臨床PCR檢測技術實習生講課KaryB.Mullis

USA,forhisinventionofthepolymerasechainreaction(PCR)method1930年提出了兩種核酸DNA和RNA的概念1953年Watson和Crick提出了DNA雙螺旋結構及其半保留復制模型。一、PCR概述一、PCR概述（一）PCR概念PCR（polymerasechainreaction)是一種在體外通過重復DNA合成，以擴增特定核苷酸序列的方法。特點高靈敏度高特異性體外進行快捷CT值-X0作圖定性PCR測定的臨床意義也可取抗凝血標本,但一般不推薦。CTlg(1+E)=-lgX0+lg(RT-RB)–lgRs（二）熒光定量PCR原理DNA---2μly=x(1+e)nTaq酶---1μl當循環(huán)次數n=CT值時：CT=-klogX0+b來自同一靶序列前一次PCR的擴增產物。延伸72C5min。小于105拷貝/ml，日常生活接觸傳染性較小8000g離心1min四、PCR檢測的臨床應用其他組織標本：留于無菌試管。PCR的概念核心技術是從水棲高溫菌中分離到能耐高溫的Taq酶，使擴增反應不需要每一個循環(huán)加一次DNA聚合酶，從而實現(xiàn)了自動化。應用領域迅速擴大，PCR技術成為了分子生物學中的一項突破性技術。PCR概述——2000至年發(fā)表論文1280748篇一、PCR概述（二）原理雙鏈DNA變性退火鏈延伸

（膜板）

（雙鏈分成單鏈）（膜板與引物雜交）（DNA合成）不斷重復二、實驗步驟（一）核酸提取提取100ul濃縮液100ul血清吹打混勻12000g離心5min棄上清20ul提取液100℃煮10min模板二、實驗步驟提取10ulA液200ulB液震蕩混勻8000g離心1min200ulDEPC乙醇65℃干燥10minRNA模板8000g離心1min逆轉錄為cDNA棄上清重復洗2次50ul血清3、細胞或組織劇烈震蕩400ul試劑1加入400ul試劑2震蕩混勻12000g離心5min完全棄上清加入試劑3模板加樣擴增雜交顯色（二）擴增HBV引物(168bp)： 上游：5-GAAGTGTGACGTTGACATCC

下游：5-ACAGAGTACTTGCGCTCAGG擴增體系：（50μl體系）

10*Buffer---5μldNTP---1μlMgCl2---3μlPrimerF---2μlPrimerR---2μlDNA

---2μlTaq酶---1μlH2O---34μl反應程序預變性94

C3min循環(huán)延伸72

C5min。注：每組實驗陰性對照用無菌生理鹽水代替模板58

C45s72

C45s94

C45s30循環(huán)（三）結果判讀（四）PCR的常見問題及處理措施常見問題污染：表現(xiàn)為陰性對照同樣出現(xiàn)目的條帶或陰性對照出現(xiàn)‘S’形曲線。污染的來源：來自其他測試樣品的DNA來自試驗材料如重組克隆的DNA外源DNA污染來自同一靶序列前一次PCR的擴增產物。

（三）PCR的常見問題及處理措施如何減少污染實驗室分區(qū)酶法控制尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG)短于100bp的PCR產物不能用UNG完全消除污染。紫外線表面照射消除試劑、加樣頭中的DNA污染。對短PCR產物效果不好以預防污染為主良好的實驗室操作三、熒光定量PCR（一）熒光PCR定量的概念

以外參已知數量拷貝數的標準品為標準，通過擴增及對熒光值的監(jiān)測，對PCR起始模板量的定量。（二）熒光定量PCR原理染料染色SYBR?GreenI溴乙錠(EthidiumBromide)探針標記TaqManTM

