響應(yīng)面法優(yōu)化l-賴(lài)氨酸高產(chǎn)菌發(fā)酵培養(yǎng)基

-氨基丙烯酸或2-氨基丙烯酸的英典名稱(chēng)為c。L-賴(lài)氨酸是人體和動(dòng)物所不能合成的8種必需氨基酸中最重要的一種。賴(lài)氨酸是國(guó)際市場(chǎng)上發(fā)展前景良好的產(chǎn)品11.1材料表面1.1.1病毒作者實(shí)驗(yàn)保藏菌株黃色短桿菌(1.1.2產(chǎn)品的類(lèi)型L-賴(lài)氨酸、L-纈氨酸等為上海生化技術(shù)公司產(chǎn)品;NTG、SG均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品;DES為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品;茚三酮為上海試劑三廠(chǎng)產(chǎn)品。1.1.3培養(yǎng)基(1)基本培養(yǎng)基g.l葡萄糖20、(NH(2)完全培養(yǎng)基g.l葡萄糖5、牛肉膏10、蛋白胨10、NaCl5、瓊脂20。(3)種子培養(yǎng)部位g.l葡萄糖25、玉米漿25～30、(NH(4)調(diào)ph及滅菌葡萄糖150、玉米漿15、(NH基本、完全和種子培養(yǎng)基均用質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%NaOH調(diào)pH至7.0～7.2,121℃滅菌20min。發(fā)酵培養(yǎng)基用20%NaOH調(diào)pH至7.0～7.2,115℃滅菌8min。1.2方法1.2.1培訓(xùn)方法1.2.1.1.傾斜和平面培養(yǎng)方法恒溫箱溫度30±1℃,培養(yǎng)24h。1.2.1.種子培養(yǎng)和管理?yè)u床為往復(fù)搖床,振次100±2次/min,溫度30±1℃,種子裝液量250mL三角瓶30mL,種子培養(yǎng)12h;發(fā)酵裝液量500mL三角瓶25mL,發(fā)酵培養(yǎng)72h。1.2.2強(qiáng)制改變方法常規(guī)化學(xué)誘變法1.2.3過(guò)濾方法1.2.3.菌落生長(zhǎng)的方式纈氨酸缺陷型的獲得:把誘變的菌液涂在基本培養(yǎng)基上,31℃培養(yǎng)2～4d標(biāo)出生長(zhǎng)的菌落,再倒上一層含纈氨酸的基本培養(yǎng)基,再次生長(zhǎng)出來(lái)的菌落可能為纈氨酸缺陷型,挑出后長(zhǎng)出來(lái)的菌落,如果在基本培養(yǎng)基上不生長(zhǎng),而在含有纈氨酸的基本培養(yǎng)基上能生長(zhǎng)的為纈氨酸缺陷型?；前冯?SG)抗性的獲得:把誘變的菌液涂布在含有SG的基本培養(yǎng)基上,培養(yǎng)3～4d,挑出生長(zhǎng)的菌落,即為SG1.2.3.2.搖瓶篩選將平板篩選獲得的變異株接一環(huán)于裝有25mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角瓶中,振蕩培養(yǎng)72h,測(cè)定發(fā)酵液中的L-賴(lài)氨酸。1.2.4樣本抗氧化測(cè)定pH值:用精密pH試紙和酸度計(jì)測(cè)定。菌體生長(zhǎng):吸取樣品菌液0.2mL到0.25mol/LHCl5mL溶液中,搖勻后測(cè)定OD還原糖:菲林試劑滴定法L-賴(lài)氨酸:紙上層析法和酸性茚三酮法22.1高絲氨酸脫氫酶催化合成氨基酸由圖1可知,由葡萄糖生產(chǎn)賴(lài)氨酸的代謝途徑包括EMP途徑、TCA循環(huán)、乙醛酸循環(huán)、二氧化碳固定反應(yīng)、草酰乙酸氨基化反應(yīng)生成天冬氨酸、天冬氨酸在天冬氨酸激酶和天冬氨酸-β-半醛脫氫酶催化下生成環(huán)天冬氨酸-β-半醛,然后分成兩路,一方面在DDP合成酶等一系列酶催化下生成賴(lài)氨酸,另一方面在高絲氨酸脫氫酶催化下生成高絲氨酸,又分為兩路:一路在琥珀酰高絲氨酸合成酶等一系列酶催化下生成蛋氨酸,另一方面在高絲氨酸激酶等酶催化下生成蘇氨酸,蘇氨酸又在蘇氨酸脫氫酶等催化下生成異亮氨酸。增加前體物質(zhì)的合成、減弱或切斷支路代謝和促進(jìn)產(chǎn)物的分泌是提高賴(lài)氨酸產(chǎn)量的思路。丙酮酸是合成天冬氨酸的前提物質(zhì),在胞內(nèi)丙酮酸能生成纈氨酸,使用氨基酸分析儀測(cè)得纈氨酸占總氨基酸的10%,所以定向選育纈氨酸缺陷型,能很大程度上增加丙酮酸的量,從而增加了賴(lài)氨酸合成的前提物質(zhì);同樣在胞內(nèi)丙酮酸能生成乙酸和乙醇,因此添加乙酸和乙醇能會(huì)促進(jìn)丙酮酸含量的增加從而增加賴(lài)氨酸的積累;在發(fā)酵過(guò)程中添加吐溫-80和二甲基亞砜來(lái)改變細(xì)胞表面結(jié)構(gòu),使細(xì)胞轉(zhuǎn)向分泌型,以增加賴(lài)氨酸的積累;天冬氨酸合成過(guò)量,會(huì)反饋抑制PEP羧化酶的活性,因此選育天冬氨酸結(jié)構(gòu)類(lèi)似物抗性突變株能防止PEP羧化酶活性的減弱,從而提高糖質(zhì)生產(chǎn)賴(lài)氨酸的轉(zhuǎn)化率。