版中國藥典微生物限度檢查方法驗證方案名師資料合集（完整版）資料(可以直接使用，可編輯優(yōu)秀版資料，歡迎下載）

版中國藥典微生物限度檢查方法驗證方案名師資料合集（完整版）資料(可以直接使用，可編輯優(yōu)秀版資料，歡迎下載）人工牛黃甲硝唑膠囊微生物限度檢查方法驗證方案起草部門：QC組簽名：日期：審核部門：QC組簽名：日期：部門：質量部簽名：日期：批準質量負責人簽名：日期：質量部頒發(fā)本文件根據需要應分發(fā)于以下部門：01質量部下表用于記錄修訂/變更主要內容及歷史。文件編號修訂原因修訂日期TS-VP-4201-00按GMP（2021年修訂版）要求新制定

目錄1.概述2.驗證目的和范圍3.組織及職責4.驗證進度計劃表5.驗證所需要的儀器設備及相關文件的確認6.驗證所需要的菌種、培養(yǎng)基、檢驗樣品的確認7.驗證項目和驗證方法7.1試驗菌株7.2需氧菌總數檢查、霉菌和酵母菌總數檢查方法驗證的菌液制備7.3需氧菌總數檢查、霉菌和酵母菌總數檢查方法驗證--常規(guī)傾注平皿法7.4需氧菌總數檢查方法驗證—離心沉淀-薄膜過濾法7.5控制菌檢查方法驗證—離心沉淀-薄膜過濾法8.偏差與漏項控制9.驗證報告會審

1.概述我公司生產品種人工牛黃甲硝唑膠囊，產品微生物限度檢查項目為需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數、以及大腸埃希菌檢查和沙門菌檢查。參照《中國藥典》2021版四部附錄1105：微生物計數法，以及1106：控制菌檢查法的規(guī)定，本公司對該產品的微生物限度檢查方法予以驗證。通過驗證以確認所采用的微生物限度檢查方法適用。人工牛黃甲硝唑膠囊處方中含有甲硝唑、人工牛黃以及常用輔料成分，文獻資料介紹甲硝唑對細菌有抑菌特性，對霉菌和酵母菌無抑菌活性。甲硝唑在水中微溶，可以通過離心沉淀-薄膜過濾法去除其對微生物生長的影響。本驗證方案通過試驗菌株的回收率測試，首先確認常規(guī)傾注平皿法是否適用于本品的微生物限度檢查；如常規(guī)傾注平皿法不適用，則進一步驗證可去除供試品抑菌物質的離心沉淀-薄膜過濾法是否適用于本品的微生物限度檢查。本驗證方案根據樣品特性制定微生物限度檢查方法和檢驗條件，按制定的方法進行試驗，根據驗證結果判斷是否符合驗證標準。2.驗證目的和范圍驗證該產品的微生物限度檢查方法的適用性，對其有效性進行評價，保證檢驗結果的可靠性。本驗證方案采用3批按GMP要求組織生產的人工牛黃甲硝唑膠囊，進行微生物限度檢查方法的驗證。3.組織及職責3.1驗證方案和驗證報告的起草、審核、批準驗證方案由質量部QC組負責起草，由質量部審核，最終由質量負責人批準。驗證方案實施完成后，由QC組負責匯總微生物限度檢查法驗證的結果、撰寫報告，由質量部審核，最終由質量負責人批準報告。3.2驗證方案的培訓驗證方案在經質量負責人批準后，，由QC組組長對本次驗證實施的相關人員組織培訓工作，并將該次的培訓記錄歸檔。3.3驗證方案實施過程中的變更和偏差驗證方案實施過程中如有變更和偏差，質量負責人應當組織進行評估并采取相應的控制措施。3.4驗證工作小組成員表姓名部門及職務職責黃漢新質量負責人/質量受權人負責驗證方案及報告的批準胡建新質量部QA組長審核驗證方案、審核驗證報告并協(xié)調工作曾鳳敏質量部QC組長負責驗證方案審核、實施、匯總報告及培訓工作劉紅華質量部QC負責驗證方案起草、具體實施、報告工作4.驗證進度計劃表本次微生物限度檢查方法驗證的計劃安排時間是2021年12月至2021年1月。5.驗證所需要的儀器設備及相關文件的確認序號儀器設備名稱型號編號校準單位校準日期有效期至1電子天平2生化培養(yǎng)箱3生化培養(yǎng)箱4生化培養(yǎng)箱5立式壓力蒸汽滅菌鍋6生物潔凈安全柜檢查人/日期：復核人/日期：文件名稱文件編碼是否有效版本文件保存處《人工牛黃甲硝唑膠囊內控質量標準》□是□否質量部《人工牛黃甲硝唑膠囊檢驗操作規(guī)程》□是□否質量部《取樣操作規(guī)程》□是□否質量部《微生物限度檢查操作規(guī)程》□是□否質量部《微生物實驗室清潔消毒操作規(guī)程》□是□否質量部《培養(yǎng)基的管理制度》□是□否質量部《檢定菌的保存、傳代、使用、銷毀規(guī)程》□是□否質量部《LDZX-30FBS立式壓力壓蒸汽滅菌器操作規(guī)程》□是□否質量部《SPX-150B生化培養(yǎng)箱操作規(guī)程》□是□否質量部《BHC-1300IIA/B3生物潔凈安全柜操作規(guī)程》□是□否質量部《JJ200電子天平操作規(guī)程》□是□否質量部檢查人/日期：復核人/日期：6.驗證所需要的菌種、培養(yǎng)基、檢驗樣品的確認6.1.試驗菌種檢查表金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003銅綠假單胞菌CMCC（B）10104枯草芽孢桿菌CMCC（B）63501白色念珠菌CMCC（F）98001黑曲霉CMCC（F）98003大腸埃希菌CMCC（B）44102乙型副傷寒沙門菌CMCC（B）50094檢查人/日期：復核人/日期：6.2試驗所需的培養(yǎng)基檢查序號名稱生產廠家是否通過培養(yǎng)基適用性試驗批號01胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基北京三藥科技開發(fā)公司□是□否02胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基北京三藥科技開發(fā)公司□是□否03沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基北京三藥科技開發(fā)公司□是□否04沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基北京三藥科技開發(fā)公司□是□否05麥康凱液體培養(yǎng)基北京三藥科技開發(fā)公司□是□否06麥康凱瓊脂培養(yǎng)基北京三藥科技開發(fā)公司□是□否07RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基北京三藥科技開發(fā)公司□是□否08木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基北京三藥科技開發(fā)公司□是□否09三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基北京三藥科技開發(fā)公司□是□否檢查人/日期：復核人/日期：

6.3.檢驗樣品確認表序號品名生產廠家批號規(guī)格是否按GMP要求生產1人工牛黃甲硝唑膠囊佛山市華普生藥業(yè)甲硝唑0.2g人工牛黃5mg□是□否2人工牛黃甲硝唑膠囊佛山市華普生藥業(yè)甲硝唑0.2g人工牛黃5mg□是□否3人工牛黃甲硝唑膠囊佛山市華普生藥業(yè)甲硝唑0.2g人工牛黃5mg□是□否檢查人/日期：復核人/日期：7.驗證項目和驗證方法7.1試驗菌株人工牛黃甲硝唑膠囊需氧菌總數檢查、霉菌和酵母菌總數檢查方法驗證所用的菌株為金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉；控制菌檢查方法驗證所用的菌株為大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌。試驗菌株的傳代次數不得超過5代，并采用適宜的菌種保藏技術進行保存，以保證試驗菌株的生物學特性。7.2需氧菌總數檢查、霉菌和酵母菌總數檢查方法驗證的菌液制備分別接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24小時，取此培養(yǎng)液1ml加0.9％無菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-5～10-7,制成50～100cfu/ml的菌懸液備用。接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，20～25℃培養(yǎng)2～3天，取此培養(yǎng)液1ml加0.9％無菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-5～10-7，制成50～100cfu/ml的菌懸液備用。