膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎大鼠模型的建立與藥物干預(yù)的評價

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（ra）是一種生長緩慢、系統(tǒng)性自身免疫性疾病，主要以關(guān)節(jié)和關(guān)節(jié)周圍組織的非感染性炎癥為主，其特征性病理改變?yōu)榛ぱ缀突ぴ錾?，最終導(dǎo)致軟骨侵蝕和關(guān)節(jié)破壞。1材料和方法2結(jié)果2.2各組大鼠足跖水腫的比較在致炎20d可見模型組大鼠足跖腫脹明顯,與正常組比較有顯著差異,在致炎40d時,模型組大鼠足跖腫脹因其炎癥反應(yīng)已從急性期過度至慢性期雖呈降低趨勢,但其足跖厚度仍然遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常組,且降低幅度不如激素組明顯,模型組與激素組有統(tǒng)計學(xué)差異。2.3足無血清胞模型可見正常組大鼠在整個實驗過程中足爪無腫脹表現(xiàn),而模型組大鼠在致炎20d出現(xiàn)明顯的足爪紅腫現(xiàn)象(包括足背側(cè)、足跖側(cè)),致炎40d模型組大鼠足爪無法完全展開,腫脹較前減輕,但關(guān)節(jié)畸形明顯。致炎40d激素組大鼠足爪腫脹較前明顯減輕。2.4足跖部組織水腫正常組大鼠足爪無異常,未見骨質(zhì)破壞表現(xiàn),而模型組大鼠致炎20d可見雙側(cè)足爪軟組織腫脹陰影,在雙側(cè)足爪足跖部可見骨質(zhì)破壞碎裂,在致炎40d,模型組大鼠可見雙側(cè)足爪軟組織腫脹陰影,但腫脹較前減輕,足跖部可見骨質(zhì)破壞碎裂(其中圓形圖案所示部位為骨質(zhì)破壞部位)。激素組幾乎未見足跖部骨質(zhì)破壞碎裂。2.5各組大鼠血清tnf-含量的比較致炎后40d(即用藥20d后)可見模型組血清TNF-α含量顯著高于正常及激素組,說明在模型成立后用激素干預(yù)CIA大鼠20d,可有效降低CIA大鼠血清TNF-α含量。2.6tnf-表達(dá)可見模型組膝關(guān)節(jié)滑膜中TNF-α表達(dá)相對于正常、激素組增強(qiáng)。而激素組TNF-α表達(dá)明顯低于模型組。說明激素應(yīng)用后可有效降低膝關(guān)節(jié)滑膜中TNF-α表達(dá)量。3ra的模型構(gòu)成本研究選取牛Ⅱ型膠原和不完全氟氏佐劑制作類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的CIA大鼠模型。牛Ⅱ型膠原作用于大鼠,模擬了人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的細(xì)胞自身免疫過程。牛Ⅱ型膠原刺激大鼠的免疫細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答,隨后產(chǎn)生抗體,識別并結(jié)合牛Ⅱ型膠原形成免疫復(fù)合體,導(dǎo)致關(guān)節(jié)、軟骨和滑膜的損害。目前國內(nèi)外關(guān)于CIA大鼠模型制作的文獻(xiàn),因選用何種膠原、膠原用量、選取致炎部位,是否加強(qiáng)注射方面不統(tǒng)一,制作的方法很多,但在前期的預(yù)試根據(jù)某些文獻(xiàn)制作CIA大鼠模型,雖CIA大鼠足跖腫脹是有所體現(xiàn)的,但未能發(fā)現(xiàn)CIA大鼠明顯的骨骼和關(guān)節(jié)的改變,故實驗者認(rèn)為僅憑足跖腫脹,不能充分說明CIA大鼠模型成立,因為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎不能僅憑大鼠炎癥表現(xiàn)如腫脹則認(rèn)為成功模擬了該疾病。