2.2高羊茅的選擇2.2.1高羊茅的選擇黃色短桿菌XQ-8經(jīng)DES誘變、NTG誘變,依次被賦予磺胺胍抗性、纈氨酸缺陷型(SG2.2.2產(chǎn)l-賴(lài)氨酸穩(wěn)定性將目的突變株XQ-89在斜面上連續(xù)接種5代,搖瓶發(fā)酵考察其產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的穩(wěn)定性,結(jié)果見(jiàn)表1。從表1結(jié)果可知,目的菌株XQ-89通過(guò)連續(xù)傳代5次,菌株的遺傳標(biāo)記和產(chǎn)酸率穩(wěn)定,表明其遺傳性狀穩(wěn)定,可用于進(jìn)一步研究。2.3增加乙酰coa的量,增加天冬氨酸的合成天冬氨酸與乙酰CoA形成平衡合成,增強(qiáng)乙酰CoA的量,加強(qiáng)天冬氨酸的合成,在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加乙酸、乙醇,可使乙酰CoA的量增加,強(qiáng)化天冬氨酸的合成。在培養(yǎng)基中加入不同濃度的乙醇和醋酸,發(fā)酵72h測(cè)定賴(lài)氨酸,得到它們對(duì)賴(lài)氨酸發(fā)酵的影響如圖3。由圖3可知,乙酸的添加量為0.6%賴(lài)氨酸的產(chǎn)量達(dá)到最高值,乙醇的添加量為0.4%時(shí)賴(lài)氨酸的產(chǎn)量達(dá)到最高值,而且可以看出乙酸的作用效果比乙醇好。2.4基亞和吐溫-80二甲基亞砜和吐溫-80根據(jù)發(fā)酵過(guò)程變化曲線(xiàn),在發(fā)酵16h時(shí)賴(lài)氨酸從細(xì)胞分泌出速率陡增。所以確定從發(fā)酵16h開(kāi)始每隔4h加二甲基亞砜或吐溫-80,以確定最佳的添加時(shí)間和濃度。在發(fā)酵不同時(shí)間加入不同濃度的二甲基亞砜和吐溫-80,發(fā)酵72h測(cè)定賴(lài)氨酸,得到它們對(duì)賴(lài)氨酸發(fā)酵的影響。吐溫-80、二甲基亞砜對(duì)賴(lài)氨酸發(fā)酵的影響見(jiàn)表2。由表2可知,在發(fā)酵20h加入1.5%(體積比)二甲基亞砜或0.3%(質(zhì)量比)吐溫-80,賴(lài)氨酸產(chǎn)量提高了9.4%和10.23%,且吐溫-80的作用好于二甲基亞砜。2.5玉米漿添加量對(duì)賴(lài)氨酸產(chǎn)量的影響實(shí)驗(yàn)中分別添加0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的玉米漿,于30℃、100r/min下發(fā)酵72h,測(cè)定賴(lài)氨酸的產(chǎn)量,由圖4可知玉米漿對(duì)賴(lài)氨酸產(chǎn)量的積累產(chǎn)量影響顯著,最佳添加濃度為1.5%,賴(lài)氨酸產(chǎn)量為85.6g/L。玉米漿是微生物生長(zhǎng)很普遍應(yīng)用的有機(jī)氮源,含有各種氨基酸、生長(zhǎng)因子等,成分較復(fù)雜,用量過(guò)少對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酸不利;用量過(guò)多,菌體生長(zhǎng)受到抑制,產(chǎn)酸下降,而雜酸量上升,對(duì)后續(xù)提取不利。2.6回歸模型的建立及顯著性檢測(cè)由于乙酸、吐溫-80、玉米漿的添加量對(duì)賴(lài)氨酸的生物合成有明顯的影響,在此基礎(chǔ)上,采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法,以賴(lài)氨酸產(chǎn)量為響應(yīng)值,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表3,結(jié)果表略。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以賴(lài)氨酸的產(chǎn)量Y為響應(yīng)值,確定回歸方程的系數(shù),得到如下的二次回歸方程:Y=88.28+4.5X經(jīng)方差分析,可以看出:二次項(xiàng)和交互項(xiàng)對(duì)結(jié)果影響顯著(由回歸方程,應(yīng)用Matlab7.1軟件進(jìn)行分析作響應(yīng)曲面圖,見(jiàn)圖5～圖7。由圖5～圖7可知,在實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)定的范圍內(nèi),玉米漿濃度為1.0～1.5%范圍內(nèi)對(duì)賴(lài)氨酸產(chǎn)量有顯著影響,玉米漿濃度大于1.5%反而會(huì)迅速降低賴(lài)氨酸的產(chǎn)量;吐溫-80濃度最適在0.2～0.4%,過(guò)量會(huì)對(duì)菌體的生長(zhǎng)起抑制作用;乙酸添加對(duì)產(chǎn)賴(lài)氨酸影響不是很顯著,其最適濃度為0.5～0.7%;此時(shí)發(fā)酵液賴(lài)氨酸含量可達(dá)94g/L。由圖中可以看出,回歸模型存在穩(wěn)定點(diǎn),穩(wěn)定點(diǎn)即最大值,利用回歸方程分別對(duì)X3菌株的篩選和遺傳標(biāo)記的制備MattheosKof