m法測定石埋管懸浮培養(yǎng)石埋柏細(xì)胞活力條件的研究

序言mtt（t誘導(dǎo)藍(lán)莓），即酪氨酸，四甲基偶氮唑鹽，格式c。自從1983年美國學(xué)者M(jìn)osmam1材料和方法1.1試驗材料1.1.11.1.2mtt溶液1.1.3緩沖區(qū)緩沖區(qū)(1)檸檬酸鈉緩沖液(Na1.1.4滲透促進(jìn)劑二甲基亞砜(DMSO)(Sigma公司產(chǎn)品)和曲拉通(Triton)分別用緩沖液配制成濃度為5%、0.1%的溶液。1.2方法1.2.1石擋證對不同濃度石基柏細(xì)胞的tt細(xì)胞的tt細(xì)胞的分離MTT測定懸浮細(xì)胞活力時,取懸浮培養(yǎng)的石刁柏細(xì)胞,抽濾除去培養(yǎng)基。取六支試管,各加入2.5ml4‰的MTT溶液和0.5g(鮮重)石刁柏細(xì)胞,并分別加入上述6種含有5%二甲基亞砜滲透促進(jìn)劑的緩沖液各2.5ml,25℃靜置于黑暗處處理20h,細(xì)胞變成紅色,離心去上清液,加入5ml蒸餾水洗去MTT,如此重復(fù)3次,再加入4ml酸化異丙醇洗脫劑,置于60℃水浴中充分洗脫1~2次,使細(xì)胞完全無色。取上清液,定容到5ml,在UV-9100型分光光度計上以不同的波長測其吸光值,以確定最佳測定波長。1.2.2細(xì)胞無機質(zhì)細(xì)胞處理根據(jù)以上實驗所確定的方法,取六支試管,各加入2.5ml4‰的MTT溶液和0.5g(鮮重)石刁柏細(xì)胞,并分別加入上述6種含有5%二甲基亞砜滲透促進(jìn)劑的緩沖液各2.5ml,25℃靜置于黑暗處處理20h,細(xì)胞變成紅色,離心去上清液,加入5ml蒸餾水洗去MTT,如此重復(fù)3次,再加入4ml酸化異丙醇洗脫劑,置于60℃水浴中充分洗脫1~2次,使細(xì)胞完全無色。取上清液,定容到5ml,在UV-9100型分光光度計上以1.2.1所確定的波長進(jìn)行測定,確定最佳緩沖液。1.2.3滲透促進(jìn)劑的確定根據(jù)以上實驗所確定的方法,設(shè)置三個處理,處理1(Control):Vc-磷酸鈉(VcNa1.2.4mtt細(xì)胞的體外分離根據(jù)以上實驗所確定的方法,取兩支試管,各加入2.5ml4‰的MTT溶液、0.5g(鮮重)石刁柏細(xì)胞、2.5ml1.2.2中所確定的緩沖液以及1.2.3中所確定的滲透促進(jìn)劑,25℃靜置于黑暗處處理20h,細(xì)胞變成紅色,離心去上清液,加入5ml蒸餾水洗去MTT,重復(fù)3次,再分別加入4ml酸化異丙醇洗脫劑,無水乙醇,并置于60℃水浴中充分洗脫1~2次,使細(xì)胞完全無色。取上清液,定容到5ml,在UV-9100型分光光度計上以1.2.1所確定的波長進(jìn)行測定,確定最佳洗脫劑。1.2.5mtt濃度的確定根據(jù)以上實驗所確定的方法,各取0.5g處于生長延遲期、指數(shù)期、穩(wěn)定期的石刁柏細(xì)胞,加入1.2.2所確定的緩沖液以及1.2.3中所確定的滲透促進(jìn)劑,分別用濃度為0.033‰、0.066‰、0.100‰、0.133‰、0.167‰、0.233‰、0.266‰、0.300‰、0.333‰、0.367‰和0.400‰的MTT溶液25℃靜置于黑暗處處理20h,經(jīng)1.2.4所確定的最佳洗脫劑脫色后,取上清液,定容為5ml,在UV-9100型分光光度計上以1.2.1所確定的波長進(jìn)行測定。1.2.6mtt對石溝細(xì)胞檢測能力的分析分別取4×101.2.7訓(xùn)練時間對mtt染色的影響取5ml石刁柏細(xì)胞培養(yǎng)液,400r/min離心以收集細(xì)胞,并對其活力進(jìn)行測定,以得出培養(yǎng)過程中的培養(yǎng)中細(xì)胞活力的變化規(guī)律。1.3mtt溶液鑒定細(xì)胞活力采用比色波長560nm,最適緩沖液為檸檬酸鈉-Vc緩沖液,滲透促進(jìn)劑為二甲基亞砜,洗脫劑為酸化異丙醇,0.267‰濃度的MTT溶液鑒定細(xì)胞活力。2結(jié)果2.1比色波長各種不同緩沖液處理后得到相同的波形,并均在560nm處有一明顯吸收峰(圖1)。