實驗者最終選用了每只大鼠注射等量的牛Ⅱ型膠原和不完全氟氏佐劑乳化劑0.4ml(含膠原400μg),同樣方法在致炎14d加強(qiáng)注射乳化劑0.1ml(含膠原100μg)。第一次于大鼠足跖部皮下注射牛Ⅱ型膠原和不完全氟氏佐劑的乳化劑致炎,注射的足跖當(dāng)日就出現(xiàn)紅腫的表現(xiàn),然后逐漸加重,并向?qū)?cè)蔓延,在第一次致炎后的14d,進(jìn)行加強(qiáng)注射,腫脹較前加重,并于致炎20d達(dá)高峰,測其足跖厚度平均可達(dá)0.65cm左右(為了說明RA的發(fā)病機(jī)制是一全身免疫反應(yīng),而且實驗中也看到了不僅是致炎部位的足跖腫脹,其對側(cè)足亦發(fā)生腫脹,故特地設(shè)計測量未致炎足即左足的足跖厚度),進(jìn)一步拍攝各組大鼠足爪腫脹的照片,結(jié)合足爪X-ray照射,得出在致炎20d,模型組出現(xiàn)了明顯的炎癥表現(xiàn),且出現(xiàn)骨質(zhì)破壞后關(guān)節(jié)和軟骨的較明顯改變,如關(guān)節(jié)畸形和限制行步態(tài)的表現(xiàn),可說明在致炎20d即可成模。證明成模的當(dāng)日激素組即開始采用激素干預(yù),并且連用20d,每兩日1次灌胃給藥,激素組大鼠直至致炎40d(即用激素的20d),大鼠的足腫脹度、足跖厚度相對于模型組有明顯改善,限制性步態(tài)消失,結(jié)合足爪X-ray檢測,發(fā)現(xiàn)激素顯著改善類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠的骨質(zhì)破壞并能逆轉(zhuǎn)關(guān)節(jié)軟骨損害,同時亦說明致炎20d時采用激素藥物干預(yù),連用20d作為一個療程,是能夠逆轉(zhuǎn)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎損害的。在實驗中經(jīng)過重復(fù)3次該種造模方法,可明確此種造模方法及選擇用藥時機(jī)的方案是比較穩(wěn)定的,重復(fù)性較好的。目前常用的判斷RA模型成立的方法如足跖厚度的測量,實驗者所測的足跖厚度與國內(nèi)外很多文獻(xiàn)是吻合的。在證明成模時不僅選用測其足跖腫脹度,且為觀察骨質(zhì)破壞、關(guān)節(jié)畸形,需結(jié)合其大體圖片及足爪X-ray檢測,實驗者選用三個方面:1)足跖厚度,2)足爪大體圖片,3)足爪X-ray檢測來證明模型成立。而且相對某些文獻(xiàn)的報道來看,在較短的時間內(nèi)建立了CIA大鼠模型,選擇了一個較佳的注射部位方便操作,且成模率較高(在實驗中用該方法建模,幾乎所有的大鼠都觀察到了足跖腫脹,且?guī)缀蹙赬-ray下發(fā)現(xiàn)了足跖部的骨質(zhì)破壞與關(guān)節(jié)改變,而且未見大鼠死亡,可認(rèn)為成模率達(dá)95%左右)。并聯(lián)系RA作為一種炎癥性的自身免疫性疾病,檢測了血清中的TNF-α和膝關(guān)節(jié)滑膜中的TNF-α表達(dá)情況,觀察致炎40d(即用藥20d)后的療效,發(fā)現(xiàn)激素能顯著降低CIA大鼠血清中TNF-α含量,與模型組有顯著差異,同時亦發(fā)現(xiàn)膝關(guān)節(jié)滑膜中TNF-α表達(dá)減少。這進(jìn)一步說明了如何建模、怎樣證明、選擇什么時機(jī)給藥、用藥多長時間可顯著干預(yù)或逆轉(zhuǎn)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病理改變。