細(xì)菌產(chǎn)sod的破壁方法研究

1838年，mann和kieil首次在牛紅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了超氧化物基因（sod）。當(dāng)時(shí)，它被稱為血銅蛋白，1969年由mc干姜命名為超氧化物歧化酶（sod）。SOD普遍存在于動(dòng)物、植物、真核微生物和部分原核微生物等需氧生物細(xì)胞內(nèi),由于SOD作為自由基清除劑解除O1材料和方法1.1培養(yǎng)基和培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、枯草轉(zhuǎn)酮醇酶變異株、地衣芽孢桿菌由河南科技學(xué)院發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室提供;Tris-HClpH8.2,50mmol/L;HCl10mmol/L;活化(斜面)培養(yǎng)基葡萄糖1.0%、牛肉膏1.4%、蛋白胨0.7%、酵母膏0.4%、瓊脂2.0%,pH7.0,121℃滅菌30min,35℃培養(yǎng)25~36h;液體種子培養(yǎng)基葡萄糖1.0%、牛肉膏1.4%、蛋白胨0.7%、酵母膏0.4%,pH7.0,121℃滅菌30min,36℃、150r/min培養(yǎng)12h;發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖1.0%、玉米漿0.5%、(NH回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜YPW—1型,上海通特電訊設(shè)備廠;高速冷凍離心機(jī)SIGMA3K30型,德國(guó)公司;超聲波破碎儀VC130型,SONICSMATERIALSINC;組織破碎機(jī)Y—Q3型,江蘇江陰科研器械廠;紫外分光光度計(jì)756MC型,上海第三分析儀器廠。1.2實(shí)驗(yàn)方法取粗提取的菌體細(xì)胞懸浮液于研缽中,加入少許石英砂,放入冰箱冷凍室冷凍15min,研磨成勻漿。1.2.2超聲破壁1.2.3壓勻漿破壁溫度將粗提取的細(xì)胞懸液置于液體剪切破碎裝置高壓勻漿機(jī)中進(jìn)行破壁20min,進(jìn)口處的溫度維持在20~45℃,出口處的溫度不要高于50℃,壓力維持在30~120MPa。1.2.4粗提液的制備按每克細(xì)菌濕細(xì)胞加入9mL異丙醇,浸泡120min,抽濾除去溶劑,加入3倍體積50mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH7.0),在28℃、180~200r/min搖床振蕩120min,離心除去菌體,即得SOD粗提液。1.2.5從未經(jīng)處理的情況下提取索德粗酶溶液將用四種方法破壁后的細(xì)菌菌體細(xì)胞懸浮液分別置于高速冷凍離心機(jī)中,10000r/min離心20min,上清液即為SOD粗酶液。1.2.6通過(guò)測(cè)定酶活性，改進(jìn)了三苯自氧化的方法2結(jié)果與分析2.1不同破壁處理對(duì)樣品中sod活性的影響將枯草芽孢桿菌的液體種子按接種量10%接入28瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中(250mL三角瓶裝培養(yǎng)基25mL),經(jīng)36℃、150r/min搖床培養(yǎng)18h,得細(xì)菌培養(yǎng)液,經(jīng)離心得菌體細(xì)胞。分4組,每組7個(gè)樣品進(jìn)行平行破壁處理后,測(cè)得SOD活性數(shù)據(jù)如表1,表2。由表1、表2得出,F>F本實(shí)驗(yàn)研究的是不同破壁處理對(duì)SOD活性的影根據(jù)表3LSRa值對(duì)4種破壁處理的SOD活性平均數(shù)作多重比較,列入表4。由表4可知,在4種破壁處理中,彼此間均達(dá)到極顯著差異水平(即在a=0.01水平上達(dá)顯著),且助融劑破壁的處理效果最顯著。