急性壞死性胰腺炎大鼠腦髓鞘堿性蛋白的動(dòng)態(tài)變化

首先，羅德里奇提出了這一概念。事實(shí)上，voger認(rèn)為脂肪酶是其可能的原因。但關(guān)于胰性腦病的病因、發(fā)病機(jī)制、診斷等尚未達(dá)成一致認(rèn)識(shí),動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床尸檢病理學(xué)提示脫髓鞘改變是其特征。在多發(fā)性硬化癥的急性反應(yīng)期,腦脊液中髓鞘堿性蛋白(MBP)的水平與髓鞘的損害呈正相關(guān)。為闡明急性胰腺炎早期腦脊液中MBP水平變化規(guī)律,我們作了下列研究。材料和方法一、elisa試驗(yàn)清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)雄性SD大鼠,體重(212±15)g,購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海分院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。?；悄懰徕c購(gòu)自Sigma公司,加生理鹽水配成5%和1%濃度溶液。MBPELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)DiagnosticSystemsLaboratories公司。其他儀器包括微泵注射器(德國(guó)BM)公司、立體定位儀(日本SETAGAYAKUTOKYO公司)、酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO-TEK公司)等。二、各組小鼠血清炎、急性水腫性胰腺和假手術(shù)組雄性SD大鼠120只,隨機(jī)分為3組:急性壞死性胰腺炎(ANP)組、急性水腫性胰腺炎(AEP)組和假手術(shù)組,每組40只(共5個(gè)時(shí)間點(diǎn),每一時(shí)間點(diǎn)8只,其中6只用于取腦脊液和血液標(biāo)本,2只用于電鏡檢查)。三、各組大鼠膽胰管肝門(mén)anp模型的制作大鼠于實(shí)驗(yàn)前12h禁食,但自由飲水,稱取體重后2%戊巴比妥鈉(0.1mL/100g)腹腔內(nèi)注射麻醉,于膽胰管肝門(mén)水平用無(wú)損傷血管鉗暫時(shí)夾閉,經(jīng)十二指腸側(cè)壁逆行膽胰管穿刺,微泵逆行加壓注射5%?；悄懰徕c1mL/kg,壓力為40cmH2O,10min后去除血管鉗和穿刺針,制成ANP模型;AEP組操作同ANP組,僅向膽胰管內(nèi)注入1%?；悄懰徕c;假手術(shù)組的操作為暫時(shí)夾閉膽胰管、逆行膽胰管穿刺置管,無(wú)溶液注入。四、瞳神經(jīng)血藥血學(xué)標(biāo)本大鼠體內(nèi)模型制備后3、6、9、12和24h,參照Sarna等報(bào)告的方法分別抽取大鼠腦脊液,每一時(shí)間點(diǎn)各為6只。2%戊巴比妥鈉再次腹腔內(nèi)注射麻醉,將大鼠頭部固定置于立體定位儀,于后鹵點(diǎn)至枕骨嵴處作正中切口,枕骨嵴前方鉆一直徑為2mm的孔,刺穿硬腦膜,將一內(nèi)徑0.2mm的導(dǎo)管沿硬腦膜下緩慢插至小腦延髓池(見(jiàn)圖1)。每只大鼠可抽得約100μL腦脊液。然后經(jīng)大鼠腹腔動(dòng)脈抽取血液。腦脊液標(biāo)本于5500r/min離心10min;血液于室溫放置2~4h,2500r/min離心5min,上清液置于-80℃冰箱保存。腦脊液及血清MBP測(cè)定按ELISA試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。五、透射電鏡檢查取胰腺頭、體、尾部組織各一塊,光鏡下行組織病理學(xué)檢查,按Schmidt等的方法對(duì)組織表現(xiàn)的正常形態(tài)、水腫、炎癥、出血和壞死情況分別按0~4分進(jìn)行病理評(píng)分。