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂斜面上，20～25℃培養(yǎng)5～7天，直到獲得豐富的孢子。加入3～5ml含有0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，吸至無菌試管中，取1ml加含有0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-5～10-7，制成50～100cfu/m的孢子懸液備用。菌液制備后若在室溫下放置，應在2小時內使用；若保存在2～8℃，可在24小時內使用。黑曲霉孢子懸液可保存在2～8℃,在驗證過的貯存期內使用。驗證時，對各試驗菌的回收率逐一進行驗證。7.3.需氧菌總數檢查、霉菌和酵母菌總數檢查方法驗證--常規(guī)傾注平皿法.供試液的制備取供試品10g，加0.9%無菌氯化鈉溶液至100ml，振搖，制成1：10的供試液。.試驗組取1：10的供試液1ml和7.2項下制備的50～100cfu的試驗菌，分別注入平皿中，立即傾注不超過45℃的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基20ml混勻，每株試驗菌株平行制備2個平皿。置30～35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天（金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌），或培養(yǎng)5天（白色念珠菌、黑曲霉），點計菌落數。另取1：10的供試液1ml和7.2項下制備的50～100cfu的白色念珠菌、黑曲霉，分別注入平皿中，立即傾注不超過45℃的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基20ml混勻，每株試驗菌株平行制備2個平皿。置20～25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天，點計菌落數。取1：10的供試液1ml注入平皿中，立即傾注不超過45℃的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基20ml混勻，平行制備2個平皿。置30～35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天，點計菌落數。另取1：10的供試液1ml注入平皿中，立即傾注不超過45℃的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)基20ml混勻，平行制備2個平皿。置20～25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天，點計菌落數。取0.9%無菌氯化鈉溶液1ml和7.2項下制備的50～100cfu的試驗菌，分別注入平皿中，立即傾注不超過45℃的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基20ml混勻，每株試驗菌株平行制備2個平皿。置30～35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天（金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌），或培養(yǎng)5天（白色念珠菌、黑曲霉），點計菌落數。另取0.9%無菌氯化鈉溶液1ml和7.2項下制備的50～100cfu的白色念珠菌、黑曲霉，分別注入平皿中，立即傾注不超過45℃的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)基20ml混勻，每株試驗菌株平行制備2個平皿。置20～25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天，點計菌落數。常規(guī)傾注平皿法方法驗證的接受標準試驗組菌落數減去供試品對照組菌落數的值與菌液對照組菌落數的比值(即試驗菌的回收率)應在0.5?2范圍內。常規(guī)傾注平皿法方法驗證的結果常規(guī)傾注平皿法測定需氧菌總數方法驗證結果試驗次數1：人工牛黃甲硝唑膠囊批號:；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基配制批號：培養(yǎng)箱型號編號；培養(yǎng)溫度：；培養(yǎng)時長：金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌3天，白色念珠菌、黑曲霉5天試驗菌株菌種代數試驗組供試品對照組菌液對照組試驗菌的回收率12均值12均值12均值金黃色葡萄球菌銅綠假單胞菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉試驗人/日期：復核人/日期：試驗次數2：人工牛黃甲硝唑膠囊批號:；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基配制批號：培養(yǎng)箱型號編號；培養(yǎng)溫度：；培養(yǎng)時長：金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌3天，白色念珠菌、黑曲霉5天試驗菌株菌種代數試驗組供試品對照組菌液對照組試驗菌的回收率12均值12均值12均值金黃色葡萄球菌銅綠假單胞菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉試驗人/日期：復核人/日期：試驗次數3：人工牛黃甲硝唑膠囊批號:；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基配制批號：培養(yǎng)箱型號編號；培養(yǎng)溫度：；培養(yǎng)時長：金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌3天，白色念珠菌、黑曲霉5天試驗菌株菌種代數試驗組供試品對照組菌液對照組試驗菌的回收率12均值12均值12均值金黃色葡萄球菌銅綠假單胞菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉試驗人/日期：復核人/日期：常規(guī)傾注平皿法測定霉菌與酵母菌總數方法驗證結果試驗次數1：人工牛黃甲硝唑膠囊批號:；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基配制批號：培養(yǎng)箱型號編號；培養(yǎng)溫度：；培養(yǎng)時長：5天試驗菌株菌種代數試驗組供試品對照組菌液對照組試驗菌的回收率12均值12均值12均值白色念珠菌黑曲霉試驗人/日期：復核人/日期：試驗次數2：人工牛黃甲硝唑膠囊批號:；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基配制批號：培養(yǎng)箱型號編號；培養(yǎng)溫度：；培養(yǎng)時長：5天試驗菌株菌種代數試驗組供試品對照組菌液對照組試驗菌的回收率12均值12均值12均值白色念珠菌黑曲霉試驗人/日期：復核人/日期：試驗次數3：人工牛黃甲硝唑膠囊批號:；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基配制批號：培養(yǎng)箱型號編號；培養(yǎng)溫度：；培養(yǎng)時長：5天試驗菌株菌種代數試驗組供試品對照組菌液對照組試驗菌的回收率12均值12均值12均值白色念珠菌黑曲霉試驗人/日期：復核人/日期：常規(guī)傾注平皿法測定需氧菌總數、霉菌與酵母菌總數方法驗證小結按照驗證方案的要求進行試驗，若各試驗菌株的回收率在0.5～2范圍內，則可確認常規(guī)傾注平皿法適用于本品的需氧菌總數、霉菌與酵母菌總數檢查。如常規(guī)傾注平皿法適用于霉菌與酵母菌總數檢查，但不適用于需氧菌總數檢查，則下面進一步驗證可去除供試品抑菌物質的離心沉淀-薄膜過濾法是否適用于本品的需氧菌總數檢查。7.4.需氧菌總數檢查—離心沉淀-薄膜過濾法7.4.1.供試液的制備取供試品10g，加0.9%無菌氯化鈉溶液至100ml，振搖，制成1：10的供試液貯備液。取1:10的供試液貯備液50ml，經500轉/分鐘離心3分鐘，取上清液得供試液。