高效液相色譜法測(cè)定煙草中二甲基二硫代氨基甲酸酯類農(nóng)藥

氨基二硫酸酯（tdbs）農(nóng)藥是一種重要的殺菌劑。根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)，可分為二甲基二硫酸酯（sd）、二硫酸酯（aes）和丙二硫酸酯（pbd）。二甲基二硫代氨基甲酸酯類是近年來(lái)在我國(guó)煙草生產(chǎn)中經(jīng)常使用的種類,主要包括福美雙、福美鋅和福美鐵,以及乙撐二硫代氨基甲酸酯類中的代森錳鋅等。近年來(lái),煙草中有害物質(zhì)的檢測(cè)研究主要集中于農(nóng)藥、苯并芘等,研究表明二硫代氨基甲酸酯類農(nóng)藥的代謝物可能具有致癌、致畸和致突變等危害。目前關(guān)于二硫代氨基甲酸酯類農(nóng)藥的相關(guān)檢測(cè)報(bào)道主要集中于蔬菜和水果,采用儀器包括液相、氣相、氣質(zhì)聯(lián)用、液質(zhì)聯(lián)用等,而煙草中二硫代氨基甲酸酯類農(nóng)藥的測(cè)定方法較少,國(guó)標(biāo)規(guī)定的方法(GB/T21132-2007)采用分光光度法,文獻(xiàn)報(bào)道采用GC-MS,該方法測(cè)定了二硫代氨基甲酸酯的總量。福美雙、福美鋅和福美鐵的化學(xué)結(jié)構(gòu)十分類似,但福美雙可溶于有機(jī)試劑,而福美鋅和福美鐵微溶于有機(jī)試劑,3種農(nóng)藥經(jīng)常規(guī)的衍生化反應(yīng)后都可衍生成同一種物質(zhì)。因此,本研究首先利用溶劑對(duì)煙草中的福美雙進(jìn)行單獨(dú)提取后,再對(duì)福美鋅和福美鐵進(jìn)行提取,并采用快速準(zhǔn)確的高效液相色譜-柱前衍生法測(cè)定這3種農(nóng)藥的含量。1實(shí)驗(yàn)部分1.1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀2695型高效液相色譜(美國(guó)Waters公司);2487型紫外檢測(cè)器(美國(guó)Waters公司),Hei-VAPValue型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國(guó)Heidolph公司);HY-5型回旋式震蕩儀(江蘇金壇環(huán)宇科學(xué)儀器廠)。福美雙、福美鋅和福美鐵標(biāo)準(zhǔn)品(美國(guó)Sigma公司),碘甲烷(上海市紅太陽(yáng)化工公司),乙二胺四乙酸二鈉(AR),L-半胱氨酸鹽酸鹽、四丁基硫酸氫銨(美國(guó)Sigma公司)。初考煙葉、復(fù)烤煙葉(本單位自制),40℃烘干后粉碎,過(guò)250μm篩。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1福美雙標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的制備(1)樣品提取液配制:稱取2.5gL-半胱氨酸鹽酸鹽、46.73g乙二胺四乙酸二鈉、9gNaOH,500mL水溶解后棕色瓶中備用;(2)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液配制:稱量福美雙標(biāo)準(zhǔn)品20mg,乙腈溶解并定容至100mL,得到200.0mg/L的福美雙標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,-20℃下儲(chǔ)存;稱量福美鋅和福美鐵標(biāo)準(zhǔn)品20mg,用上述樣品提取液溶解并定容至100mL,得到200.0mg/L的福美鋅和福美鐵標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,-20℃下儲(chǔ)存;(3)四丁基硫酸氫銨溶液配制:稱量13.92g四丁基硫酸氫銨,水溶解并定容至100mL,棕色瓶中儲(chǔ)存;(4)衍生化試劑配制:取225mL三氯甲烷、75mL正己烷和1mL碘甲烷,混合后棕色瓶中儲(chǔ)存。