ICS

.CCS

C

DB

.

新型冠狀病毒檢測(cè)技術(shù)規(guī)范

部分污水樣本病毒富集濃縮和檢測(cè)

SARS?COV?

PART

CONCENTRATION

AND

SEWAGE

SAMPLES--

發(fā)

布 --

實(shí)

施DB

.目 前言

……………………………Ⅲ1

范圍

…………………………12

規(guī)范性引用文件

……………13

術(shù)語和定義

…………………14

檢出限與回收率

……………15環(huán)境與設(shè)施

…………………16

設(shè)備與耗材

…………………27

試劑與材料

…………………28

污水樣本富集濃縮

…………………………29

核酸檢測(cè)

……………………310

標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立……………311

污水新冠病毒濃度定量……………………312

回收率計(jì)算…………………313質(zhì)量控制……………………414

結(jié)果與報(bào)告…………………4DB

.本文件按照

GB/T

—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第

1

部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)規(guī)定起草。本

文

件

是

DB32/T

3762《新

型

冠

狀

病

毒

檢

測(cè)

技

術(shù)

規(guī)

第

21

部

分

。

DB32/T

3762

已

經(jīng)

發(fā)

布

了

以下部分：——第

1

部分：生物樣本采集、運(yùn)輸和保存；——第

2

部分：病毒分離與鑒定；——第

3

部分：核酸熒光

PCR

檢測(cè)程序；——第

4

部分：重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增程序；——第

5

部分：血清

IGM

和

IGG

抗體酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)程序；——第

6

部分：血清

IGM

和

IGG

抗體膠體金免疫層析檢測(cè)程序；——第

7

部分：空氣樣本檢測(cè)與評(píng)估；——第

8

部分：物體表面檢測(cè)與評(píng)估；——第

9

部分：醫(yī)務(wù)人員職業(yè)暴露檢測(cè)與評(píng)估；——第

10

部分：微量血清中和試驗(yàn)；——第

11

部分：全基因組高通量測(cè)序；——第

12

部分：藥物體外抗病毒效果測(cè)定；N——第

13

部分：疊氮溴化丙錠-熒光

PCR

檢測(cè)程序；N——第

14

部分：

亞基因組熒光

PCR

檢測(cè)程序；——第

15

部分：血清血漿

IGM

和

IGG

抗體磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)程序；——第

16

部分：核酸數(shù)字

PCR

法；——第

17

部分：核酸檢測(cè)用假病毒陽性質(zhì)控品；——第

18

部分：規(guī)?；怂釞z測(cè)程序；——第

19

部分：全自動(dòng)核酸快速一體化檢測(cè)；——第

20

部分：核酸熒光

PCR

檢測(cè)質(zhì)量控制；——第

21

部分：污水樣本病毒富集濃縮和檢測(cè)。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由江蘇省衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)提出并歸口。本文件起草單位：江蘇省疾病預(yù)防控制中心、北京大學(xué)分子工程蘇南研究院、蘇州市疾病預(yù)防控制中心、無錫市疾病預(yù)防控制中心、揚(yáng)州市疾病預(yù)防控制中心、常熟市疾病預(yù)防控制中心、未名環(huán)境分子診斷限公司、南京醫(yī)科大學(xué)。本文件主要起草人：丁震、周波、彭世富、李喜青、鄭浩、張瑜、沈強(qiáng)、肖勇、徐勤、周正元、馮微宏、袁軒、管紅霞、李鑫娜、龔利強(qiáng)、朱寶立、徐燕、朱媛園、王蕊。DB

.新型冠狀病毒檢測(cè)技術(shù)規(guī)范

污水樣本病毒富集濃縮和檢測(cè)

范圍本文件規(guī)定了污水樣本中新型冠狀病毒富集濃縮和檢測(cè)方法。本文件適用于生活、醫(yī)療、商業(yè)和工業(yè)等污水樣本中的新型冠狀病毒的濃縮富集和檢測(cè)。

規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版括所有的修改用于本文件。GB

19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求WS/T

799—2022污水中新型冠狀病毒富集濃縮和核酸檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)

術(shù)語和定義以下術(shù)語和定義適用于本文件。.裂解法

METHOD利用裂解鹽使污水中病毒核酸與蛋白分離，高鹽條件下的污水通過濾膜，其核酸樣本被膜吸附，完成富集過程，利用低鹽條件將吸附的核酸樣本從膜上洗脫，再進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)分析。.回收率 RECOVERY

濃縮富集后回收樣本的總拷貝數(shù)與原污水樣品中接種的病毒總拷貝數(shù)之比。

檢出限與回收率N富集濃縮采用裂解法時(shí)，方法的檢出限為

1

COPY/ML，

靶標(biāo)的回收率為

16%^65%，ORF1AB

靶標(biāo)N的回收率為

10%^48%。環(huán)境與設(shè)施富集濃縮和檢測(cè)等操作應(yīng)在生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室（BSL?2）進(jìn)行，同時(shí)采用不低于生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室的個(gè)人防護(hù)。實(shí)驗(yàn)過程中產(chǎn)生的所有廢棄括剩余水應(yīng)經(jīng)有效滅菌后再按醫(yī)療廢棄物進(jìn)行分類處理。新冠病毒核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)滿足

GB

19489。DB

.

設(shè)備與耗材.

設(shè)備12生物安全柜、移液10

μL、50

μL、200

μL、

ML）、電動(dòng)移液器、冷凍離心4

℃、

ML

轉(zhuǎn)12

度

≥0.01）、水

浴

鍋

、多

孔

真

空

抽

濾

裝

置

、滾

軸

搖

勻

儀

、電

子

天

辨

力

不

低

于

G）、實(shí)

時(shí)

熒

光定量

PCR

儀或數(shù)字

PCR

儀。.