分子信標(Molecularbeacons)TaqMan探針reverseprimerRQforwardprimer3'3'5'5'3'5'5'1.PolymerisationprobeRQ3'3'5'5'3'5'5'2.StranddisplacementQ3'3'5'5'3'5'5'3.CleavageR3'5'5'3'5'5'4.PolymerisationcompletedQRR=ReporterQ=Quencher3'（三）定量PCR的數學原理PCR理論方程N=N0x(1+E)nN: 擴增數量N0: 起始模板數量E： 擴增效率n: 循環(huán)數指數期PCR定量方程才有效Log[DNA]循環(huán)數線性增長期Linear平臺期Plateauy=x(1+e)n指數增長期GeometricPCR曲線線性圖譜半對數圖譜起點定量與終點定量起點定量終點定量“加進不同拷貝的膜板”半對數圖譜線性圖譜同一個樣品重復96次起點定量的優(yōu)勢終點產物數量：誤差太大拐點產物數量：重現(xiàn)性好起始DNA量，更具意義重現(xiàn)性好，誤差小起點定量的關鍵：CT值CT值：熒光信號有統(tǒng)計學意義顯著增長(穿過閾值線)時的循環(huán)次數CT值半對數圖譜CT值線性圖譜CT

起始DNA濃度當循環(huán)次數n=CT值時：RT=RB+X0(1+E)CT

Rs

lg(RT-RB)=lgX0+CTlg(1+E)+lgRsCTlg(1+E)=-lgX0+lg(RT-RB)–lgRs即

CT=-klgX0+b（線性方程）Rn=RB+X0(1+E)nRsCT值-X0作圖CTX0CT=-klogX0+b四、PCR檢測的臨床應用

（一）標本采集要求項目標本采集HBV無菌注射器抽取2毫升靜脈血或其它體液注入無菌試管或抗凝管。HCVEB1.鼻咽拭子或體液標本。2.也可取抗凝血標本,但一般不推薦。CMV1.尿液：中段晨尿20ml于加蓋試管。其他體液標本或咽拭子。也可取抗凝血標本,但一般不推薦。TB1.痰液：患者深部咳痰1～3ml于無菌加蓋試管。2.其他組織標本：留于無菌試管。。3.也可取抗凝血標本,但需分離單個核細胞檢測，陽性率才會高。（于發(fā)熱時抽取）MP

咽拭子項目標本采集所需容器CT男性：尿道分泌物：細小棉拭子伸入尿道約2～4厘米，旋轉數圈取出分泌物（應略帶粘膜）。前列腺液、精液。女性：陰道分泌物：用無菌生理鹽水洗去宮頸外分泌物，再用無菌棉拭子插入宮頸內，停5秒后旋動棉拭子采取分泌物。尿道分泌物：同上一次性無菌帶蓋的試管。NGUUTPHPVHSV（二）結果分析、報告及解釋1.定性PCR與定量PCR的比較2.定量PCR測定的臨床意義3.定性PCR測定的臨床意義4.定性和定量測定的結果報告及解釋1.定性PCR與定量PCR的比較瓊脂糖凝膠電泳定量PCR擴增曲線圖2.定量PCR的臨床意義對致病微生物核酸含量進行定量檢測彌補免疫檢測的缺陷縮短診斷的窗口期（如HBV,HIV）對治療過程進行藥物療效監(jiān)測用于基因表達方面的研究某患者HBV-DNA的PCR結果動態(tài)圖日期HBV-DNA2004-6-39.3E+72004-12-72.0E+62005-4-191.8E+32005-7-250.0E+0Mullis

USA,forhisinventionofthepolymerasechainreaction(PCR)method痰液：患者深部咳痰1～3ml于無菌加蓋試管。Rn=RB+X0(1+E)nRs定性PCR與定量PCR的比較dNTP---1μlMullis

USA,forhisinventionofthepolymerasechainreaction(PCR)method短于100bp的PCR產物不能用UNG完全消除污染。來自其他測試樣品的DNACT值-X0作圖拐點產物數量：重現(xiàn)性好H2O---34μl對短PCR產物效果不好PrimerF---2μl小于105拷貝/ml，日常生活接觸傳染性較小Taq酶---1μl3、定性測定的臨床應用診斷用于篩檢耐藥突變檢測病毒基因型檢測GGAGGGAGAAAA4.定性和定量測定的結果報告及解釋（