烏司他丁對失血性休克大鼠肝臟缺血再灌注損傷的保護作用

動脈供血培養(yǎng)（i.ri）是術(shù)后肝功能衰竭的重要原因之一。本實驗通過建立大鼠失血性休克模型,探討烏司他丁(UTI)對失血性休克大鼠肝臟再灌注損傷的保護作用及機制。1材料和方法1.1動物模型的建立雄性Wistar大鼠24只,鼠齡10～12周,體質(zhì)量210～250g,由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供。UTI產(chǎn)自廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司。TUNEL凋亡試劑盒購自美國Roche公司。TNF-αELISA檢測試劑盒購自武漢博士德公司。MDA、SOD測試盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。髓過氧化物酶(MPO)測試盒購自上海滬峰生物科技有限公司。1.2動物模型的建立與分組24只Wista大鼠隨機分為3組,每組8只,分別為假手術(shù)組、生理鹽水治療組(NS治療組)、UTI治療組。動物模型的建立參照文獻,大鼠用2%戊巴比妥鈉(3mL·kg-1)腹腔注射麻醉,手術(shù)分離右頸總動脈并置管用于監(jiān)測平均動脈壓,分離左后肢股動脈、股靜脈并置管分別用于放血、給藥及血液回輸。手術(shù)后靜脈推注肝素鈉(1000U·kg-1)使大鼠全身血液肝素化,連接多道生理記錄儀監(jiān)測平均動脈壓、心電圖和肛溫。待血壓穩(wěn)定后自股動脈快速放血(1.3mL·min-1·kg-1)至平均動脈壓40mmHg,再通過慢速放血將平均動脈壓維持20min后放置60min,整個放血過程大鼠共失血45%左右。維持1h后,(1)UTI治療組:予烏司他丁25000U·kg-1(2mL生理鹽水稀釋)靜脈推注(5min內(nèi)),并回輸放出的血液和等量生理鹽水,速度<2mL·min-1,在30min內(nèi)完成液體復蘇;(2)NS治療組:則予2mL生理鹽水靜脈推注,余同UTI治療組;(3)假手術(shù)組:除不放血和輸液外,其他處理與模型相同。觀察3h后處死大鼠。取血液離心分離血漿;取肝右葉2塊肝組織,1塊以4%甲醛固定用于組織病理檢測;1塊制作10%肝組織勻漿,離心取上清液。1.3mda、sod、mpo含量測定肝功能酶學指標采用全自動生化分析儀測定;TNF-α采用ELISA法檢測;肝組織MDA、SOD、MPO含量的測定參照相應的檢測試劑盒說明進行檢測;固定好的肝組織石蠟包埋切片,進行常規(guī)HE染色和TUNEL法染色,觀察肝組織病理改變及肝細胞凋亡情況(以肝細胞凋亡指數(shù)表示并進行半定量分析)。1.4統(tǒng)計處理采用SPSS11.0軟件進行統(tǒng)計學分析,數(shù)據(jù)用表示,組間差異行單因素方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2結(jié)果2.1中央靜脈周圍肝竇血清學變與假手術(shù)組相比NS治療組肝組織損傷最重,可見肝細胞水樣變,肝竇淤血變窄,間質(zhì)大量炎性細胞浸潤,尤以中央靜脈周圍肝細胞、膽管上皮細胞損傷為重。UTI治療組較NS治療組損傷輕,肝細胞輕度水樣變,少量炎性細胞浸潤(圖1)。2.2各組小鼠血清中mm2的表達情況UTI治療組凋亡肝細胞數(shù)為(20.0±3.2)/mm2,明顯低于NS治療組(40.0±8.2)/mm2(P<0.05),但均明顯高于假手術(shù)組(5.0±0.5)/mm2(P<0.05,圖2)。2.3兩組患者ul-1、nl-1,3.32.3333333333333333.34.3.3.3.3.3UTI治療組血清ALT、AST活性和TNF-α水平分別為(217±45)U·L-1、(460±85)U·L-1、(1.3±2.3)ng·L-1,顯著低于NS治療組(P<0.05),但均明顯高于假手術(shù)組(P<0.05,表1)。2.4nmolmg-1和ug-1的比較UTI治療組肝組織中MDA濃度、MPO活性分別為(1.24±0.11)nmol·mg-1和(1.22±0.12)U·g-1,明顯低于與NS治療組和假手術(shù)組;SOD活性為(0.65±0.05)kU·mg-1,高于NS治療組,但低于假手術(shù)組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見表1)。3各次輸注時肝臟組織抗氧化活性的變化血清ALT、AST是反應肝臟損傷的重要酶學指標。本實驗中,NS治療組失血性休克大鼠在輸注自體血液復蘇后3h導致血清ALT、AST活性顯著升高,而且肝臟發(fā)生明顯組織病理損傷,說明大鼠失血性休克后輸注自體血液復蘇對肝臟造成了I/RI。與NS治療組相比,UTI治療組大鼠血清ALT、AST顯著降低,肝臟病理損傷減輕,說明UTI對失血性休克再灌注后肝組織損傷具有保護作用。脂質(zhì)過氧化物最后裂解終產(chǎn)物MDA是目前公認的能反映氧自由基產(chǎn)生及引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應的間接指標,其含量變化不僅可反映體內(nèi)氧自由基生成與否及脂質(zhì)過氧化反應強烈程度,尚可反映其造成組織損傷的嚴重程度。內(nèi)源性清除氧自由基物質(zhì)SOD活性可準確反映體內(nèi)氧自由基量。MPO是存在于中性粒細胞內(nèi)的一種耐高溫酶,其活性與中性粒細胞在組織中浸潤程度成正比。UTI治療組肝組織MDA、MPO濃度比NS治療組顯著降低,SOD活性顯著升高,說明UTI在肝組織有效地抑制了中性粒細胞的浸潤程度、脂質(zhì)過氧化反應的強度。在肝臟I/R早期,細胞凋亡參與I/RI。TNF-α是凋亡誘導因素之一,可通過神經(jīng)酰胺信號途徑觸發(fā)細胞凋亡。本實驗發(fā)現(xiàn),UTI治療組的肝細胞凋亡數(shù)和血清TNF-α水平較NS治療組明顯減少,提示烏司他丁可以通過減少肝臟I/RI后肝細胞凋亡發(fā)生發(fā)揮保護作用。綜上所述,UTI對失血性休克大鼠肝臟再灌注損傷的保護作用可能存在以下機制:(1)可能與其抑制中性粒細胞浸潤,進而減輕中性粒細胞造成的蛋白水解酶釋放、抑制炎癥介質(zhì)釋放、預防細胞因子級聯(lián)反應的作用有關(guān);(2)作為一種膜穩(wěn)定劑,UTI能抑制氧自由基生成,清除氧自由基,從而增加肝細胞膜及溶酶體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器的穩(wěn)定性,減輕氧自由基引起的損傷;(3)UTI的抗凋亡作用可能也參與對肝臟再灌注損傷的保護作用。本實驗雖在大鼠活體內(nèi)證實了UTI對肝臟再灌注損傷的保護作用,但在UTI治療的再灌注肝組織內(nèi)仍有較多炎