7.4.2.試驗組取供試液1ml，加至100ml0.9%無菌氯化鈉溶液中，混勻，全量通過薄膜（孔徑0.45μm混合纖維素膜）后，以0.9%無菌氯化鈉溶液沖洗濾膜2次（100ml/次），然后在第3次沖洗液（100ml0.9%無菌氯化鈉溶液）中加入7.2項下制備的50～100cfu的試驗菌，過濾。每株試驗菌株平行制備2張濾膜。取出濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平皿上，30～35℃倒置培養(yǎng)3天（金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌），或培養(yǎng)5天（白色念珠菌、黑曲霉），點計菌落數。7.4.3.供試品對照組取供試液1ml，加至100ml0.9%無菌氯化鈉溶液中，混勻，全量通過薄膜（孔徑0.45μm混合纖維素膜）后，以0.9%無菌氯化鈉溶液沖洗濾膜3次（100ml/次），平行制備2張濾膜。取出濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平皿上，30～35℃倒置培養(yǎng)5天，點計菌落數。7.4.4.菌液對照組取0.9%無菌氯化鈉溶液300ml，200ml通過薄膜（孔徑0.45μm混合纖維素膜）后，在余下的100ml0.9%無菌氯化鈉溶液中加入7.2項下制備的50～100cfu的試驗菌，過濾。每株試驗菌株平行制備2張濾膜。取出濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平皿上，30～35℃倒置培養(yǎng)3天（金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌），或培養(yǎng)5天（白色念珠菌、黑曲霉），點計菌落數。稀釋劑對照組依照7.2項下菌液制備方法，以0.9%無菌氯化鈉為稀釋液，將各菌液稀釋至含菌50～100cfu/ml，然后以500轉/分鐘離心3分鐘，取上層菌液作下面的試驗。取上層菌液1ml，加至100ml0.9%無菌氯化鈉溶液中，混勻，全量通過薄膜（孔徑0.45μm混合纖維素膜）后，以0.9%無菌氯化鈉溶液沖洗濾膜3次（100ml/次），每株試驗菌株平行制備2張濾膜。取出濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平皿上，30～35℃倒置培養(yǎng)3天（金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌），或培養(yǎng)5天（白色念珠菌、黑曲霉），點計菌落數。.離心沉淀-薄膜過濾法測定需氧菌總數方法驗證的接受標準試驗組菌落數減去供試品對照組菌落數的值與菌液對照組菌落數的比值(即試驗菌的回收率)應在0.5?2范圍內，同時稀釋劑對照組與菌液對照組菌落數的比值應也在0.5?2范圍內。.離心沉淀-薄膜過濾法測定需氧菌總數方法驗證的結果試驗次數1：人工牛黃甲硝唑膠囊批號:；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基配制批號：培養(yǎng)箱型號編號；培養(yǎng)溫度：；培養(yǎng)時長：金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌3天，白色念珠菌、黑曲霉5天試驗人/日期：復核人/日期：試驗次數2：人工牛黃甲硝唑膠囊批號:；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基配制批號：培養(yǎng)箱型號編號；培養(yǎng)溫度：；培養(yǎng)時長：金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌3天，白色念珠菌、黑曲霉5天

試驗人/日期：復核人/日期：試驗次數3：人工牛黃甲硝唑膠囊批號:；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基配制批號：培養(yǎng)箱型號編號；培養(yǎng)溫度：；培養(yǎng)時長：金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌3天，白色念珠菌、黑曲霉5天

試驗人/日期：復核人/日期：7.4.8.離心沉淀-薄膜過濾測定需氧菌總數方法驗證小結按照驗證方案的要求進行試驗，若試驗組各試驗菌株的回收率在0.5～2范圍內，稀釋劑對照組各試驗菌株的的回收率也在0.5～2范圍內，則可確認離心沉淀-薄膜過濾法適用于本品的需氧菌總數檢查。人工牛黃甲硝唑膠囊照此驗證過的供試液制備方法及計數方法進行需氧菌總數計數。7.5.控制菌檢查方法驗證—離心沉淀-薄膜過濾法若在7.3需氧菌總數檢查、霉菌和酵母菌總數檢查方法驗證--常規(guī)傾注平皿法的試驗中，證實了人工牛黃甲硝唑膠囊有抑菌性，不能使用常規(guī)傾注平皿法進行需氧菌總數檢查，則為了確保控制菌檢查的可靠性，采用可去除供試品抑菌物質的離心沉淀-薄膜過濾法進行控制菌檢查，按照以下方案進行方法學驗證。7.5.1試驗菌株人工牛黃甲硝唑膠囊質量標準中規(guī)定檢查的控制菌為大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌，所以選擇這兩種菌株進行控制菌檢查的方法學驗證。試驗菌株的傳代次數不得超過5代，并采用適宜的菌種保藏技術進行保存，以保證試驗菌株的生物學特性。7.5.2控制菌檢查方法驗證的菌液制備分別接種大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24小時，取此培養(yǎng)液1ml加0.9％無菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-5～10-7,制成50～100cfu/ml的菌懸液備用。菌液制備后若在室溫下放置，應在2小時內使用；若保存在2～8℃，可在24小時內使用。驗證時，對各試驗菌的回收率逐一進行驗證。大腸埃希菌檢查方法驗證供試液的制備取供試品10g，加0.9%無菌氯化鈉溶液至100ml，振搖，制成1：10的供試液貯備液。取1:10的供試液貯備液50ml，經500轉/分鐘離心4分鐘，取上清液得供試液。取供試液10ml，加至100ml0.9%無菌氯化鈉溶液中，混勻，全量通過薄膜后，以0.9%無菌氯化鈉溶液沖洗濾膜2次（100ml/次），然后在第3次沖洗液（100ml0.9%無菌氯化鈉溶液）中加入～100cfu的大腸埃希菌，過濾。取膜接種至100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，30～35℃培養(yǎng)18～24小時。取上述增菌培養(yǎng)物1ml接種至100ml麥康凱液體培養(yǎng)基中,42～44℃培養(yǎng)24～48小時。取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，30～35℃培養(yǎng)18～72小時。麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上應有大腸埃希菌典型菌落生長。組～100cfu/ml，然后以500轉/分鐘離心3分鐘，取上層菌液作下面的試驗。取上層菌液1ml，加至100ml0.9%無菌氯化鈉溶液中，混勻，全量通過薄膜（孔徑0.45μm混合纖維素膜）后，以0.9%無菌氯化鈉溶液沖洗濾膜3次（100ml/次）。取膜接種至100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，30～35℃培養(yǎng)18～24小時。取上述增菌培養(yǎng)物1ml接種至100ml麥康凱液體培養(yǎng)基中,42～44℃培養(yǎng)24～48小時。取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，30～35℃培養(yǎng)18～72小時。麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上應有大腸埃希菌典型菌落生長。取0.9%無菌氯化鈉溶液300ml，全量通過薄膜（孔徑0.45μm混合纖維素膜）后，取膜接種至100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，30～35℃培養(yǎng)18～24小時。陰性對照應無菌生長。

