有機(jī)碳源對nannocsloropsissp生長及光合作用的影響

1胞超微型藻的生長和活性多醇脂肪酸（pea）對營養(yǎng)和醫(yī)學(xué)產(chǎn)生了重要影響。特別是20碳5烯酸（epa）和22碳6烯酸（da）對預(yù)防和治療心臟疾病、動脈疾病、癌癥、風(fēng)病、哮喘和糖尿病等人類疾病方面發(fā)揮了明顯的作用。Nannochloropsissp.是從中國東海海域采集并分離得到的一種黃綠色單細(xì)胞超微型藻(品系為PP983),經(jīng)鑒定它是真眼點藻綱的一個新種.該藻是一種光自養(yǎng)微生物,對溫度具有很好的適應(yīng)能力且是廣鹽性種類,在天然海水中可較好地生長.在溫度為25oC和6860lx的光照條件下培養(yǎng)的藻細(xì)胞,對數(shù)生長期的蛋白質(zhì)含量高達(dá)40.2%,脂肪含量為25.0%,碳水化合物的含量為11.1%(ω).該藻的總可提取脂肪酸量為156.10mg/g(干重,DW),多不飽和脂肪酸中EPA是主要成份,占總可提取脂肪酸的22.94%,有望成為EPA產(chǎn)品生產(chǎn)的重要生物資源.微藻的生化組成很大程度受外源營養(yǎng)的影響,碳幾乎占藻細(xì)胞干重的50%,是細(xì)胞的主要組成成份.微藻一般采用光自養(yǎng)的營養(yǎng)方式,但許多微藻同時具有利用有機(jī)碳源即混合營養(yǎng)生長的能力,同時進(jìn)行自養(yǎng)和外源有機(jī)碳的異養(yǎng)代謝,為細(xì)胞的生長補(bǔ)充碳源和能量,提高培養(yǎng)體系中的細(xì)胞密度和代謝產(chǎn)物濃度,縮短培養(yǎng)時間,降低微藻生長對光照的要求,有利于微藻的大規(guī)模培養(yǎng).本研究主要考察外源有機(jī)碳源對Nannochloropsissp.生長與光合作用的影響,為該微藻的大規(guī)模工業(yè)化培養(yǎng)提供理論依據(jù).2材料和方法2.1藻類和繁殖2.1.1藻類藻類Nannochloropsissp.由中國科學(xué)院水生生物研究所贈送,經(jīng)平板劃線法反復(fù)純化,至鏡檢和平板檢測不再發(fā)現(xiàn)有細(xì)菌為止.2.1.2不同有機(jī)碳源對生長的影響采用改進(jìn)的f/2培養(yǎng)基,分別加入濃度為30mmol/L的葡萄糖、乙醇、乙酸鈉、乙酸、草酸、甘氨酸,以研究不同有機(jī)碳源對生長的影響;分別加入濃度為20,30,40,60,120mmol/L的葡萄糖,以研究不同葡萄糖濃度對生長的影響.2.1.3b接種量培養(yǎng)實驗在HZQ-Q光照搖床(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)公司)中進(jìn)行,搖床轉(zhuǎn)數(shù)為120r/min.培養(yǎng)溫度為(23±0.2)oC,采用日光燈為光源,連續(xù)光照,瓶口處光照強(qiáng)度為4984.1lx.250ml三角瓶裝液量為150ml,初始接種濃度為63.01mg/L(干重).2.2藻液光密度測定用UV755B紫外可見光柵分光光度計(上海精密科學(xué)儀器公司)測定665nm處藻液光密度,每天測定1次,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸公式Y(jié)(生物量干重)=923.46OD665nm+17.923換算成藻生物量干重.2.3葡萄糖含量測定用葡萄糖乳酸生化分析儀(美國YellowSpringsInstrument,型號YSI2700)測定.2.4呼吸作用測定光合放氧速率由氧電極(英國Hansatech公司)測定,溫度由水浴通過循環(huán)水控制在(23±0.2)oC.