1.2.2衍生化劑提取法(1)稱取2.00g煙草樣品于150mL三角瓶中,加入50mL三氯甲烷,振蕩提取30min,濾紙過(guò)濾待用;(2)上述第(1)步中經(jīng)濾紙過(guò)濾后的煙草樣品置通風(fēng)櫥中使三氯甲烷揮發(fā)完全后,加入30mL樣品提取液,振蕩30min后濾紙過(guò)濾,再用20mL提取液提取1次;(3)上述第(2)步中兩次提取的濾液,加入5mL四丁基硫酸氫銨溶液,鹽酸調(diào)pH至7.0,加入40mL衍生化試劑,分液漏斗中劇烈震蕩,靜置30min后取下層有機(jī)相溶液,并加入無(wú)水Na2SO4干燥,30℃下減壓濃縮;(4)取上述第1步的濾液10mL,加入到第(3)步的減壓濃縮瓶中,30℃下減壓蒸干,用2mL甲醇溶解后過(guò)0.22μm有機(jī)濾膜過(guò)濾,待測(cè)。1.2.3標(biāo)準(zhǔn)品的制備福美雙具有紫外吸收,無(wú)需衍生化,福美鋅和福美鐵的衍生方法參照上述1.2.2節(jié)步驟,取適量的福美鋅或福美鐵標(biāo)準(zhǔn),加入30mL樣品提取液,振蕩30min后,加入5mL四丁基硫酸氫銨溶液,鹽酸調(diào)pH至7.0,加入40mL衍生化試劑,分液漏斗中劇烈震蕩,靜置30min后取下層有機(jī)相溶液,減壓濃縮,取適量的福美雙標(biāo)準(zhǔn)加入到上述濃縮物中,一定體積甲醇溶解,0.22μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后得到福美雙、福美鋅和福美鐵的混合標(biāo)樣。1.2.4柱溫、紫外檢測(cè)波長(zhǎng)色譜柱:ShiseidoCAPCELLPAKMGⅡC18(4.6×250mm,5μm);柱溫:35.0℃;紫外檢測(cè)波長(zhǎng):235nm,270nm;流動(dòng)相比例:V(甲醇):V(水)=48∶52;流速:1.0mL/min;進(jìn)樣量:10.0μL。2結(jié)果與討論2.1衍生化產(chǎn)物的檢測(cè)機(jī)理3種農(nóng)藥在堿性乙二胺四乙酸二鈉溶液中以二鈉鹽的形態(tài)存在,通過(guò)碘甲烷的衍生化可在二鈉鹽上引入甲基,且具有紫外吸收,利用四丁基硫酸氫銨可使衍生化產(chǎn)物由水相轉(zhuǎn)移到有機(jī)相中,并通過(guò)HPLC分離后進(jìn)行檢測(cè),反應(yīng)機(jī)理如圖1所示。按照上述反應(yīng)機(jī)理可測(cè)定福美雙、福美鋅和福美鐵的總量,但福美雙的結(jié)構(gòu)中不含有金屬鹽,能夠溶解于有機(jī)試劑,且在紫外下有吸收,因此,福美雙可通過(guò)液相色譜-紫外檢測(cè)器直接分析檢測(cè);而福美鋅和福美鐵可通過(guò)上述衍生化反應(yīng)后測(cè)定兩者的總量。2.2檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇分別研究了福美雙在235和270nm下的紫外響應(yīng)情況,結(jié)果表明,福美雙在235nm下具有較好的響應(yīng),因此選擇235nm作為福美雙的檢測(cè)波長(zhǎng)。此外,研究了235和270nm下福美鋅和福美鐵的衍生化產(chǎn)物的紫外響應(yīng)情況,結(jié)果表明,福美鋅/福美鐵的衍生化產(chǎn)物在270nm下具有較好的響應(yīng),因此選擇270nm作為福美鋅/福美鐵衍生化產(chǎn)物的檢測(cè)波長(zhǎng)。