試驗次數1：人工牛黃甲硝唑膠囊批號:大腸埃希菌對照菌來源批號（菌種編號）過程增菌培養(yǎng)選擇培養(yǎng)分離培養(yǎng)結果判斷培養(yǎng)基胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基配制批號麥康凱液體培養(yǎng)基配制批號麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板配制批號培養(yǎng)箱型號編號溫度℃型號編號溫度℃型號編號溫度℃培養(yǎng)時間開始月日時結束月日時開始月日時結束月日時開始月日時結束月日時試驗組陽性對照組陰性對照組試驗人/日期：復核人/日期：試驗次數2：人工牛黃甲硝唑膠囊批號:大腸埃希菌對照菌來源批號（菌種編號）過程增菌培養(yǎng)選擇培養(yǎng)分離培養(yǎng)結果判斷培養(yǎng)基胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基配制批號麥康凱液體培養(yǎng)基配制批號麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板配制批號培養(yǎng)箱型號編號溫度℃型號編號溫度℃型號編號溫度℃培養(yǎng)時間開始月日時結束月日時開始月日時結束月日時開始月日時結束月日時試驗組陽性對照組陰性對照組試驗人/日期：復核人/日期：

試驗次數3：人工牛黃甲硝唑膠囊批號:大腸埃希菌對照菌來源批號（菌種編號）過程增菌培養(yǎng)選擇培養(yǎng)分離培養(yǎng)結果判斷培養(yǎng)基胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基配制批號麥康凱液體培養(yǎng)基配制批號麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板配制批號培養(yǎng)箱型號編號溫度℃型號編號溫度℃型號編號溫度℃培養(yǎng)時間開始月日時結束月日時開始月日時結束月日時開始月日時結束月日時試驗組陽性對照組陰性對照組試驗人/日期：復核人/日期：大腸埃希菌檢查方法驗證結果小結按照驗證方案的要求進行試驗，若試驗組與陽性對照組均檢出典型大腸埃希菌，陰性對照組無菌生長，則可確認離心沉淀-薄膜過濾法適用于本品的大腸埃希菌檢查。人工牛黃甲硝唑膠囊照此驗證過的供試液制備方法及大腸埃希菌檢查方法進行檢查。菌檢查方法驗證7.5.4.1供試液的制備取樣品10g加0.9%無菌氯化鈉溶液至100ml制成1:10的供試液。取全部供試液經500轉/分鐘離心4分鐘，取全部上清液為供試液。.2.試驗組取全部供試液，加至100ml0.9%無菌氯化鈉溶液中，混勻，全量通過薄膜后，以0.9%無菌氯化鈉溶液沖洗濾膜2次（100ml/次）。然后在第3次沖洗液（100ml0.9%無菌氯化鈉溶液）中加入～100cfu的乙型副傷寒沙門菌，過濾。取膜接種至200ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，30～35℃培養(yǎng)18～24小時。取上述增菌培養(yǎng)物0.1ml接種至10mlRV沙門增菌液體培養(yǎng)基,30～35℃培養(yǎng)18～24小時。取少量RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)物劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上，30～35℃培養(yǎng)18～48小時。沙門菌在木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上應生長良好，菌落為淡紅色或無色、透明或半透明、中心有或無黑色。用接種針挑選出木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上的典型菌落，于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基高層斜面上進行斜面和高層穿刺接種，培養(yǎng)18～24小時。7.5.4.3陽性對照組～100cfu/ml，然后以500轉/分鐘離心3分鐘，取上層菌液作下面的試驗。取上層菌液1ml，加至100ml0.9%無菌氯化鈉溶液中，混勻，全量通過薄膜（孔徑0.45μm混合纖維素膜）后，以0.9%無菌氯化鈉溶液沖洗濾膜3次（100ml/次）。取膜接種至200ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，30～35℃培養(yǎng)18～24小時。取上述增菌培養(yǎng)物0.1ml接種至10mlRV沙門增菌液體培養(yǎng)基,30～35℃培養(yǎng)18～24小時。取少量RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)物劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上，30～35℃培養(yǎng)18～48小時。沙門菌在木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上應生長良好，菌落為淡紅色或無色、透明或半透明、中心有或無黑色。用接種針挑選出木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上的典型菌落，于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基高層斜面上進行斜面和高層穿刺接種，培養(yǎng)18～24小時。.4陰性對照組取0.9%無菌氯化鈉溶液300ml，全量通過薄膜（孔徑0.45μm混合纖維素膜）后，取膜接種至200ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，30～35℃培養(yǎng)18～24小時。陰性對照應無菌生長。7.5.4.5離心沉淀-薄膜過濾法測定乙型副傷寒沙門菌方法驗證結果

試驗次數1：人工牛黃甲硝唑膠囊批號:乙型副傷寒沙門菌對照菌來源批號（菌種編號）過程增菌培養(yǎng)選擇培養(yǎng)分離培養(yǎng)結果判斷培養(yǎng)基胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基配制批號RV沙門增菌液體培養(yǎng)基配制批號木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板配制批號三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基斜面和高層穿刺接種配制批號培養(yǎng)箱型號編號溫度℃型號編號溫度℃型號編號溫度℃型號編號溫度℃培養(yǎng)時間月日時至月日時月日時至月日時月日時至月日時月日時至月日時試驗組陽性對照組陰性對照組試驗人/日期：復核人/日期：試驗次數2：人工牛黃甲硝唑膠囊批號:乙型副傷寒沙門菌對照菌來源批號（菌種編號）過程增菌培養(yǎng)選擇培養(yǎng)分離培養(yǎng)結果判斷培養(yǎng)基胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基配制批號RV沙門增菌液體培養(yǎng)基配制批號木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板配制批號三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基斜面和高層穿刺接種配制批號培養(yǎng)箱型號編號溫度℃型號編號溫度℃型號編號溫度℃型號編號溫度℃培養(yǎng)時間月日時至月日時月日時至月日時月日時至月日時月日時至月日時試驗組陽性對照組陰性對照組試驗人/日期：復核人/日期：試驗次數3：人工牛黃甲硝唑膠囊批號:乙型副傷寒沙門菌對照菌來源批號（菌種編號）過程增菌培養(yǎng)選擇培養(yǎng)分離培養(yǎng)結果判斷培養(yǎng)基胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基配制批號RV沙門增菌液體培養(yǎng)基配制批號木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板配制批號三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基斜面和高層穿刺接種配制批號培養(yǎng)箱型號編號溫度℃型號編號溫度℃型號編號溫度℃型號編號溫度℃培養(yǎng)時間月日時至月日時月日時至月日時月日時至月日時月日時至月日時試驗組陽性對照組陰性對照組試驗人/日期：復核人/日期：7.5.4.6乙型副傷寒沙門菌檢查方法驗證結果小結按照驗證方案的要求進行試驗，若試驗組與陽性對照組均檢出典型乙型副傷寒沙門菌，陰性對照組無菌生長，則可確認離心沉淀-薄膜過濾法適用于本品的乙型副傷寒沙門菌檢查。