銀杏抗寒性的研究

選擇抗寒性強(qiáng)的樹(shù)種、種源、品種或無(wú)性系，是解決樹(shù)種引進(jìn)過(guò)程中凍壞樹(shù)的根本途徑。不同種類、同一種類不同品種、同一品種不同生育期、不同器官、組織等抗寒力均表現(xiàn)出極大差異。不同銀杏單株、品種、無(wú)性系的遺傳背景和生境存在較大差異,因此在植株形態(tài)、抗寒性等方面均表現(xiàn)不同。其中抗寒性差異直接影響銀杏在高緯度或高海拔地區(qū)的引種和種植,因此在高緯度或高海拔地區(qū)引種銀杏之前,對(duì)引種無(wú)性系或品種進(jìn)行抗寒性檢測(cè)是必須的。在極端氣候下,一個(gè)樹(shù)種大面積受凍害死亡或樹(shù)勢(shì)衰弱,而保留下來(lái)的健壯單株則具有相當(dāng)?shù)目购?將這種單株做為母本,經(jīng)過(guò)抗寒力測(cè)定、選育,就可得到優(yōu)良的抗寒無(wú)性系。因此,常有凍害發(fā)生的地區(qū),引種銀杏的同時(shí),對(duì)各品種或無(wú)性系的抗寒力要做到胸中有數(shù),選擇抗寒力強(qiáng)的品種作為下期引種的對(duì)象,同時(shí)要特別注意引種地抗寒力強(qiáng)的品種、品系、無(wú)性系引種范圍的擴(kuò)大,爭(zhēng)取從根本上解決銀杏高緯度和高海拔引種受凍問(wèn)題。本研究用-20℃對(duì)39個(gè)嫁接18年生的優(yōu)良核用無(wú)性系的越冬枝條進(jìn)行冰凍處理,測(cè)定其相關(guān)的生理生化指標(biāo),對(duì)39個(gè)核用無(wú)性系的抗寒性進(jìn)行綜合評(píng)定,初步篩選出抗寒性較強(qiáng)的無(wú)性系,為下一步在高海拔、高緯度地區(qū)的區(qū)組試驗(yàn)及銀杏邊緣分布區(qū)的引種提供理論依據(jù)和抗寒種質(zhì)資源。1材料和方法1.1試驗(yàn)材料材料來(lái)源于江蘇省邳州市陳樓鎮(zhèn)銀杏種質(zhì)資源圃,為嫁接18年生的39個(gè)核用銀杏無(wú)性系。1.2-20冷凍處理2008年1月20日采集生長(zhǎng)健壯、粗細(xì)均勻的樹(shù)冠外圍的一兩年生枝條,用自來(lái)水沖洗數(shù)遍,再用蒸餾水沖洗3次,然后用吸水紙吸干水分,最后將枝條末端進(jìn)行蠟封,將每個(gè)無(wú)性系蠟封后的枝條分成相等的8份,其中1份用于低溫處理,剩余7份用于半致死溫度測(cè)定,放于冰箱中4℃保存。每次處理時(shí),取參試材料的1份枝條放于程控冰箱內(nèi)進(jìn)行-20℃冰凍處理,降溫速度4℃/h,達(dá)到目的溫度后維持24h,然后逐步升溫,升溫速度亦為4℃/h。每處理重復(fù)3次。1.2.1冰激凌處理與解凍稱量每個(gè)無(wú)性系枝條7份,每份10.0g剪成1.0cm小段,密封在塑料標(biāo)本袋內(nèi)。1份在室溫下測(cè)定電導(dǎo)率作為對(duì)照(CK),另外6份放入超低溫冰箱內(nèi)進(jìn)行冰凍處理。冰凍處理溫度分別為-15℃、-20℃、-25℃、-30℃、-35℃和-40℃。冷凍時(shí)降溫幅度和解凍時(shí)的升溫幅度都為4℃/h,冷凍到達(dá)所處理的溫度后,維持24h,然后解凍,3次重復(fù)。相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定和半致死溫度的估算參照焦奎寶等的方法。1.2.2銀杏無(wú)性系抗寒力的測(cè)定是一種多因素分析的研究依據(jù)。根據(jù)《反應(yīng)藥》第32條第5第第5采用蒽酮比色法測(cè)定淀粉和可溶性總糖含量,考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定可溶性蛋白含量,磺基水楊酸法測(cè)定脯氨酸含量,均參照李合生的方法,略有改動(dòng)。