耗材N95

及以上防護(hù)口罩、醫(yī)用無紡布帽、護(hù)目鏡、連體防護(hù)服、一次性

PE

手套、一次性手術(shù)衣、乳膠手套、防水靴套。

試劑與材料.

試劑（氯化鈉（NACL，分子生物學(xué)級(jí)）、無核酸酶子生物學(xué)級(jí)）、乙醇（70%）、TE

緩沖液（1

MOL/L

，（100

MMOL/L

EDTA）

配制方法：稱取

G

三羥甲基氨基甲烷（，純度≥99%），

G

乙二胺四乙酸二度≥99%），置于燒杯中，加入

70

ML

水，攪拌溶解后轉(zhuǎn)移至試劑瓶中，用鹽酸將

PH

調(diào)至

，定容至

100

ML）。.

材料1無菌錐形100

ML）、無菌無核酸酶帶蓋離心50

ML）、無菌無核酸酶移液器吸10

μL、1200

μL、

ML，帶濾芯）、一次性玻璃纖維膜（1

）、無菌注射器（50

ML）、核酸富集柱、無菌無核酸酶帶蓋離心管（

ML）、增量管（25

ML）、擴(kuò)

污水樣本富集濃縮.

樣本滅活樣本滅活按照

WS/T

799—2022

中第

6

章執(zhí)行。.

預(yù)過濾用大容量電動(dòng)移液器移取

40

ML

滅活后的污水樣本于

50

ML

無菌離心管中，加入

G

NACL

和400

μL

TE

緩沖液，使用滾軸搖勻儀震蕩混合，直至

NACL

固體完全溶解。多孔真空抽濾裝置上依次接1

玻璃纖維膜和

50

ML

注射器套管，無菌錐形瓶放置于真空抽濾裝置內(nèi)對(duì)應(yīng)位置。打開真空泵，在負(fù)壓條件下將上述樣品過濾收集到無菌錐形瓶中。關(guān)掉真空泵，打開閥門釋放壓力，取出錐形瓶，在濾液中加入

40

ML

70%

乙醇，振蕩搖勻，室溫靜置

5

MIN。，完；未，促

NACL

CWW

=

CS×

V

CWW

=

CS×

VN×

VC.

富集濃縮多孔真空抽濾裝置上依次連接核酸富集柱、增量管。打開真空泵，形成負(fù)壓。將濾液與乙醇混合樣混勻后，倒入增量管中，通過核酸富集柱完成濃縮步驟。，過，可，完，同有的核酸富集柱的洗脫液作為該污水樣本的濃縮液。.

洗脫待樣品濃縮完成后，關(guān)掉真空泵，打開閥門釋放壓力，回收核酸富集柱。核酸富集柱置入配套離心管4中，將無核酸酶水加入到柱膜中間，靜置

3

MIN^5

MIN

后，

℃條件下

12

000

R/MIN

離心

1

MIN，收集洗脫4液，最終獲得的洗脫液即為該污水樣本的濃縮液。后續(xù)可依據(jù)病毒核酸提取試劑盒說明完成提取步驟。，確，兩，如，濃

℃；或-80

℃

核酸檢測(cè)富集濃縮后樣本的新冠病毒核酸檢測(cè)按照

WS/T

799—2022

中第

8

章執(zhí)行。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立污水中病毒核酸的濃度需通過標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行換算。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣本應(yīng)與目標(biāo)實(shí)驗(yàn)的樣本匹配，2即相

同的

總

RNA

樣本

。

標(biāo)準(zhǔn)

曲線

分析

的稀

釋范圍

或動(dòng)

態(tài)范

圍應(yīng)

涵蓋實(shí)

驗(yàn)樣

本預(yù)

期的濃

度范

圍

。

本文2件中可選用新冠病毒核酸基因組標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。將已知病毒核酸濃度的樣本進(jìn)行連續(xù)

10

倍或5

倍梯度稀釋，設(shè)置至少

6

個(gè)濃度梯度，每個(gè)濃度至少做

3

個(gè)樣本平行，

個(gè)擴(kuò)增平行。以已知的連續(xù)稀釋濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，該濃度對(duì)應(yīng)的

CT

值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)滿足

R2≥0.99，擴(kuò)增效率在

90%^110%

之間。

污水新冠病毒濃度定量S當(dāng)污水樣品判定為新冠核酸陽性后

，可使用數(shù)字

PCR

儀完成上機(jī)前核酸樣本濃度

CS的絕對(duì)定量

；S如

使

用

實(shí)

時(shí)

熒

光

定

量

PCR

儀

檢

測(cè)，可

使

用

標(biāo)

準(zhǔn)

曲

線

完

成

定

量

工

作

。

濃

縮

處

理

前

污

水

體

積

為

VS

ML，富集后濃縮液體積為

VC

μL，從濃縮液中取出

VEμL

進(jìn)行核酸提取，得到的核酸體積為

VNμL，對(duì)該核酸樣本進(jìn)行

RT?QPCR

分析，通過建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，將樣本檢出

CT值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線公式，換算為提取后的核酸濃度

C（μL），污水中新冠病毒濃度

CWW（COPIES/ML）按公式（1）計(jì)算：VS×

VE …………（1）、污、病，在，難，故

回收率計(jì)算將已知濃度的新冠病毒假病毒加入到

40

ML

污水中，混合搖勻。后續(xù)步驟與污水樣本檢測(cè)操作保持一致，完成富集濃縮、提取和擴(kuò)增步驟，以該樣本的

CT值換算污水中新冠病毒濃度

CWW位為

COPIES/ML），濃C0×

V0

×

C0×

V0

×