人工牛黃甲硝唑膠囊照此驗證過的供試液制備方法及乙型副傷寒沙門菌檢查方法進行檢查。8.偏差與漏項控制：微生物限度檢查方法驗證過程中存在和發(fā)現的任何偏差與漏項，都應進行詳細的記錄，并應按公司GMP文件《偏差處理規(guī)程》進行調查與處理。偏差調查與處理的報告和支持文件，應作為此確認方案的附錄部分。偏差和漏項記錄表偏差和漏項：處理過程：檢查人/日期：復核人/日期：

9.驗證報告會審驗證報告會審表驗證項目名稱人工牛黃甲哨唑膠囊微生物限度檢查方法驗證驗證項目負責人黃漢新驗證起止日期驗證報告編號R-TS-VP-4201-00驗證結論：評價和建議：驗證報告會審人簽名起草部門：質量部QC組簽名/日期：審核部門：質量部QC組簽名/日期：部門：質量部QA組簽名/日期：批準質量負責人簽名/日期：《藥品微生物檢測技術》自測試題適用班級：生物制藥技術101-102班題號一二三四五六總分得分一、名詞解釋（15分，每小題3分）1、分離的含義2、菌落的概念3、無菌操作的概念4、無菌技術5、放線菌二、選擇題（30分，每小題2分）1、平板劃線分離的方法有A．斜線法B.圓圈法C.直線法D.紙片法2、直接計數法的缺點A.難算B.容易出錯C.不能區(qū)分細菌死活D.速度慢3、數了125個小格中有90個細菌，樣品中的細菌濃度是多少個/mlA.1350B.2280C.2238D.28804、配制培養(yǎng)基有哪幾個步驟A.9B.10C.8D.75.病毒大小的測量單位是A.納米B.微米C.毫米D.厘米6、病毒的種類不包括A.植物病毒B.昆蟲病毒C.致病病毒D.噬菌體7、人們使綠膿桿菌噬菌體能有效控制綠膿桿菌的感染，綠膿桿菌噬菌體是A.細菌B.植物病毒C.動物病毒D.細菌病毒8、原核細胞型微生物和真核細胞型微生物的不同主要是A.單細胞B.原始核，細胞器不完善C.在人工培養(yǎng)基能上生長D.有細胞壁E.對抗生素敏感9、G－菌相比，G＋菌細胞壁的特點是A.較疏松B.無磷壁酸C.有脂多糖D.有脂蛋白E.肽聚糖含量多10、抵抗力最強的細菌結構是A.芽胞B.外膜C.鞭毛D.核糖體E.細胞壁11、單個細菌在固體培養(yǎng)基上生長可形成A.菌絲B.菌團C.菌苔D.菌落E.菌膜12、大多數病原菌生長最適的PH值為13、下列細菌中繁殖速度最慢的是A.大腸桿菌B.鏈球菌C.腦膜炎球菌D.結核桿菌E.變形桿菌14、最常用、最有效的滅菌方法是：A.干烤B.焚燒C.高壓蒸汽滅菌D.紫外線殺菌E.過濾除菌15、關于濕熱滅菌法，不正確的是：A.是最常用的滅菌法B.在相同溫度下，濕熱殺菌效果比干熱好C.在濕熱狀態(tài)下，菌體可吸收水分使蛋白質易于凝固D.濕熱比干熱的穿透力弱E.蒸汽有潛熱存在三、填空題（20分，每空1分）1、革蘭氏陽性菌的細胞壁是由和組成的。2、菌種在培養(yǎng)或保藏過程中，由于的存在，出現某些原有優(yōu)良生產性狀的劣化、遺傳標記的丟失等現象，稱為菌種的衰退。3、直接計數法分四種，分為、、、。4、培養(yǎng)基按用途分為、、、5、酵母菌的繁殖方式為和。6、病毒的復制周期主要包括、、、四個連續(xù)步驟。7、細菌經革蘭染色后，被染成紫色的是菌，被染成紅色的是菌。8細菌繁殖的方式是四、判斷題（10分，每小題1分）1、革蘭氏陽性菌有外膜。2、革蘭氏陰性菌的厚度比陽性菌的厚度厚3、細胞壁的基本骨架是肽聚糖4、自然界中，微生物都是以一個個的方式存在的5、可以用固體培養(yǎng)基分離來取得純培養(yǎng)6、利用固體培養(yǎng)基分離，在平板上，單個的菌落一定是純培養(yǎng)7、某些好氧菌會在瓊脂中間缺氧影響生長8、當采集無菌樣品時，一條最重要的規(guī)則是：千萬別污染樣品。9、細菌不完全透光，一定范圍內菌溶液的混濁度與菌數量成反比10、菌落總數有時也稱為雜菌數五、簡答題（10分，每小題5分）1、磷壁酸的功能2、利用固體培養(yǎng)基分離的原理六、設計題/綜合題（15分）革蘭氏染色的步驟七、附加題（20分）稀釋傾注平板法的做法實驗室病原微生物危害評估報告第1版生效日期：2021年08月02日XX市疾病預防控制中心綜合實驗室目錄第一章綜合實驗室實驗活動生物危害評估報告 1第二章結核分枝桿菌的生物危害評估報告 7第三章金黃色葡萄球菌的生物危害評估報告 12第四章副溶血性弧菌的生物危害評估報告 15第五章致瀉大腸埃希菌的生物危害評估報告 17第六章傷寒沙門氏菌的生物危害評估報告 19第七章志賀氏菌的生物危害評估報告 22第八章蠟樣芽胞桿菌的生物危害評估報告 24第九章單核增生李斯特菌的危害評估報告 28第十章流感病毒的危害評估報告 31第十一章禽流感病毒的危害評估報告 33第十二章腸道病毒71型的危害評估報告 36第十三章麻疹病毒的生物危害評估報告 39第十四章人類免疫缺陷病毒HIV的生物危害評估報告 41第十五章乙型腦炎病毒的生物危害評估報告 43第一章綜合實驗室實驗活動生物危害評估報告為保證實驗室工作人員在工作中不被危害性生物及物品所侵害，保證危害性物品不外泄，對實驗室工作環(huán)境進行評估，以鑒定生物安全防護等級，保證生物安全。一、危害程度分類及生物安全防護水平評估生物源危害主要是由各種檢驗標本中的微生物，尤其是病原微生物引起的，包括細菌、病毒、寄生蟲等，具有潛在危險性，可能引起實驗室感染；微生物室還進行一定數量的各種條件致病性細菌及真菌的分離培養(yǎng)工作，工作過程存在病原微生物對實驗人員、環(huán)境污染的風險；除之以外實驗室還存在觸電、火災、化學品腐蝕、偷盜等危險。根據《實驗室生物安全通用要求》，本實驗室不涉及《人間傳染的病原微生物名錄》中高致病性微生物的分離培養(yǎng)及高致病性微生物的菌、毒種的保藏，實驗室采用一定防護措施就能控制感染或防范災害，或者對相應病原體存在有效的免疫方法。評估我實驗室生物安全防護水平按二級實驗室（BSL-2）生物安全要求。二、實驗人員和實驗室安全防護的一般要求1.吸煙危害評估及防護（1）實驗室工作區(qū)內絕對禁止吸煙；（2）點燃的香煙是易燃液體的潛在火種；（3）香煙、雪茄或煙斗都是傳染細菌和接觸毒物的途徑。2.實驗區(qū)內食用食物、飲料及其它危害評估及防護（1）實驗工作區(qū)內不得有食物、飲料及存在“手－口”接觸可能的其它物質（2）實驗室工作區(qū)內的冰箱禁止存放食物。專用存放食物的冰箱應放置在允許進食、喝水的休息區(qū)內。3.使用化妝品危害評估及防護實驗工作區(qū)內禁止使用化妝品進行化妝，但允許并建議經常洗手的實驗人員使用護手霜。4.實驗中眼睛和面部的風險評估及防護（1）處理腐蝕性或毒性物質時，須使用安全鏡、面罩或其它保護眼睛和面部的防護用品。（2）工作人員在實驗室的危險區(qū)內不要佩戴隱形眼鏡，除非同時使用護目鏡或面罩。（3）使用、處理能夠通過粘膜和皮膚感染的試劑，或有可能發(fā)生試劑濺溢的情況時，必須佩帶護目鏡、面罩或面具式呼吸器。5.實驗中服裝和個人防護裝備的一般要求（1）應穿著符合實驗室工作需要的服裝，工作服應干凈、整潔。當工作中有危險物噴濺到身上的可能時，應使用一次性塑料圍裙或防滲外罩。有時還需要佩戴其它防護裝備如：手套、護目鏡、披肩或面罩等。（2）采血員和其他需要接觸病員的工作人員，在接觸病員時需穿實驗服或工作服。（3）個人防護服裝應定期更換以保持清潔，遇被危險物品嚴重污染，則應立即更換。（4）不得在實驗室內設值班床，嚴禁在實驗室內住宿。6.實驗中足部防護的一般要求在工作區(qū)內，應穿舒適、防滑、并能保護整個腳面的鞋。在有可能發(fā)生液體濺溢的工作崗位，可加套一次性防滲漏鞋套。帆布鞋可吸收化學物品和有傳染性的液體，所以最好穿皮革或其它防滲漏的合成材料的鞋。