選選擇陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證,構(gòu)建pTG19-kana重組質(zhì)粒。PCR擴(kuò)增條件:94℃,5min;94℃,30s;58℃,45s;72℃,50s;30個(gè)循環(huán);72℃延伸10min。大腸桿菌的轉(zhuǎn)化采用化學(xué)轉(zhuǎn)化法。3.3.2重組質(zhì)粒的構(gòu)建提取pTG19-ybfB重組質(zhì)粒和質(zhì)粒pBluSKM,分別用KpnⅠ和SacⅠ酶切,回收ybfB基因片段和質(zhì)粒pBluSKM大片段,用T4連接酶進(jìn)行連接,構(gòu)建pB-ybfB重組質(zhì)粒;提取pTG19-kana重組質(zhì)粒與pB-ybfB重組質(zhì)粒,分別用MunⅠ進(jìn)行酶切,回收kana片段和pB-ybfB大片段,用T4連接酶進(jìn)行連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α,用卡那抗性平板篩選陽(yáng)性菌進(jìn)行測(cè)序,構(gòu)建pB-Y-kana重組質(zhì)粒。酶切體系:限制性內(nèi)切酶,1μL;10×Buffer,1μL;DNA,≤1μg;ddH3.3.3ybfb基因缺失菌株構(gòu)建提取pB-Y-kana重組質(zhì)粒,制備枯草芽胞桿菌感受態(tài)細(xì)胞,利用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化枯草芽胞桿菌,采用同源重組法(王金星等,2014)構(gòu)建ybfB基因缺失菌株(ChangandCohen,1979)。挑取卡那抗性平板上的枯草芽孢桿菌初篩轉(zhuǎn)化子,用引物ybfB-5、ybfB-3進(jìn)行菌落PCR,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測(cè)序及序列比對(duì)構(gòu)建突變株B-Y-k。3.3.4b-y-k菌株的抗菌活性檢測(cè)以可以引起灰霉病的灰葡萄孢菌為指示菌,利用平板對(duì)峙法分別對(duì)構(gòu)建的B-Y-k菌株和野生菌株進(jìn)行抑菌活性測(cè)定。3.3.5回復(fù)突變株的構(gòu)建將3.3.2中構(gòu)建的pB-ybfB質(zhì)粒轉(zhuǎn)