超氧物岐化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)、丙二醛(MDA)和氧自由基(·O2-)產(chǎn)生速率的測(cè)定參照文獻(xiàn)的方法,略有改動(dòng)。采用多元統(tǒng)計(jì)主成分分析對(duì)39個(gè)銀杏無(wú)性系進(jìn)行分析,計(jì)算銀杏無(wú)性系抗寒力,對(duì)銀杏無(wú)性系的抗寒性進(jìn)行分類,并進(jìn)行分析討論。2結(jié)果與分析2.1不同銀杏抗寒性的差異2.1.1無(wú)性系的nt50如表2所示,不同銀杏無(wú)性系枝條的LT50差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01)(見(jiàn)表3)。其中16#無(wú)性系的LT50最高,為-29.06℃,28#無(wú)性系的LT50最低,為-18.94℃,兩者相差10.12℃。供試的39個(gè)核用無(wú)性系的LT50由低到高的順序(見(jiàn)表2)是16#、17#、38#、40#、53#、44#、15#、42#、45#、36#、57#、43#、19#、41#、18#、13#、10#、30#、35#、50#、33#、56#、26#、9#、20#、55#、32#、54#、37#、34#、11#、21#、14#、31#、12#、29#、27#、39#、28#。2.1.2#的最低如表2和表3所示,不同銀杏無(wú)性系枝條的可溶性糖含量差異性顯著(P<0.05)。其中17#的可溶性糖含量最高,為2.78mg/gFW,39#的最低,為1.52mg/gFW,兩者相差0.83倍。供試的39個(gè)核用無(wú)性系的可溶性糖含量為39#<29#<54#<27#<20#<11#<31#<34#<13#<21#<18#<9#<26#<55#<28#<37#<56#<33#<12#<32#<14#<50#<53#<30#<42#<10#<57#<35#<43#<15#<19#<44#<36#<45#<38#<40#<16#<41#<17#。2.1.3#的最低生活由表2和表3可知,不同銀杏無(wú)性系枝條的可溶性蛋白含量差異性顯著(P<0.05)。其中16#的可溶性蛋白含量最高,為9.19mg/gFW,39#的最低,為4.33mg/gFW,兩者相差1.12倍。供試的39個(gè)核用無(wú)性系的可溶性蛋白含量由低到高的順序(表2)是39#、29#、20#、27#、11#、37#、13#、31#、33#、54#、12#、21#、28#、14#、26#、34#、50#、32#、9#、30#、56#、55#、35#、18#、43#、42#、57#、19#、40#、10#、36#、53#、44#、17#、45#、15#、38#、41#、16#。2.1.4無(wú)性系的sod活性如表2和表3所示,不同銀杏無(wú)性系枝條的SOD活性差異不顯著(P>0.05)。其中38#無(wú)性系的SOD活性最高,為323.52U/gFw,54#無(wú)性系的最低,僅為84.12U/gFw。供試的39個(gè)核用無(wú)性系的SOD活性的順序(表2)是38#>41#>16#>36#>17#>40#>35#>45#>15#>44#>53#>19#>42#>57#>10#>34#>30#>43#>12#>55#>32#>50#>26#>56#>9#>18#>21#>28#>14#>33#>20#>37#>13#>29#>27#>39#>11#>31#>54#。其他抗寒指標(biāo)不再一一詳述,詳見(jiàn)文獻(xiàn)5。對(duì)其他抗寒指標(biāo)進(jìn)行方差分析,結(jié)果表明,39個(gè)銀杏無(wú)性系的失水率、H2O2含量、MDA含量的差異性均達(dá)到極顯著性平(見(jiàn)表3),相對(duì)電導(dǎo)率、淀粉含量的差異性顯著,而游離脯氨酸含量、POD活性、·O2-產(chǎn)生速率的差異性不顯著。