7.實驗中頭發(fā)和飾物的風險評估及防護留長發(fā)的工作人員應將頭發(fā)盤在腦后，以防止頭發(fā)接觸到被污染物和避免人體脫屑落入工作區(qū)。頭發(fā)不得垂肩，應與離心機、切片機等正在運轉的器械保持一定距離8.實驗中胡須的風險評估及防護蓄有胡須的男性工作人員必須遵守上項（7）的規(guī)定。9.洗手的要求實驗室工作人員在脫下手套后、離開實驗室前、接觸患者前后、以及在進食或吸煙前都應該洗手。接觸血液、體液或其它污染物時，應立即洗手。10.用口移液的危害評估及防護用口液移可導致多種病原體的實驗室感染。所有實驗室操作禁止用口液移，應使用助吸器具。11.銳利物品的危害評估及防護謹慎處理針頭、解剖刀、和碎玻璃等銳利物品。使用后的針具不要折斷、彎曲、破損、重復使用或用手重裝在針管上。一次性注射器上的針頭用后不要取下。銳利物品應立即放置在專用銳器盒內，在完全裝滿之前或48小時之內更換。12.隔離措施的要求接觸患者時，實驗室工作人員應遵守醫(yī)院的隔離措施。13.工作環(huán)境的要求（1）“清潔”區(qū)和“非清潔”區(qū)根據實驗室的具體工作情況由主任選擇并確定“清潔”和“非清潔”工作區(qū)，在清潔區(qū)和非清潔區(qū)之間設“緩沖室”。被指定為“清潔”的區(qū)域，則應努力保持清潔，如采取預防措施，防止、視頻顯示器終端、鍵盤、門柄及其它經常被手或手上的手套觸摸的物品的污染，要求工作人員在觸摸設備（如計算機鍵盤及的保護罩等）前取下手套，制定儀器設備和工作面的常規(guī)消毒和清潔制度和對嚴重污染的緊急處理措施辦法。被指定為“非清潔”的區(qū)域，允許戴手套接觸所有物品（如、門柄、計算機終端和其它物品），所有這些物品的表面都認為是不清潔的。未戴手套的人員如果使用該區(qū)域內的、計算機終端或其它設備，應該戴上手套，或在使用后立即徹底洗手?！扒鍧崱焙汀胺乔鍧崱眳^(qū)都應保持整潔。實驗臺至少應每天清潔、消毒一次，如有必要可以多次清洗、消毒。在處理濺溢的樣品或嚴重污染的工作面時，應戴上手套和其它個人防護裝備、使用相應合適的清潔劑清除所有的濺溢物。（2）冰箱、冷凍柜、水浴和離心機應該定期清洗和消毒（時間由實驗室主任來決定），在發(fā)生嚴重污染后應立即進行清洗和消毒。進行清洗、消毒時要戴上手套，穿上工作服或其它合適的防護服。（3）外衣：外衣（實驗服、工作服、和圍裙）應懸掛在遠離散熱器、蒸汽管道、供暖裝置、以及有明火的地方，不要掛在壓縮氣瓶或滅火器上，也不要掛在門的玻璃隔板上，妨礙視線。“清潔”的和“非清潔”的個人防護服要分開存放。（4）垃圾處理：每天至少清理垃圾一次。（5）裝飾：不得在電燈、燈座或儀器上進行裝飾，更不要使用電子裝飾物、蠟燭、圣誕樹等有引起火災危險的裝飾品。（6）為便于清潔消毒，實驗室內不應有織物裝飾的用具或椅子。（7）個人物品：實驗工作區(qū)不得存放個人物品，如錢包、外套、皮靴、咖啡杯、運動服、預包裝的食品和藥品等。（8）實驗室內應配備應急設備，如應急洗眼裝置，酒精等消毒用品。（9）實驗室應安裝非手觸式洗手裝置。（10）實驗室內應安裝防蚊蠅裝置，應定期投撒滅蟑螂、老鼠的藥物。（11）用后的廢棄物品：實驗工作區(qū)內的用后廢棄物品存量不要太大。具危險性的液體如酸或堿性液體應放在視平線以下。較大的廢棄物容器應靠近地面存放。（12）出口通路：實驗室的出口和通道必須保持暢通無阻，不準堆放物品、垃圾、裝置、或設備。安全門必須保持暢通，不得堵塞。注意：無論任何時間、何種原因都不得阻塞通往滅火器、火警箱、防火毯、安全淋浴或出口的道路。14.使用玻璃器具的危害評估及防護操作玻璃器具時應遵循下述安全規(guī)則：（1）不使用破裂或有缺口的玻璃器具。（2）不要用猛力取下玻璃試管上的塞子，粘緊的試管可用刀切開分離。（3）接觸過傳染性物的玻璃器具，清洗之前，應先行消毒。（4）破裂的玻璃器具和玻璃碎片應丟棄在有專門標記的、單獨的、不易刺破的容器里。（5）高熱操作玻璃器具時應戴隔熱手套。（6）在不影響實驗質量的前提下，應盡量減少使用玻璃器具。15.使用離心機的危害評估及防護感染途徑危害評估感染途徑危害評估感染途徑危害評估皮膚極少粘膜（眼結膜）可能呼吸道可能消化道（經手-口）極少經血（針刺傷、切割傷）極少經血（蟲媒介）極少（1）氣溶膠：離心過程中應控制氣溶膠的產生在最低水平。（2）操作：離心機只有在蓋好蓋板后，才能啟動。（3）傳染性物品：所有能夠產生氣溶膠進行播散的生物制品或標本，都應使用密封的離心管，并在蓋緊的離心頭或轉頭中進行。（4）為防止氣溶膠飛溢，應在離心停止30分鐘后打開離心物。（5）清洗：按照消毒隔離制度要求清洗離心機。（6）平衡：離心時應保持合適的平衡，以保證離心的順利進行。16．采集血樣的危害評估及防護感染途徑危害評估感染途徑危害評估感染途徑危害評估皮膚極少粘膜（眼結膜）極少呼吸道可能消化道（經手-口）極少經血（針刺傷、切割傷）可能經血（蟲媒介）極少盜竊可能化學腐蝕極少放射無（1）每天早晨用500mg/L的”84”消毒液擦拭抽血臺面及其它物表，并開紫外燈消毒至少30分鐘，并做好記錄。（2）工人每天早晨更換消毒液，包括浸泡銳器、止血帶的消毒液和手消毒液。（3）工作人員必須穿工作服，戴好口罩、帽子、和手套。（4）使用合格的一次性用品。嚴禁使用包裝破損，超過有效期的一次性用品。（5）嚴格執(zhí)行無菌技術操作規(guī)程、靜脈采血必須一人一針一管一巾一帶。微量采血應做到一人一針一管一片，對每位病人操作前洗手或手消毒。（6）無菌物品如棉球需每天更換，開啟后使用不得超過24小時。（7）工作人員需對銳器如采血針采取高度預防措施，用過的采血針需浸泡在含有消毒液的厚壁容器中。17.標本(血清、血漿、全血、尿)上檢驗分析儀檢測過程的危害評估及防護感染途徑危害評估感染途徑危害評估感染途徑危害評估皮膚極少粘膜（眼結膜）可能呼吸道可能消化道（經手-口）極少經血（針刺傷、切割傷）極少經血（蟲媒介）極少盜竊可能化學腐蝕無放射無（1）為了避免液滴和氣溶膠和擴散，實驗室儀器加樣、加液，清洗等過程應在封閉罩內進行的。（2）實驗中使后的比色盤，反應杯等廢棄物應當收集在封閉的容器內，集中處置。（3）在每一步完成后應根據操作指南對對儀器進行消毒。血液、體液污染物表時，應立即消毒。（4）工作人員要戴手套進行操作。18.標本(血清、血漿、全血、尿、糞)手工檢測過程的危害評估及防護感染途徑危害評估感染途徑危害評估感染途徑危害評估皮膚可能粘膜（眼結膜）可能呼吸道可能消化道（經手-口）可能經血（針刺傷、切割傷）可能經血（蟲媒介）極少盜竊可能化學腐蝕可能放射無（1）每天早晨做好實驗室的清潔消毒工作。（2）工作人員要戴口罩、手套進行操作。（3）實驗中使用的竹簽用后要用1000mg/L“84”消毒液浸泡。（4）廢棄的標本連同試管、蓋帽要用1000mg/L“84”消毒液浸泡，由工人統(tǒng)一清潔后進行無害化處理。（5）實驗中使用的吸頭、一次性塑料杯用后要用1000mg/L“84”消毒液浸泡。（6）標本污染物表時，應立即消毒。（7）離心時，發(fā)生試管破裂或標本濺出，由操作者負責用有效消毒劑對離心機內部進行及時消毒處置。19．微生物分離鑒定藥敏試驗及基因擴增試驗活動的危害評估及防護感染途徑危害評估感染途徑危害評估感染途徑危害評估皮膚可能粘膜（眼結膜）可能呼吸道可能消化道（經手-口）可能經血（針刺傷、切割傷）可能經血（蟲媒介）可能盜竊可能化學腐蝕極少放射無（1）每天早晨開紫外燈消毒空氣至少30分鐘，同時做好各物表、儀器的清潔消毒工作。（2）實驗人員要戴手套、帽子進行操作。當估計會出現微生物和危險物濺出時要戴好眼罩或面罩。（3）操作中使用的接種環(huán)、鑷子等金屬物品要在酒精燈火焰上燒灼滅菌。（4）可能產生致病性微生物氣溶膠或出現濺出的操作如涂片、接種時，應在生物安全柜內操作，并使用個體防護設備。（5）實驗室內的各種標本、菌種、培養(yǎng)基和其它廢棄物在運出實驗室前必須滅活（高壓、浸泡），需運出實驗室滅活的物品必須放在專用的密閉容器中。（6）操作過程中發(fā)生菌種污染物表時，應馬上采取措施進行物表消毒。（7）當發(fā)生致病性微生物氣溶膠污染時，應馬上進行人員疏散，通知負責人到現場進行指導消毒。（8）對菌種的保存應嚴格遵守菌種保存制度，嚴禁擅自保存各種國家法定傳染病菌株或毒株。（9）實驗人員離開實驗室前要去除手套，確認無污染或污染已排除，后方可洗手離去。（10）微生物、PCR實驗室要設置紗窗、擋鼠板。