每組各時(shí)間點(diǎn)任取2例作透射電鏡檢查。2%戊巴比妥鈉再次腹腔內(nèi)注射麻醉,迅速開(kāi)胸經(jīng)左心室至主動(dòng)脈插管,以100mL生理鹽水洗去血液,用4℃含40g/L多聚甲醛的0.1mmol/L磷酸緩沖液(pH7.4)先快后慢灌流固定腦組織2h,取大腦組織1mm3數(shù)塊作超微病理學(xué)檢查,2.0%戊二醛固定和1.0%鋨酸PBS后固定(4℃,各2h),梯度乙醇脫水,環(huán)氧丙烷置換2次,618液包埋浸透,LKBV型切片儀超薄切片,檸檬酸鉛染色,HitachiH-500型透射電鏡觀察。六、統(tǒng)計(jì)處理采用SPSS10.0軟件進(jìn)行單因素方差分析,P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果一、各組大鼠胰腺組織自溶后的光鏡觀察1.大體觀察:ANP組在注射后立即出現(xiàn)胰腺充血水腫,散在出血點(diǎn)局限在胰頭和胰體部;3h后胰腺頭、體、尾均明顯充血水腫,伴片狀出血;6~9h胰腺出現(xiàn)壞死斑塊,胰周脂肪皂化,伴血性腹水;12h時(shí)胰腺壞死明顯,胰腺組織可變薄,腹水量中等;24h時(shí)胰腺大片狀壞死,部分胰腺組織自溶,可見(jiàn)大量血性腹水。AEP組和假手術(shù)組僅見(jiàn)彌漫性或局限性水腫改變。2.光鏡觀察:ANP組在造模后3h可見(jiàn)彌漫性葉間隙、小葉間隙擴(kuò)張和(或)局限腺泡間隙擴(kuò)張,彌漫性細(xì)胞壞死≤10/HP,出血和脂肪壞死≤5個(gè)區(qū)域,小葉內(nèi)或血管周圍浸潤(rùn)的白細(xì)胞≤25/HP;6~9h時(shí)彌漫性細(xì)胞壞死≤16/HP,出血和脂肪壞死≤6個(gè)區(qū)域,白細(xì)胞≤30/HP;12h時(shí)細(xì)胞間隙擴(kuò)張,出血和脂肪壞死≤7個(gè)區(qū)域,白細(xì)胞>30/HP或局限形成小膿腫;24h時(shí)彌漫性細(xì)胞間隙擴(kuò)張,彌漫性細(xì)胞壞死>16/HP,出血和脂肪壞死≥8個(gè)區(qū)域,白細(xì)胞>35/HP或小膿腫匯聚。AEP組各時(shí)間點(diǎn)僅見(jiàn)局限性或彌漫性葉間隙、小葉間隙擴(kuò)張及白細(xì)胞≤25/HP,未見(jiàn)壞死及出血灶。假手術(shù)組僅見(jiàn)局限性葉間隙擴(kuò)張和(或)白細(xì)胞≤2/HP。ANP組各時(shí)間點(diǎn)胰腺組織病理學(xué)評(píng)分顯著高于AEP組和假手術(shù)組(P<0.05)(見(jiàn)圖2)。二、髓劍的結(jié)構(gòu)變化電鏡下,AEP組和假手術(shù)組腦髓鞘結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯異常改變,呈規(guī)則致密平行排列。ANP組髓鞘的結(jié)構(gòu)變化多樣,如髓鞘板層結(jié)構(gòu)呈空泡樣改變、局限性或彌漫性疏松化,重者可見(jiàn)連續(xù)性中斷、節(jié)段性髓鞘脫失,3~9h時(shí)主要表現(xiàn)為局灶性結(jié)構(gòu)輕度紊亂,12和24h時(shí)部分髓鞘病變加重(見(jiàn)圖3)。三、兩組mbp水平比較模型誘導(dǎo)3h時(shí)ANP組腦脊液MBP水平顯著高于AEP組和假手術(shù)組(P<0.05);6h和9h時(shí)差異仍然顯著(P<0.05)。12~24h,ANP組MBP水平逐漸下降,趨于接近AEP組和假手術(shù)組。AEP組和假手術(shù)組大鼠24h內(nèi)腦脊液MBP水平無(wú)顯著差異(P>0.05),始終保持在較低水平(見(jiàn)表1)。四、血清移植ANP組、AEP組和假手術(shù)組大鼠24h內(nèi)血清MBP水平無(wú)顯著差異(P>0.05),始終保持在低水平(見(jiàn)表2)。