2.2抗寒性指標(biāo)檢測(cè)對(duì)39個(gè)銀杏無(wú)性系的12個(gè)抗寒指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)分析,其抗寒生理化指標(biāo)的相關(guān)陣(見(jiàn)表4)。由表4可知,半致死溫度與可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、Pro含量、SOD活性、POD活性呈極顯著負(fù)相關(guān),失水率、電導(dǎo)率、·O2-產(chǎn)生速率、H2O2和MDA含量與半致死溫度呈極顯著正相關(guān),說(shuō)明銀杏枝條在冰凍脅迫下通過(guò)增加保護(hù)酶(SOD、POD)活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(可溶性糖、蛋白質(zhì)和Pro)含量,來(lái)降低膜脂的過(guò)氧化(MDA),維持膜的穩(wěn)定性(相對(duì)電導(dǎo)率),從而提高銀杏的抗寒性。另外,SOD和POD活性分別與·O·-產(chǎn)生速率和H2O2含量呈極顯著負(fù)相關(guān),而H2O2含量與MDA含量則呈極顯著正相關(guān),表明冰凍低溫下銀杏枝條通過(guò)保護(hù)酶活性的提高,降低活性氧在體內(nèi)的積累,防止膜脂的過(guò)氧化作用。2.3銀杏抗寒性指標(biāo)構(gòu)成采用主成分分析方法,對(duì)39個(gè)銀杏無(wú)性系進(jìn)行抗寒性指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)。主成分分析的數(shù)據(jù)由表5和表6提供。根據(jù)累積貢獻(xiàn)率≥85.00%的標(biāo)準(zhǔn),本研究中有3個(gè)主成分入選,其累積貢獻(xiàn)率為86.18%,前3個(gè)主成分已反映了12個(gè)抗寒指標(biāo)的絕大部分信息,因此,只需討論前3個(gè)主成分即可。由表6可見(jiàn),第一主分量中X4、X5、X6、X7、X8、X9為正向載荷,Xl,X2、X3、X10、X11、X12為負(fù)向載荷,各指標(biāo)對(duì)第一主分量的貢獻(xiàn)較為均勻,表明第一主分量是反映銀杏無(wú)性系在低溫下生理生化發(fā)生逆變的綜合指標(biāo)。銀杏枝條在低溫脅下通過(guò)增強(qiáng)抗氧化能力(提高SOD、POD活性)和滲透調(diào)節(jié)能力(可溶性糖、Pro、可溶性蛋白質(zhì)含量增加),來(lái)降低膜脂的過(guò)氧化(MDA),維持膜的穩(wěn)定性(相對(duì)電導(dǎo)率),從而提高銀杏的抗寒性。第二主分量主要反映了失水率與抗寒性的關(guān)系。第三主分量主要反映了枝條電導(dǎo)率和淀粉含量與抗寒性的關(guān)系。2.4其他抗寒力指標(biāo)選用前兩個(gè)主成分得分值繪制二維坐標(biāo)圖(見(jiàn)圖1)。根據(jù)二維坐標(biāo)圖,39個(gè)銀杏無(wú)性系抗寒性強(qiáng)弱可劃分為3大類:第一類,抗寒性強(qiáng){16#、41#、36#、45#、19#、17#、38#、40#};第二類,抗寒性較強(qiáng){35#、10#、42#、57#、44#、43#、53#、15#};第三類,抗寒性中等{9#、26#、13#、30#、50#、18#、56#、33#};第四類,抗寒性弱{11#、29#、20#、31#、54#、12#、27#、37#、32#、55#、34#、14#、21#、28#、39#}。對(duì)上述4類無(wú)性系的指標(biāo)進(jìn)行分析,第一、二類,尤其是第一類,具有較好的保水能力、抗氧化能力和滲透調(diào)節(jié)能力,從而表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗寒力,其中第一類具有在高緯度地區(qū)推廣試驗(yàn)的潛力。