三、特定實驗活動危害評估見以下章節(jié)之各種病原體的危害評估四、工作人員素質本實驗室共有技術人員10名，其中申請進入BSL-2實驗室10名。碩士學位3名，5名曾經從事微生物學實驗，5名曾經從事無菌實驗室活動經歷，10名技術人員學習過生物安全手冊并通過定期培訓及考核成績合格，經體檢無現患嚴重疾病，本實驗室無其他患傳染性疾病的技術人員，健康狀態(tài)良好。五、評估結論本次評估本實驗室共14項可能潛在危險的實驗活動，在實驗操作實驗施過程中在無控制措施情況下可能產生的高危害度2項，中度12項，低度0項；對危害發(fā)生的可能性分析，實驗危害較大可能發(fā)生的有0項，可能發(fā)生2項，較少可能發(fā)生12項；這些危害造成高度嚴重后果的2項，后果嚴重性中度的12項，后果嚴重性低度的0項。根據擬采取的預防控制措施后依然存在的殘留風險為高度0項，中度0項，低度危害12項。評估：XX市疾病預防控制中心綜合實驗室評估人：XX市疾病預防控制中心生物安全管理委員會審核人：2021年8月02日第二章結核分枝桿菌的生物危害評估報告結核病是由結核分枝桿菌（偶爾可由牛型或非洲型分枝桿菌）引起的一種細菌性疾病。結核病可累及全身各個器官，但以肺結核最為常見。該病具有傳染性強，散播面廣，不分地域均可發(fā)生。結核病可由呼吸道、消化道、皮膚等途徑感染，但其主要傳播途徑是以空氣為傳播因子的呼吸道傳染，而排菌的肺結核病人傳染性更大，是傳播感染的主要傳染源。1.傳播途徑呼吸道感染（respiratortractinfection）是肺結核的主要傳染途徑（routesofinfection），飛沬傳染（dropletinfection）為最常見的方式。傳染源主要是排菌的肺結核患者（尤其是痰涂片陽性未經治療者）。飛沬核（dropletnuclei）＜10μm時可被吸人呼吸道，健康人可因吸入患者咳嗽、打噴嚏時噴出的帶菌飛沫而受感染。2.危害程度分級微生物按其是否致病、致病力強弱、危害人體的嚴重性、傳染性的大小、臨近人群的抵抗力、有無免疫制劑和特效治療藥物等綜合評價，可分為四個不同的危害等級。結核分枝桿菌屬于3級危險。3級危險（對個體具有極大危害，對群體具有較大的危害性）：指有特殊危險的致病菌。感染后癥狀較重，并可能危及生命，或者缺乏有效的預防方法、發(fā)病后不易治療的微生物。3.實驗室感染的原因及預防（一）技術操作可能導致的感染及其預防措施。1.接種：應使用無彈力的鉑絲接種環(huán)，結核菌接種后接種環(huán)火焰滅菌易崩散，酒精燈燒灼時要特別注意。2.混勻：吸管吸吹菌液時不要產生氣泡，應沿容器壁排出。3.研磨：最好使用組織研磨器，乳缽易產生氣溶膠。4.移液：吸管上端的棉花松緊要適度，吸液時要從管底吸取，吹出時要輕緩，不要全部吹凈，以免產生氣泡，形成氣溶膠。5.開封：要避免壓力和氣流的急劇變化。6.離心：離心管套底墊要完好，使用匹配的管、套、離心頭，加蓋。7.注射：做好個人防護，正確使用注射器。8.搬運：室內移動要避免滑落，移出室外要有堅實密閉的外包裝。（二）技術保障1.雙人原則，不允許單人操作1、2類病原。2.入口處應有危險警示標識，并標明所操作的微生物的種類。3.培訓考核上崗，掌握相關技術操作要領，熟悉規(guī)章制度，適應工作環(huán)境。4.完備的管理措施，技術操作規(guī)范。5.良好的工作行為可降低生物危害風險。4.實驗室中的分枝桿菌及分枝桿菌氣溶膠結核病實驗室工作人員，在分枝桿菌檢驗過程中，會接觸到各種潛在感染源標本和各種危險物，特別是許多操作易產生分枝桿菌氣溶膠。含有結核分枝桿菌的微滴核（1-5微米）通過呼吸進入人體肺泡，可以黏附在肺泡內生長繁殖。因此，首先要對實驗室中生物危險物產生的途徑和存在的地點有充分的認識，以便明確生物安全防護的環(huán)節(jié)。(一)分枝桿菌存在的地點1、各種臨床標本，通常是痰，胃或支氣管灌洗液、腦脊液、尿液等。2、被污染的操作臺、器械、儀器、試劑等。3、收集的結核分枝桿菌、非結核分枝桿菌菌株等。4、細菌學實驗室的部分區(qū)域。(二)產生分枝桿菌氣溶膠1、實驗室內可疑肺結核患者痰標本的采集。2、樣本的制備和涂片的火焰固定。3、分離培養(yǎng)或接種培養(yǎng)物。4、用火焰燒灼接種環(huán)。5、使用移液器混合培養(yǎng)物。6、培養(yǎng)管或培養(yǎng)瓶中含有培養(yǎng)物的滴落物。7、溢出的分枝桿菌懸浮液。8、高速混合含有分枝桿菌的液體。9、轉移液態(tài)培養(yǎng)物和上清液，或培養(yǎng)液、上清液的傾倒。10、離心過程中離心管的破碎。11、用做原代培養(yǎng)所需的組織勻漿。5.安全防護(一)嚴格遵守實驗室安全操作規(guī)程，任何時侯都要警惕分枝桿菌氣溶膠的產生。實驗室的技術人員必須經過生物安全培訓后方可上崗。(二)實驗室應嚴格限制非實驗人員進入，減少實驗室內外交叉生物污染。完成實驗工作離開實驗室，要關好門窗。(三)進入實驗室應避免攜帶非必需物品。(四)進入實驗室，工作人員應穿著工作服，操作時應穿戴防護隔離衣、口罩、帽子和手套，長發(fā)者應將頭發(fā)裝束在帽子內。(五)實驗過程中絕對禁止吸煙、飲食等，不要以手撫頭面部等。(六)試驗前須開啟紫外線燈對實驗室和操作區(qū)域進行照射消毒1小時以上；試驗結束后，立即開啟紫外燈進行照射消毒2小時以上。(七)任何試驗的開始和結束后，操作人員要用70%酒精浸泡雙手或仔細擦后，用清潔劑或清水洗凈。(八)每次試驗結束后，必須清理好實驗臺，并用70%酒精液或3-5%石炭酸擦洗實驗臺面。(九)實驗室中的生物危險品要根據檢查項目和性質不同，局限在相應的試驗區(qū)間，不得隨意將其帶到其它的實驗室。(十)實驗室內任何微生物的樣本，廢棄物都必須經高溫高壓滅菌后，方可按一般垃圾處理。6.安全保障(一)首先各級實驗室應按等級要求完善實驗設施，如簡易安全柜內的抽氣排風功能、紫外燈消毒功能，生物安全柜維護與除菌濾膜定期更換等。(二)實驗室采集病人痰標本時應在戶外進行，避免因病人咳漱造成室內氣溶膠污染。(三)普通實驗室應注意氣流方向，實驗過程中盡量避免強氣流變化而產生氣溶膠（如﹕涂片、染色過程中）。(四)細菌的分離培養(yǎng)、菌種開封、轉種、研磨、稀釋等操作，各級實驗室均應在簡易安全柜或生物安全柜中進行。(五)使用接種環(huán)進行操作時，接種環(huán)應在工作燈的內焰中燃燒，以避免菌液或菌塊飛濺。(六)稀釋菌液時，吸管、針管要緩慢插入試管或燒瓶底部，小心操作避免產生氣泡或氣溶膠。(七)使用注射器加樣時，用過的針頭切勿再重新入套或拔開注射器與針頭，應直接放入銳器收集器，以免劃破皮膚造成接種感染。(八)菌株庫要設專人管理，并按照國家微生物菌毒種管理辦法執(zhí)行。(九)進行毒菌操作過程中，不要穿戴巳經污染的防護性手套觸摸門柄、儀器或毒菌區(qū)以外區(qū)域，避免由于粗心擴大污染范圍。(十)試驗結束后，操作過程中所有可能與生物危險物接觸或被污染的試驗器械和物品，能夠高壓消毒的必須高壓消毒，不能進行高壓消毒的設備、儀器，應使用有效的消毒劑擦洗后再以紫外燈近距離長時間消毒。(十一)實驗中發(fā)生意外污染情況，應立即通知主管人員并做好處理污染物和相應區(qū)域的準備，不得擅自采用其它禁止的方法進行消毒處理。(十二)實驗室主任應制定規(guī)章和程序，只有告知潛在風險并符合進入實驗室特殊要求(如，經過免疫接種)的人，才能進入實驗室。(十三)操作致病性微生物時，實驗室入口處應貼有生物危險標志，并顯示以下信息：有關病原、生物安全級別、免疫接種要求、研究人員姓名、號碼、在實驗室中必須佩帶的個人防護設施、出實驗室所要求的程序。(十四)實驗室主任為實驗室人員特別制定的標準操作程序或生物安全手冊中，應包括生物安全程序。對于有特殊風險的人員，要求閱讀并在工作及程序上遵照執(zhí)行。(十五)實驗室主任保證實驗及其輔助人員接受適當的培訓，包括和工作有關的可能存在的風險、防止暴露的必要措施和暴露評估程序。(十六)實驗室所用任何個人防護裝備應符合國家有關標準的要求。實驗室應確保具備足夠的有適當防護水平的清潔防護服供使用。還應穿戴其它的個人防護裝備，如手套、防護鏡、面具、頭部面部保護罩等。(十七)處理樣本的過程中易產生高危害氣溶膠時，要求同時使用適當的個人防護裝備、生物安全柜和/或其它物理防護設備。如可產生含生物因子的氣溶膠，應在適當的生物安全柜中操作。(十八)實驗用鞋應舒適，鞋底防滑。應用皮制或合成材料的不滲液體的鞋類。在從事可能出現漏出的工作時可穿一次性防水鞋套。在實驗室的特殊區(qū)域（例如有防靜電要求的區(qū)域）或BSL-3和BSL-4實驗室要求使用專用鞋（例如一次性或橡膠靴子）。