2.3福美雙和福美鋅/福美鐵衍生物tr比較比較了甲醇-水和乙腈-水兩種流動(dòng)相體系,當(dāng)V(甲醇):V(水)=48∶52時(shí),可使福美雙和福美鋅/福美鐵衍生物基線分離,且峰形較好,此條件下福美鋅/鐵的衍生物tR=14.3min,福美雙tR=16.5min,如圖2所示。2.4提取福美雙的有效指標(biāo)由于福美雙可溶于有機(jī)試劑,福美鋅和福美鐵不溶于有機(jī)試劑而可溶于鹽溶液中,因此首先利用有機(jī)溶劑對(duì)煙草中的福美雙進(jìn)行單獨(dú)提取后,再采用鹽溶液對(duì)福美鋅和福美鐵進(jìn)行提取,以5μg/g的添加量回收率為考察指標(biāo),分別考察了50mL有機(jī)溶劑(包括乙腈、丙酮、甲苯、甲醇、二氯甲烷、三氯甲烷)、50mL堿性有機(jī)溶劑(48mL上述有機(jī)溶劑+2mL飽和NaOH溶液)和50mL堿性乙二胺四乙酸二鈉鹽溶液對(duì)這3種農(nóng)藥的提取效果。結(jié)果表明,乙腈、甲苯、三氯甲烷、堿性乙腈溶液和堿性三氯甲烷溶液能夠提取出福美雙,其中三氯甲烷對(duì)于福美雙的提取效果最好,回收率可達(dá)85%;而堿性乙二胺四乙酸二鈉鹽溶液可提取出福美鋅和福美鐵,回收率分別達(dá)到95%和92%。因此本研究中首先采用三氯甲烷對(duì)煙草中福美雙進(jìn)行提取,再采用堿性乙二胺四乙酸二鈉鹽溶液對(duì)福美鋅和福美鐵進(jìn)行提取。2.5提取時(shí)間的確定以5μg/g添加量的回收率為考察指標(biāo),研究了振蕩時(shí)間為10,20,30,40和50min下的回收率,結(jié)果表明,隨著振蕩時(shí)間的增長(zhǎng),3種農(nóng)藥的提取率增大,30min時(shí)達(dá)到最大,其后的提取率變化較小,因此選擇30min作為提取時(shí)間。2.6存在于有機(jī)溶劑中的衍生物對(duì)復(fù)配體系的促進(jìn)一些基質(zhì)復(fù)雜的煙草樣品在衍生化后得到的有機(jī)相中可能含有少量粘稠物質(zhì),加入的無(wú)水NaSO4可吸收有機(jī)相中的水分,還可吸附有機(jī)相中的粘稠物質(zhì),使得到的有機(jī)相較澄清,雖然在前面的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中進(jìn)行了前處理的優(yōu)化選擇,但加入無(wú)水Na2SO4可得到更好的實(shí)驗(yàn)效果。有文獻(xiàn)提出經(jīng)衍生化的有機(jī)溶液在蒸干前要加入一定量的1,2-丙二醇/二氯甲烷混合溶液。本實(shí)驗(yàn)中比較了添加1,2-丙二醇/二氯甲烷混合溶液與不添加的效果,結(jié)果表明兩種處理的效果相近,且對(duì)衍生化的結(jié)果無(wú)影響,因此衍生化后的有機(jī)溶液無(wú)需加入1,2-丙二醇/二氯甲烷。2.7方法評(píng)估2.7.1線性回歸法確定檢出限和定量限將不同濃度的3種農(nóng)藥按上述操作進(jìn)行,以峰面積對(duì)3種農(nóng)藥的濃度進(jìn)行線性回歸,分別以3倍和10倍信噪比確定檢出限和定量限。結(jié)果見(jiàn)表1。2.7.2平均加標(biāo)回收率以初烤煙葉、復(fù)烤煙葉為研究對(duì)象,分別以0.2,1,5μg/g為3個(gè)添加量,每個(gè)做6次平行試驗(yàn),計(jì)算平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。由表2可知,3種農(nóng)藥的平均回收率范圍為80%~97%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為1.1%~6.4%。2.8其他