綜上所述,實驗者采用的這種造模方法,操作較簡單,重復(fù)性較好,而且縮短了造模時間,并采用有效的指標(biāo)證明其模型成立后,再用激素進(jìn)行干預(yù)治療,可有效的逆轉(zhuǎn)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的癥狀,可用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的相關(guān)研究,也可為在此基礎(chǔ)上制定類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎研究策略奠定一定的基礎(chǔ)。1.1藥品、試劑標(biāo)準(zhǔn)醋酸地塞米松片,浙江仙琚制藥股份有限公司,批號:國藥準(zhǔn)字H33020822,規(guī)格:0.75mg×100片,成人劑量為一次0.75~3.00mg,配制溶液濃度為0.75mg/ml。1.2湖南實驗動物中心提供Wistar大鼠30只,雄性,體重(150±20g),由湖南實驗動物中心提供(動物合格證號:SCXK(湘)2009-0012)。級別:SPF級,飼養(yǎng)于普通實驗室。1.3案例1:美國chndx公司牛Ⅱ型膠原,批號:20021,購自美國Chondrex公司;不完全佛氏佐劑,批號:7002,購自美國Chondrex公司;TNF-αELISA試劑盒,批號:E02T0008,購自上海蘭基公司;RabbitAnti-TumorNecrosisα,批號:BA0131,購自武漢博士德公司;兩步法免疫組化試劑盒,批號:SV-0001,購自武漢博士德公司。1.4ek自動酶標(biāo)計數(shù)儀和yd-33病理切片機(jī)CX40-32J02生物顯微分析成像儀(日本Olympus公司);EIX808IUbiotek自動酶標(biāo)讀數(shù)儀(美國biotek公司);YD-335病理切片機(jī)(浙江益迪公司);KD-BM生物組織包埋機(jī)(浙江金華科迪儀器公司);F52-8C500X光機(jī)(德國西門子公司);W380數(shù)碼相機(jī)(日本SONY公司);Wi448游標(biāo)卡尺(北京東西儀科技有限公司)。1.5方法參照文獻(xiàn)1.5.1足以的厚度參照文獻(xiàn)方法1.5.2各組大鼠足跖側(cè)和足背側(cè)照片比較用相機(jī)在致炎20d,分別對正常組與模型組大鼠足跖側(cè)與足背側(cè)拍照,致炎40d再用相機(jī)對正常組、模型組、激素組大鼠足跖側(cè)與足背側(cè)拍照。1.5.3足鱗x-現(xiàn)代檢測于致炎20d,致炎40d,分別對正常組與模型組大鼠足爪進(jìn)行X-ray檢測,電壓51kv,電流8mAs。致炎40d再對正常組、模型組、激素組大鼠足爪進(jìn)行X-ray檢測,電壓、電流不變。1.5.4血清tnf-a含量檢測正常組、模型組、激素組大鼠在致炎40d股靜脈取血,3000rpm離心,取上清,-20℃保存,ELISA方法測定血清TNF-α含量,具體操作按試劑盒說明進(jìn)行。1.5.5免疫組化檢測膝關(guān)節(jié)滑膜組織正常組、模型組、激素組大鼠在致炎40d取膝關(guān)節(jié)滑膜組織,4%多聚甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋,切片,進(jìn)行免疫組化檢測,具體操作按試劑盒說明進(jìn)行。顯微鏡觀察并攝片。2.1各組大鼠足跖水腫、tnf-變化在致炎當(dāng)天注射膠原的足跖即有腫脹,次日后逐漸加強(qiáng),且于致炎4d蔓延至對側(cè)足跖,雙側(cè)足跖腫脹明顯約在致炎9d,且致炎大鼠出現(xiàn)明顯的關(guān)節(jié)畸形,限制性步態(tài)等,然后逐漸消退,于致炎14d進(jìn)行加強(qiáng)注射,致炎大鼠腫脹較前期典型,雙側(cè)足跖腫脹皆明顯,關(guān)節(jié)畸形較前明顯,限制性步態(tài)加強(qiáng),于致炎20d達(dá)高峰。用藥物干預(yù)后腫脹減輕,模型組腫脹也漸漸減輕,但減輕的程度不如激素組,同時足爪畸形依然典型,