因此,確定在λ=560nm處測定吸光值。2.2緩沖緩沖液體吸收的影響由圖2可以看出,在MTT法測石刁柏細(xì)胞活力時,用檸檬酸鈉-Vc緩沖液(0.1mol/L,pH7.0)較好。2.3在18h內(nèi),土壤od值結(jié)果如圖3所示,處理1的處理時間在12h之內(nèi)OD值較為穩(wěn)定,但OD值最低,24h達(dá)到最大值;處理2在18h之內(nèi)OD值最高,而且一直較為穩(wěn)定,21h達(dá)到最大值,以后逐漸降低;處理3在24h之內(nèi)OD值始終比較穩(wěn)定,但其OD值一直較低。因此,選用處理2中二甲基亞砜作為滲透促進(jìn)劑效果最好。2.4無水乙醇洗脫前后od值比較針對同樣的實驗材料,使用酸化異丙醇洗脫后的OD值為0.809,無水乙醇洗脫后的OD值為0.621。因此,在通過選用這三種洗脫劑對石刁柏細(xì)胞活力的檢測,發(fā)現(xiàn)最佳洗脫劑為酸化異丙醇。2.5不同濃度中穩(wěn)定期胞od值的比較圖5結(jié)果顯示延遲期細(xì)胞在濃度為0.233‰的MTT溶液處理后OD值最大,而在濃度為0.267‰的MTT溶液處理后OD值最小;指數(shù)期細(xì)胞在以濃度為0.3‰的MTT溶液處理后OD值最大,而在濃度為0.167‰的MTT溶液處理后OD值最小;穩(wěn)定期細(xì)胞在以濃度為0.233‰的MTT溶液處理后OD值最大,而在濃度為0.367‰的MTT溶液處理后OD值最小。當(dāng)濃度為0.133‰時延遲期.指數(shù)期.穩(wěn)定期三個時期OD值相差最小,適于對未知培養(yǎng)時期的細(xì)胞計數(shù);濃度為0.267‰時三個時期OD值相差最大,細(xì)胞顏色差異最明顯,適于鑒定細(xì)胞活力。2.6mtt對石角質(zhì)細(xì)胞活力的檢測相關(guān)性曲線回歸方程y=0.1867×10由圖6可見,細(xì)胞數(shù)量在4×102.7mtt的細(xì)胞活力下降如圖7所示,在不更換培養(yǎng)基的情況下,1~2d細(xì)胞進(jìn)入延遲期,隨著培養(yǎng)時間的增長,細(xì)胞數(shù)目以指數(shù)的方式增加,3~7d時細(xì)胞活力達(dá)到最大,活細(xì)胞線粒體琥珀酸脫氫酶酶解MTT產(chǎn)生大量藍(lán)紫色結(jié)晶狀甲瓚顆粒,使其OD值在560nm處達(dá)到最大,7d~9d,細(xì)胞增長放緩,細(xì)胞活力開始下降,因而OD值趨于下滑。9d以后,培養(yǎng)基中養(yǎng)分幾乎耗盡,使得死亡細(xì)胞的數(shù)量大于活細(xì)胞的數(shù)量,細(xì)胞活力嚴(yán)重下降,OD值持續(xù)下滑。由此可見,MTT對細(xì)胞染色能力與不同生長時期的活細(xì)胞數(shù)量成線性關(guān)系,而且繼代培養(yǎng)基也應(yīng)該在9d之內(nèi)更換,否則影響細(xì)胞活力。2.8酸脫氫酶法淡黃色的MTT被活細(xì)胞的線粒體琥珀酸脫氫酶分解產(chǎn)生藍(lán)紫色結(jié)晶狀甲瓚顆粒,聚積在細(xì)胞周圍和細(xì)胞內(nèi),聚積的量與活力成正比。其結(jié)果見圖8。3mtt法的操作條件MTT法是常用的測定細(xì)胞活力的方法,但一般用于動物細(xì)胞的活力檢測,未見到用于測定植物細(xì)胞活力,根據(jù)本試驗結(jié)果,只要選擇合適的緩沖液、滲透促進(jìn)劑、洗脫劑、MTT濃度以及處理時間,MTT法同樣可以測定植物細(xì)胞的活力。測定石刁柏細(xì)胞活力的最適條件為比色波長570nm,最適緩沖液為檸檬酸鈉-Vc緩沖液,滲透促進(jìn)劑為二甲基亞砜,洗脫劑為酸化異丙醇,0.267‰濃度的MTT溶液,處理時間為6~15h。MTT法操作的難點是培養(yǎng)后,細(xì)胞的培養(yǎng)基要吸干凈,否則,殘留的蛋白會對MTT有一定的吸附作用,影響準(zhǔn)確性。測吸光值要有一定的時間范圍,否則在測定時隨著時間的推移每個樣品顏色都會變深,這可能是由