第三類,相對(duì)電導(dǎo)率和H2O2含量最高,推測(cè)高水平的H2O2,破壞了膜的半透性,造成低溫脅迫下枝條中內(nèi)含物的大量外滲,表現(xiàn)為相對(duì)電導(dǎo)率很高,致使該類抗寒性較差。第四類,保水能力、抗氧化能力和滲透調(diào)節(jié)能力均較差,從而表現(xiàn)出較差的抗寒性。2.5無(wú)性系抗寒力大小及順序表7列出了39個(gè)銀杏無(wú)性系的主成分值和表5列出的貢獻(xiàn)率,根據(jù)公式Σin=1AjBj(A:主成分貢獻(xiàn)率,B:銀杏無(wú)性系主成分值,j:1～3,n:39),可求出39個(gè)無(wú)性系抗寒性大小及抗寒力順序(見(jiàn)表8)。39個(gè)銀杏無(wú)性系抗寒力的順序如下:16#>38#>17#>40#>41#>36#>45#>15#>53#>44#>19#>42#>57#>10#>35#>18#>50#>55#>32#>26#>12#>30#>56#>9#>13#>34#>12#>37#>14#>33#>54#>20#>28#>11#>31#>27#>29#>39#。3滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)銀杏抗氧化指標(biāo)的影響在冰凍低溫下,如何有效的避免胞內(nèi)結(jié)冰是林木抵抗冰凍脅迫的第一步。低溫脅迫下,植物體的抗寒性越強(qiáng),可溶性蛋白含量也越高?？扇苄蕴悄軌驕p少低溫對(duì)細(xì)胞的傷害,在低溫下討論可溶性糖含量時(shí),常常提及可溶性蛋白含量,它們常作為鑒定植物抗寒性的指標(biāo)。植物體內(nèi)游離脯氨酸對(duì)機(jī)體器官具有保護(hù)作用,可作為植物抗寒性測(cè)定的指標(biāo)。許多研究表明,這些物質(zhì)具有降低細(xì)胞的滲透勢(shì)和組織冰點(diǎn),穩(wěn)定膜系統(tǒng),保護(hù)蛋白質(zhì)和調(diào)節(jié)抗性基因表達(dá)等多方面的作用,與抗寒性變化密切相關(guān)。本研究表明,越冬過(guò)程中,銀杏枝條主動(dòng)轉(zhuǎn)化生成大量的可溶性糖、Pro等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),調(diào)節(jié)細(xì)胞中滲透勢(shì),降低組織冰點(diǎn),保護(hù)蛋白質(zhì)。同時(shí)低溫誘導(dǎo)抗寒基因的表達(dá),合成了大量與抗寒相關(guān)的蛋白類物質(zhì),如抗寒蛋白、抗寒調(diào)控性酶類,造成可溶性蛋白質(zhì)含量的增加。低溫脅迫會(huì)使植物體自由基產(chǎn)生速率升高、清除劑含量降低、清除酶類的活性不均衡的降低,植物細(xì)胞內(nèi)活性氧的積累,引發(fā)膜脂過(guò)氧化、交聯(lián)蛋白質(zhì)和攻擊DNA等,而且其氧化產(chǎn)物多會(huì)對(duì)植物造成嚴(yán)重的傷害。大量研究表明,低溫鍛煉可誘導(dǎo)植物體內(nèi)活性氧清除酶類的活性提高或增加其在低溫下的穩(wěn)定性,提高體內(nèi)的活性氧清除劑,如SOD、POD、GSH活性,從而有效地避免活性氧對(duì)蛋白尤其是酶蛋白傷害。本研究表明,低溫脅迫下銀杏體內(nèi)保護(hù)酶類,SOD、POD等活性升高,有效地清除活性氧自由基的產(chǎn)生,維持較好的活性氧代謝平衡,且酶活性高的無(wú)性系其抗寒性強(qiáng),這與闡文靖等的研究結(jié)果一致。綜上所述,部分銀杏無(wú)性系的枝條在低溫脅下能夠通過(guò)增強(qiáng)抗氧化能力(提高SOD、POD活性)和滲透調(diào)節(jié)能力(可溶性糖、Pro、可溶性蛋白質(zhì)含量增加),來(lái)降低膜脂的過(guò)氧化(MDA),維持膜的穩(wěn)定性(相對(duì)電導(dǎo)率),表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗寒性。39個(gè)銀杏無(wú)性系枝條抗寒性的順序是16