誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞.09.02誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞專家講座第1頁主要內(nèi)容什么是誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞？獲取誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞基本原理誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)與判定誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞技術(shù)研究進(jìn)展誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞優(yōu)缺點誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞發(fā)展歷程與應(yīng)用前景誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞專家講座第2頁干細(xì)胞含有沒有限制自我更新能力、同時也可分化成特定組織細(xì)胞，在細(xì)胞發(fā)育過程中處于較原始階段。包含：胚胎干細(xì)胞成體干細(xì)胞：上皮干細(xì)胞造血干細(xì)胞神經(jīng)干細(xì)胞肌肉干細(xì)胞誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞專家講座第3頁人體胚胎干(hES)細(xì)胞優(yōu)點：有潛力在體內(nèi)發(fā)育成任何細(xì)胞類型缺點：(l)供體卵母細(xì)胞起源困難,ES細(xì)胞建系效率低

(2)免疫排斥反應(yīng)(3)ES細(xì)胞含有成瘤性(4)體外保持ES細(xì)胞全能性條件非常復(fù)雜(5)倫理學(xué)爭論胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）起源于哺乳動物胚胎發(fā)育早期胚泡期內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，是最原始干細(xì)胞誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞專家講座第4頁

成體干細(xì)胞成體干細(xì)胞是指存在于一個已經(jīng)分化組織中未分化細(xì)胞，這種細(xì)胞能夠自我更新而且能夠特化形成組成該類型組織細(xì)胞。成體干細(xì)胞存在于機(jī)體各種組織器官中。成年個體組織中成體干細(xì)胞在正常情況下大多處于休眠狀態(tài)，在病理狀態(tài)或在外因誘導(dǎo)下能夠表現(xiàn)出不一樣程度再生和更新能力。神經(jīng)干細(xì)胞造血干細(xì)胞間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)皮干細(xì)胞……誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞專家講座第5頁iPS經(jīng)過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)(genetransfection)將一些轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入動物或人體細(xì)胞,使體細(xì)胞直接重組成為胚胎干細(xì)胞（embryonicstemcell,ESC）細(xì)胞樣多潛能細(xì)胞。iPS細(xì)胞不但在細(xì)胞形態(tài)、生長特征、干細(xì)胞標(biāo)志物表示等方面與ES細(xì)胞非常相同,而且在DNA甲基化方式、基因表示譜、染色質(zhì)狀態(tài)、形成嵌合體動物等方面也與ES細(xì)胞幾乎完全相同。誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞專家講座第6頁獲取IPS細(xì)胞基本原理ES細(xì)胞和IPS細(xì)胞含有相同基因。ES細(xì)胞中與細(xì)胞多能性相關(guān)基因能夠表示，如：oct4，Sox2等。而已分化體細(xì)胞中這些基因不能表示。經(jīng)過導(dǎo)入與多能性相關(guān)外源基因來激活體細(xì)胞中多能性基因，從而使體細(xì)胞從分化狀態(tài)重編程為多能性干細(xì)胞。誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞專家講座第7頁iPS發(fā)展歷程年日本京都大學(xué)山中伸彌ShinyaYamanaka領(lǐng)導(dǎo)試驗室在世界著名學(xué)術(shù)雜志《細(xì)胞》上率先報道了iPS研究。他們把Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4這4種轉(zhuǎn)錄因子引入小鼠胚胎或皮膚纖維母細(xì)胞，發(fā)覺可誘導(dǎo)其發(fā)生轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生iPS細(xì)胞在形態(tài)、基因和蛋白表示、表觀遺傳修飾狀態(tài)、細(xì)胞倍增能力、類胚體和畸形瘤生成能力、分化能力等都與胚胎干細(xì)胞極為相同。誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞專家講座第8頁年末，Thompson試驗室和山中伸彌試驗室?guī)缀跬瑫r報道，利用iPS技術(shù)一樣能夠誘導(dǎo)人皮膚纖維母細(xì)胞成為幾乎與胚胎干細(xì)胞完全一樣多能干細(xì)胞。所不一樣是日本試驗室依然采取了用逆轉(zhuǎn)錄病毒引入Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf44種因子組合，而Thompson試驗室則采取了以慢病毒載體引入OCT4、SOX2加NANOG和LIN28這種因子組合。這些研究結(jié)果被美國《科學(xué)》雜志列為年十大科技突破中第1位。誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞專家講座第9頁年，哈佛大學(xué)GeorgeDaley試驗室利用誘導(dǎo)細(xì)胞重新編程技術(shù)把采自10種不一樣遺傳病患者病人皮膚細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)閕PS，這些細(xì)胞將會在建立疾病模型、藥品篩選等方面發(fā)揮主要作用。美國科學(xué)家還發(fā)覺，iPS可在適當(dāng)誘導(dǎo)條件下定向分化，如變成血細(xì)胞，再用于治療疾病。哈佛大學(xué)另一家試驗室則發(fā)覺利用病毒將3種在細(xì)胞發(fā)育過程中起主要作用轉(zhuǎn)錄因子引入小鼠胰腺外分泌細(xì)胞，能夠直接使其轉(zhuǎn)變成與干細(xì)胞極為相同細(xì)胞，而且能夠分泌胰島素、有效降低血糖。這表明利用誘導(dǎo)重新編程技術(shù)能夠直接取得某一特定組織細(xì)胞，而無須先經(jīng)過誘導(dǎo)多能干細(xì)胞這一步。誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞專家講座第10頁年，中國科學(xué)家于年11月利用iPS細(xì)胞培育出小鼠——“小小”中國科學(xué)院動物研究所周琪研究員和上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院曾凡一研究員領(lǐng)導(dǎo)研究組合作完成工作表明，利用iPS細(xì)胞能夠得到成活含有繁殖能力小鼠，從而在世界上第一次證實了iPS細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞含有相同多能性?？茖W(xué)家表示，這一研究結(jié)果表明iPS干細(xì)胞或許同胚胎干細(xì)胞一樣能夠作為治療各種疾病潛在起源。誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞專家講座第11頁國際學(xué)術(shù)權(quán)威雜志Science雜志登載了北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院鄧宏魁教授和趙揚博士率領(lǐng)研究團(tuán)體在生命科學(xué)領(lǐng)域一項革命性研究結(jié)果——用小分子化合物誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程為多潛能干細(xì)胞。該結(jié)果開辟了一條全新實現(xiàn)體細(xì)胞重編程路徑，給未來應(yīng)用再生醫(yī)學(xué)治療重大疾病帶來了新可能。在這項研究中，鄧宏魁團(tuán)體僅使用四個小分子化合物組合對體細(xì)胞進(jìn)行處理就能夠成功地逆轉(zhuǎn)其“發(fā)育時鐘”，實現(xiàn)體細(xì)胞“重編程”。使用這項技術(shù)，他們成功地將已經(jīng)特化小鼠成體細(xì)胞誘導(dǎo)成為了能夠重新分化發(fā)育為各種組織器官類型“多潛能性”細(xì)胞，并將其命名為“化學(xué)誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞（CiPS細(xì)胞）”。誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞專家講座第12頁