7.結核病實驗室廢物處理一、實驗室廢棄物處理的目的：(一)將操作、收集、運輸、處理及處置廢棄物的危險減至最小；(二)將實驗室廢棄物對環(huán)境的有害作用減至最小。二、實驗室污物處理及消毒(一)實驗室含有生物危險物的臨床標本及被污染的一次性用品，試驗完成后，應在操作臺或實驗區(qū)域內以紫外燈近距離照射消毒2小時以上，再經高壓消毒后方可丟棄或焚燒。(二)可重復使用的實驗用品及器材，完成實驗后，應在操作臺或實驗區(qū)域內經紫外燈近距離照射消毒2小時以上后，再交有關人員進行高壓消毒和煮沸洗刷。(三)實驗用的試管、吸管、注射器，須裝在加蓋不漏的容器內，經高壓滅菌后取出。(四)培養(yǎng)物或實驗室垃圾，在丟棄前必須經高壓消毒和紫外燈近距離長時間照射處理。不允許積存垃圾和實驗室廢棄物。已裝滿的容器應定期運走。在去污染或最終處置之前，應存放在指定的安全地方，通常在實驗室區(qū)內。(五)實驗室廢棄物應置于適當的密封且防漏容器中安全運出實驗室。有害氣體、氣溶膠、污水、廢液應經適當的無害化處理后排放，應符合國家相關的要求。(六)實驗過程中，如標本或含標本的前消化處理液被打翻污染了操作臺或地面，應以吸滿70%酒精的衛(wèi)生紙覆蓋污染區(qū)，15分鐘以后衛(wèi)生紙方可移去。(七)實驗室內未經消毒的污水，禁止直接排入公共排水系統(tǒng)，更不允許混入居民生活垃圾。8.意外事故的處理(一)如果發(fā)生意外，必須立即通知實驗室主管人員，并在有關人員的指導監(jiān)督下對出事現場進行處理，絕對禁止未經報告而私自對出事現場給予非規(guī)范的處理。(二)實驗過程中，如污染物濺落到身體表面，或有割傷、刺傷、燒傷、燙傷等情況發(fā)生，應立即停止實驗工作進行緊急處理，更換被污染的實驗服，皮膚表面用消毒液清洗，傷口以碘酒或酒精消毒，眼睛用無菌生理鹽水沖洗。(三)如果發(fā)生菌液溢出，含菌種的培養(yǎng)管破碎等，造成中、小面積污染，可用比污染面積大25%以上的紗布覆蓋污染區(qū)域，邊緣用脫脂棉圍住，向紗布傾倒5%苯酚溶液或70%的酒精，浸泡2小時以上（其間適量加溶液防止干燥），再經紫外燈近距離（1米內）照射2小時以上；被污染的器械、容器等立即浸泡于70%酒精中2小時以上，實驗完成后再進行高壓消毒處理。(四)如果發(fā)生氣溶膠污染或大面積污染，應立即停止實驗并關閉實驗室，對污染區(qū)域進行紫外燈照射消毒過夜；第二天對污染區(qū)進行24小時封閉空氣熏蒸消毒（乙醛消毒法﹕5ml乙醛＋2g高錳酸鉀/m3空間）。(五)絕對禁止使用的事故處理方法﹕1.任何有可能造成污染面積擴大的去污方法，如使用70%乙醇或甲酚皂液擦洗被污染的區(qū)域。2.直接用火焰對未經任何處理的污染地面、操作臺、器械等進行燒灼處理。3.使用消毒效果未經證實的消毒劑進行消毒。4.使用低濃度的消毒劑和紫外燈進行短時間、長距離的照射。第三章金黃色葡萄球菌的生物危害評估報告1.生物學特性金黃色葡萄球菌是人類的一種重要病原菌，隸屬于葡萄球菌屬，可引起多種嚴重感染。金黃色葡萄球菌為球型，直徑0.8μm左右，顯微鏡下排列成葡萄串狀。金黃色葡萄球菌無芽胞、鞭毛，大多數無莢膜，革蘭氏染色陽性。金黃色葡萄球菌營養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基上生長良好，需氧或兼性厭氧，最適生長溫度37°C，最適生長pH7.4。平板上菌落厚、有光澤、圓形凸起，直徑1-2mm。血平板菌落周圍形成透明的溶血環(huán)。金黃色葡萄球菌有高度的耐鹽性，可在10-15%NaCl肉湯中生長?？煞纸馄咸烟恰Ⅺ溠刻?、乳糖、蔗糖，產酸不產氣。甲基紅反應陽性，VP反應弱陽性。許多菌株可分解精氨酸，水解尿素，還原硝酸鹽，液化明膠。2.危害程度分類根據中華人民共和國衛(wèi)生部制定《人間傳染的病原微生物名錄》該菌危害程度為第三類。3.致病性和感染劑量金黃色葡萄球菌是人類化膿感染中最常見的病原菌，可引起局部化膿感染，也可引起肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等，甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染。金黃色葡萄球菌的致病力強弱主要取決于其產生的毒素和侵襲性酶，有報道目前出現越來越多的耐藥菌株，MRSA即耐甲氧西林金黃色葡萄球，菌致病性也隨著變強。4.暴露的潛在后果暴露后可能引起感染，菌量大時可使實驗人員出現皮膚軟組織感染、全身性感染、呼吸道感染、中毒、腸炎等。被感染后，成為傳染源，可能對周圍及環(huán)境造成污染，應及時得到治療和控制。5.感染途徑通過污染食品和水源經口傳播，也可通過呼吸道和接觸傳播。6.微生物在環(huán)境中的穩(wěn)定性葡萄球菌是無芽胞菌中抵抗力最強者，而干燥可達數月，加熱80℃7.濃度和濃縮標本的容量一般樣本檢測。8.自然和易感人群宿主金黃色葡萄球菌常存在于鼻咽喉、下消化道、毛發(fā)和皮膚上，在人類和普通的動物都有存在。致病性依照宿主狀狀，衛(wèi)生情況，皮膚和黏膜有否創(chuàng)傷而異。當宿主免疫力下降，皮膚黏膜有創(chuàng)傷或衛(wèi)生情況不好是易感染，特別是老人和嬰兒。9.實驗操作活動巳有文獻證明，金黃色葡萄球菌可造成實驗人員化膿性和呼吸道感染，人類不是該菌在唯一傳染源，在許多動物身上都存在該菌。這種病原體可以存在于受感染的人或動物的膿液，血液等多種體液中。通過污染食品和水源經口傳播，和通過呼吸道和接觸傳播是該菌的主要傳播方式，該菌也是引起院內感染的主要細菌之一。暴露在氣溶膠中也可能引起感染。按照國家標準方法對樣本（糞便、食品、水樣）進行分離，培養(yǎng)，鑒定。建議采用BSL-2級水平的操作技術，防擴散設備和設施。一旦發(fā)生意外，按照本實驗室的《意外事故應對方案和應急程序》進行處理。10.預防和治療金黃色葡萄球菌是人類化膿感染中最常見的病原菌，可引起局部化膿感染，也可引起肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等，甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染。目前疫苗還不可用于人類。該菌能對人體多部位的感染，所以跟據所致疾病的不同也應采取不同的治療方案，主要是對癥處理和針對病原治療，大體用藥可選用紅霉素、新型青霉素、慶大霉素、萬古霉素或先鋒霉素Ⅵ治療。預防金黃色葡萄球菌感染，首先是要做好個人衛(wèi)生，和加強餐飲和食品衛(wèi)生的管理，及時發(fā)現帶菌者，做好各種動物的管理工作，把能傳播該菌的途徑有效的控制好。11.工作人員素質衛(wèi)生技術專業(yè)人員，并經過生物安全培訓后獲得上崗證書。12.評估結論該菌生物性狀較穩(wěn)定，但抗生素有濫用，也出現了不少的耐藥株。該菌主通過污染食品和水源經口傳播，也可通過呼吸道和接觸傳播，可引起局部化膿感染，也可引起肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等，甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染。預防手段主要預防金黃色葡萄球菌感染，首先是要做好個人衛(wèi)生，和加強餐飲和食品衛(wèi)生的管理，及時發(fā)現帶菌者，做好各種動物的管理工作，把能傳播該菌的途徑有效的控制好。試驗過程建儀采用BSL-2級水平的操作技術、防擴散設備和設施。實驗室中應穿著工作服或罩衫等防護服。離開實驗室時，防護服必須脫下并留在實驗室內。不得穿著外出，更不能攜帶回家。用過的工作服應先在實驗室中消毒，然后統(tǒng)一洗滌或丟棄。當手可能接觸感染材料、污染的表面或設備時應戴手套。如可能發(fā)生感染性材料的溢出或濺出，宜戴兩副手套。不得戴著手套離開實驗室。工作完全結束后方可除去手套。一次性手套不得清洗和再次使用。操作臺面用70%酒精或含氯消毒劑擦拭，廢棄物處理按本實驗室廢棄物處理制度進行。第四章副溶血性弧菌的生物危害評估報告副溶血性弧菌（VibrioParahemolyticus,VP）是一種嗜鹽性細菌。副溶血性弧菌食物中毒，是進食含有該菌的食物所致，主要來自海產品，如墨魚、海魚、海蝦、海蟹、海蜇，以及含鹽分較高的腌制食品，如咸菜、腌肉等。本菌存活能力強，在抹布和砧板上能生存1個月以上，海水中可存活47天。臨床上