2.2不同破壁處理對(duì)樣品sod活性的影響將蠟樣芽孢桿菌的液體種子按接種量10%接28瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中(250mL三角瓶裝培養(yǎng)基25mL)經(jīng)36℃、150r/min搖床培養(yǎng)18h,得細(xì)菌培養(yǎng)液,離心得菌體細(xì)胞。分4組,每組7個(gè)樣品進(jìn)行平行壁處理后,測(cè)得SOD活性數(shù)據(jù)如表5,表6。由表5、表6得出,F>F本實(shí)驗(yàn)研究的是不同破壁處理對(duì)SOD活性的影響,因此只對(duì)不同的處理方法進(jìn)行多重比較,見(jiàn)表7。根據(jù)表7LSRa值對(duì)4種破壁處理的SOD活性平均數(shù)作多重比較,列入表8。由表8可知,在4種破壁處理中,彼此間均達(dá)到極顯著差異水平(即在a=0.01平上達(dá)顯著),且助融劑破壁的處理效果最顯著。SOD活性處理方面存在極顯著差異,同時(shí)也可以判定這種差異不是取樣引起的,而是存在本質(zhì)差異。2.3不同破壁處理對(duì)樣品sod活性的影響將枯草轉(zhuǎn)酮醇酶變異株的液體種子,按接種量10%接入28瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中(250mL三角瓶裝培養(yǎng)基25mL),經(jīng)36℃,150r/min搖床培養(yǎng)18h,得細(xì)菌培養(yǎng)液,經(jīng)離心得菌體細(xì)胞。分4組,每組7個(gè)樣品進(jìn)行平行破壁處理后,測(cè)得SOD活性數(shù)據(jù)如表9。由表9、表10得出F>F本實(shí)驗(yàn)研究的是不同破壁處理對(duì)SOD活性的影響,因此只對(duì)不同的處理方法進(jìn)行多重比較,見(jiàn)表11。根據(jù)表11LSRa值對(duì)4種破壁處理的SOD活性均數(shù)作多重比較,列入表12。由表12可知,在4種破壁處理中,彼此間均達(dá)到極顯著差異水平(即在a=0.01平上達(dá)顯著),且助融劑破壁的處理效果最顯著。2.4不同破壁處理對(duì)樣品中sod活性的影響將地衣芽孢桿菌的液體種子按接種量10%接入28瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中(250mL三角瓶裝培養(yǎng)基25mL),經(jīng)36℃、150r/min搖床培養(yǎng)18h,得細(xì)菌培養(yǎng)液,經(jīng)離心得菌體細(xì)胞。分4組,每組7個(gè)樣品進(jìn)行平行破壁處理后,測(cè)得SOD活性數(shù)據(jù)如表13,表14。由表13、表14得出,F>F本實(shí)驗(yàn)研究的是不同破壁處理對(duì)SOD活性的影響,因此只對(duì)不同的處理方法進(jìn)行多重比較,見(jiàn)表15。根據(jù)表15LSRa值對(duì)4種破壁處理的SOD活性均數(shù)作多重比較,列入表16。由表16可知,在4種破壁處理中,彼此間均達(dá)到極顯著差異水平(即在a=0.01水平上達(dá)顯著),且助融劑破壁的處理效果最顯著。3篩選破壁方法本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用研磨法、超聲波法、高壓勻漿法、助融劑破壁法對(duì)5種菌種分別進(jìn)行細(xì)胞破壁處理,使其胞內(nèi)酶有效釋放出來(lái),再通過(guò)用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定SOD活性,然后分別對(duì)酶活性進(jìn)行方差分析以及對(duì)不同破壁處理之間的多重比較,從而篩選出最適合細(xì)菌SOD提取的破壁方法。3.1幫助金融材料的詳細(xì)處理SOD活性明顯高于其他三種破壁處理,說(shuō)明采用助融劑破壁法提取細(xì)菌中的SOD的生產(chǎn)工藝相對(duì)較為合適。3.2輔助溶劑破壁法3.3研磨和破壁盒3.4對(duì)助融劑的影響1.2.1研磨破壁將菌體培養(yǎng)液在冰浴條件下,利用15kHz的超聲波,時(shí)間1