人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞建立-技術(shù)流程流程圖CellStemCell,誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞專家講座第13頁

人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞建立-克隆挑取一次性玻璃巴氏吸管，需制備圓口（切割，剝離）和斷口（吸收）兩種可挑克隆-有光滑邊緣，胚胎干細(xì)胞樣誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞專家講座第14頁

人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞判定?形態(tài)判別與AP染色?RealtimePCR檢測多能性基因表示水平。?免疫熒光判定胚胎標(biāo)志物表示?多能性基因（Nanog,Oct4）開啟子甲基化水平比較?基因芯片判定誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞在基因表示譜上相同程度?核型判定?擬胚體試驗驗證分化潛能?畸胎瘤試驗驗證分化潛能誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞專家講座第15頁

人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞判定-形態(tài)判別和AP染色扁平，較高核質(zhì)比AP染色呈陽性O(shè)nfeeder(100×)APstaining(40×)Matrigel(200×)誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞專家講座第16頁

qPCR檢測內(nèi)源多能性基因與轉(zhuǎn)基因表示水平誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞專家講座第17頁

多能性標(biāo)志物檢測誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞專家講座第18頁

甲基化水平檢測與核型判定誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞專家講座第19頁

擬胚體畸胎瘤形成試驗驗證分化潛能誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞專家講座第20頁iPS優(yōu)點與經(jīng)典胚胎干細(xì)胞技術(shù)和體細(xì)胞核移植技術(shù)不一樣，iPS技術(shù)不使用胚胎細(xì)胞或卵細(xì)胞，所以沒有倫理學(xué)問題。利用iPS技術(shù)能夠用病人自己體細(xì)胞制備專用干細(xì)胞，所以不會有免疫排斥問題。iPS缺點比如，添加4個“重新編程”基因或取代疾病細(xì)胞中有缺點基因方法都可能有造成癌癥副作用。誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞專家講座第21頁

誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞安全性-成瘤風(fēng)險不一樣起源和方法來iPSC神經(jīng)分化能力各不相同，都不如ESC分化效率。不一樣組織起源iPSC神經(jīng)分化效率不一樣，移植神經(jīng)球成瘤效率iPSC比ESC高。YamanakaS.NBTZhangS.C.PNAS誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞專家講座第22頁IPS細(xì)胞應(yīng)用前景用于器官移植建立疾病模型，了解發(fā)病機(jī)理治療一些遺傳病如：患有鐮刀型貧血癥小鼠皮膚成纖維細(xì)胞建立了IPSc，并將其移植到小鼠體內(nèi)，小鼠癥狀得以緩解。誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞專家講座第23頁試驗方案1.培養(yǎng)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞2.試驗分組：對照Fe3O4/AuRGD-Fe3O4/AuF3-Fe3O4/Au

每次用磁場處理30min，每隔4小時處理一次，共處理3天，在顯微鏡下實時觀察細(xì)胞形態(tài)改變。3.MTT檢測細(xì)胞數(shù)改變。（酶標(biāo)儀）4.流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。（流式細(xì)胞儀）5.搜集細(xì)