取對數(shù)期藻液離心,棄上清液,用新鮮(不加葡萄糖)的f/2培養(yǎng)液重懸,再取2ml置于反應(yīng)池中測定.整個過程由Oxylab程序控制,并記錄數(shù)據(jù),繪制光合作用和呼吸作用曲線.3結(jié)果與討論3.1不同有機(jī)碳源對藻細(xì)胞生長的影響圖1為濃度均為30mmol/L的不同有機(jī)碳源對藻細(xì)胞生長的影響曲線,由圖可見,經(jīng)過1d左右的遲滯期,不同的有機(jī)碳源對Nannochloropsissp.生長產(chǎn)生不同的影響.葡萄糖對藻細(xì)胞生長的影響最顯著,培養(yǎng)8d后,其生物量干重可達(dá)550mg/L,而未加碳源的藻細(xì)胞的生物量干重為392mg/L,前者是后者的1.4倍.乙醇對細(xì)胞的生長有一定的促進(jìn)作用,培養(yǎng)8d后生物量干重可達(dá)490mg/L,是光自養(yǎng)培養(yǎng)的藻細(xì)胞生物量的1.25倍.乙酸鈉對細(xì)胞的增殖沒有明顯的促進(jìn)作用.乙酸、草酸、甘氨酸等有機(jī)碳源抑制藻細(xì)胞的生長.由此表明,Nannochloropsissp.具有一定的利用有機(jī)碳源的能力,不同的有機(jī)碳源對藻細(xì)胞生長的影響不同,葡萄糖可顯著促進(jìn)藻細(xì)胞生長.3.2不同葡萄糖濃度對藻細(xì)胞增殖速率的影響圖2為葡萄糖濃度對藻細(xì)胞生長的影響,由圖可見,葡萄糖濃度為30mmol/L時,藻細(xì)胞生長最快,生物量干重為550mg/L,是未加葡萄糖的1.4倍.過高、過低的葡萄糖濃度均使藻細(xì)胞增殖速率下降.3.3生長曲線和葡萄糖濃度初始葡萄糖濃度為30mmol/L(即為5.4g/L)的混合營養(yǎng)培養(yǎng)過程中,葡萄糖濃度隨培養(yǎng)時間變化及相應(yīng)的藻細(xì)胞生長曲線見圖3.由圖可看出,在培養(yǎng)的第1～6d,葡萄糖濃度呈直線下降,其平均消耗速率可達(dá)0.11g/(L?d),到第6d后下降緩慢,這與細(xì)胞在不同階段的生長相對應(yīng).在生長對數(shù)期細(xì)胞分裂增殖速度較快,所需要的碳源和能量較多,因而葡萄糖消耗較快;而在生長后期,細(xì)胞處于穩(wěn)定期,分裂增殖速度降低,因而葡萄糖的消耗降低,此時主要由光子提供的能量維持其生長.3.4作用參數(shù)的測定光合作用是藻細(xì)胞維持其生長與繁殖的重要的生理活動.本實驗考察了該藻細(xì)胞在自養(yǎng)和葡萄糖濃度為30mmol/L的混養(yǎng)條件下的光合放氧和呼吸耗氧情況,并推算了兩種培養(yǎng)條件下的其它光合作用參數(shù),見圖4及表1.由圖表可見,在自養(yǎng)和混養(yǎng)條件下,Nannochloropsissp.最大凈光合放氧量幾乎不變,而呼吸耗氧量相差較大,在混養(yǎng)條件下的呼吸耗氧量高于自養(yǎng)條件,所以Nannochloropsissp.對葡萄糖的分解利用可能是通過糖酵解和三羧酸循環(huán)途徑進(jìn)行的.由于混養(yǎng)條件下Nannochloropsissp.對葡萄糖的分解利用產(chǎn)生了能量,用于維持藻細(xì)胞的生長與繁殖,降低了對光能的依賴性,所以混養(yǎng)條件下的光飽和點低于光自養(yǎng)條件;而混養(yǎng)條件下呼吸作用旺盛,呼吸作用消耗的物質(zhì)較多,所以混養(yǎng)條件下的光補(bǔ)償點高于自養(yǎng)條件.4不同有機(jī)碳源對藻細(xì)胞生長的影響Nannochlorop