腦髓劍損傷的發(fā)病機(jī)制胰性腦病大多發(fā)生于急性胰腺炎病程的早期,約在發(fā)病后2~5d。Rothermich等描述了胰性腦病的臨床表現(xiàn),通過(guò)尸檢發(fā)現(xiàn)腦組織存在小的出血灶和血管周脫髓鞘等改變。Vogel將脂肪酶注入實(shí)驗(yàn)家兔頸內(nèi)動(dòng)脈,復(fù)制出與胰性腦病病人相類似的腦組織病理改變。因此,多數(shù)學(xué)者認(rèn)為,腦組織彌散性脫髓鞘和小出血灶是胰性腦病的特征性改變。目前,關(guān)于胰性腦病的病因尚無(wú)一致認(rèn)識(shí)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí),胰酶是其可能的病因,但尚缺乏確鑿的臨床證據(jù)支持。越來(lái)越多的證據(jù)表明,細(xì)胞因子在胰腺炎發(fā)病及多臟器功能障礙中起重要作用。細(xì)胞因子可通過(guò)多種途徑影響血腦屏障,一方面,一些細(xì)胞因子如TNF、IL-6可通過(guò)特殊的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制跨越血腦屏障;另一方面,TNF、IL-6能開(kāi)放血腦屏障。因此,細(xì)胞因子的過(guò)度激活狀態(tài),如在胰腺炎發(fā)病時(shí),可能會(huì)導(dǎo)致腦水腫發(fā)生。腦水腫繼發(fā)的髓鞘損傷機(jī)制可能與腦積水的病理狀態(tài)相似。急性胰腺炎時(shí)腦髓鞘損傷的可能機(jī)制為:(1)炎性細(xì)胞因子收縮血管內(nèi)皮細(xì)胞致血腦屏障通透性升高;(2)炎性細(xì)胞因子對(duì)髓鞘結(jié)構(gòu)的直接毒性作用;(3)誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元等進(jìn)一步促進(jìn)其他炎性細(xì)胞因子的釋放。髓鞘是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種獨(dú)特結(jié)構(gòu),由約70%的脂質(zhì)和30%的蛋白組成。占髓鞘蛋白總量30%的MBP則主要由少突膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá),如大量神經(jīng)髓鞘組織受損,就會(huì)導(dǎo)致腦脊液中MBP濃度異常。本研究表明,在大鼠ANP的早期即可檢測(cè)到腦脊液MBP的異常升高。已有研究報(bào)道血清MBP濃度變化可反映腦組織神經(jīng)髓鞘的損傷。但本試驗(yàn)中,ANP組血清MBP濃度與AEP組及假手術(shù)組相比無(wú)顯著性差異,且各組血清MBP濃度與腦脊液MBP濃度并無(wú)相關(guān)性。其原因可能是神經(jīng)髓鞘損傷程度尚不足以引起血清MBP濃度的變化,也可能與血液的稀釋效應(yīng)有關(guān)。也有文獻(xiàn)報(bào)道,血清MBP濃度的變化并不一定與腦脊液中MBP濃度的變化呈正相關(guān)。胰腺炎病人并發(fā)胰性腦病常提示預(yù)后較差,如何早期診斷腦功能障礙的發(fā)生尤為重要。由于胰性腦病的病理生理機(jī)制不明,常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢查尚不能提供具有診斷價(jià)值的信息,當(dāng)并發(fā)腦功能障礙時(shí)常借助于影像學(xué)檢查,如CT、MRI、正電子發(fā)射成像(PET)等檢查均可從不同角度顯示腦組織損傷狀況。Ohkubo等報(bào)道于胰腺炎病人出現(xiàn)神經(jīng)、精神異常后的第5天觀察到腦MRI影像異常。但在ANP病人疾病較早階段,影像學(xué)檢查和臨床表現(xiàn)均不能提示或鑒別腦組織可逆性或永久性損害。為此,能夠反映早期腦損害的腦脊液標(biāo)記物,如MBP、