光學(xué)顯微鏡的發(fā)展歷史、現(xiàn)狀與趨勢(shì)楊拓拓（蘇州大學(xué)現(xiàn)代光學(xué)技術(shù)研究所，江蘇蘇州215000）1基本原理顯微鏡成像原理及視角放大率顯微鏡由物鏡和目鏡組成。物體AB在物鏡前焦面稍前處，經(jīng)物鏡成放大、倒立的實(shí)像A'B'，它位于目鏡前焦面或稍后處，經(jīng)目鏡成放大的虛像，該像位于無窮遠(yuǎn)或明視距離處。牛頓放大率公式：x'x=f'fx是像點(diǎn)到像方焦點(diǎn)的距離，x是物點(diǎn)到物方焦點(diǎn)的距離。根據(jù)牛頓放大率公式可得物鏡的垂軸放大率為目鏡的視覺放大率為：250r=2f'組合系統(tǒng)的放大率為11250Ar=0r二—12f'f'12顯微鏡系統(tǒng)的像方焦距250廣一f顯微鏡系統(tǒng)成倒像軸向放大率若物點(diǎn)A沿光軸移動(dòng)很小的距離，則通過顯微鏡系統(tǒng)的像點(diǎn)A2將移動(dòng)很大的距離，且移動(dòng)方向相同。顯微系統(tǒng)的角放大率即入射于物鏡為大孔徑光束，而由目鏡射出為小孔徑光束。顯微鏡的孔徑光闌單組低倍顯微物鏡，鏡框是孔徑光闌。復(fù)雜物鏡一般以最后一組透鏡的鏡框作為孔徑光闌。對(duì)于測(cè)量顯微鏡，孔闌在物鏡的象方焦面上，構(gòu)成物方遠(yuǎn)心光路。顯微鏡的視場(chǎng)光闌和視場(chǎng)在顯微物鏡的象平面上設(shè)置了視場(chǎng)光闌來限制視場(chǎng)。由于顯微物鏡的視場(chǎng)很小，而且要求象面上有均勻的照度，故不設(shè)漸暈光闌。顯微鏡是小視場(chǎng)大孔徑成像，為獲得大孔徑并保證軸上點(diǎn)成像質(zhì)量，顯微鏡線視場(chǎng)不超過物鏡的1/20,線視場(chǎng)要求：2y<f=20200顯微鏡的分辨率和有效放大率光學(xué)儀器分辨率瑞利判據(jù)：兩個(gè)相鄰的“點(diǎn)”光源所成的像是兩個(gè)衍射斑，若兩個(gè)等光強(qiáng)的非相干點(diǎn)像之間的間隔等于艾里圓的半徑，即一個(gè)像斑的中心恰好落在另一個(gè)像斑的第一暗環(huán)處，則這兩個(gè)點(diǎn)就是可分辨的點(diǎn)。當(dāng)物面在無窮遠(yuǎn)時(shí)，以兩點(diǎn)對(duì)光學(xué)系統(tǒng)的張角可表示兩分辨點(diǎn)的距離，其值為：申=1.22九/D顯微鏡的分辨率分辨率是指在物體表面能夠分解的最小間隔，兩個(gè)發(fā)光點(diǎn)的分辨率為1.22九0.61九G二=2nsinUNA數(shù)值孔徑（NA）越大，分辨率越高。顯微鏡的照明系統(tǒng)臨界照明聚光鏡應(yīng)有與顯微物鏡相同或稍大的NA,聚光鏡前放置的可變光闌為聚光鏡的孔闌改變孔闌大小，可改變進(jìn)入物鏡光束的孔徑角，使之與物鏡的NA相適應(yīng)。特點(diǎn)：光源經(jīng)過聚光鏡所成之像與物平面重合，相當(dāng)于物平面上置光源。缺點(diǎn)：光源表面亮度不均勻或明顯表現(xiàn)出燈絲的結(jié)構(gòu)，影響顯微鏡的觀察效果?？评照彰?/p>

光源經(jīng)聚光鏡前組成像在照明系統(tǒng)的視場(chǎng)光闌上，聚光鏡前組經(jīng)過聚光鏡后組成像于標(biāo)本處，同時(shí)也把照明系統(tǒng)市場(chǎng)光闌成像在無限遠(yuǎn)處使之與遠(yuǎn)心物鏡的入射光瞳重合。光源聚光鏡的聚光鏡前組孔徑光闌HSW聚光鏡后組標(biāo)木光源聚光鏡的聚光鏡前組孔徑光闌HSW聚光鏡后組標(biāo)木圖2-2科勒照明光路圖特點(diǎn)：把光源像成在物鏡入瞳面上。優(yōu)點(diǎn)：可消除臨界照明物平面上光照度不均勻的特點(diǎn)。顯微鏡的工作距離工作距離是指從物鏡前表面中心到被觀察標(biāo)本間滿足工作要求的距離范圍，與物鏡的數(shù)值孔徑成反比。一般情況下，物鏡的數(shù)值孔徑赿大，其工作距離赿小。SPIan1001.25Mil'□TK—羞戟片毎準(zhǔn)SPIan1001.25Mil'□TK—羞戟片毎準(zhǔn)flH(mm)SPlan11QX—0—4裘與雎文車—孔樓魏fl勺圖2-3顯微鏡工作距離示意圖發(fā)明發(fā)現(xiàn)公元前一世紀(jì)，人們就已發(fā)現(xiàn)通過球形透明物體去觀察微小物體時(shí)，可以使其放大成像，這為鏡頭設(shè)計(jì)奠定了基礎(chǔ)。625年,斯泰盧蒂(FraneeseosteUuti)用，倍和10倍的放大鏡(即單式顯微鏡)詳細(xì)描繪出了蜜蜂各部分的圖形,由意大利拾荊學(xué)院(AcademyofLynxEye)出版圖,這是有關(guān)顯微鏡研究的第一部著作。第一架顯微鏡是荷蘭眼鏡工匠詹森父子在1590年前后制成的，但是并沒有發(fā)現(xiàn)顯微鏡的真正價(jià)值。由于初期的復(fù)式顯微鏡有嚴(yán)重的缺陷,荷蘭的列文虎克(AntonyvanLeeuwenhoek,1632一1723)將其畢生精力放在發(fā)展單式顯微鏡上,并將它用于生物觀察。這個(gè)傳奇式人物終于成了顯微鏡學(xué)家和微生物學(xué)的開拓者。發(fā)展階段英國科學(xué)家胡克自制顯微鏡，觀察細(xì)小物體，1665年出版的《顯微圖譜》引入“細(xì)胞”概念；1835年，英國科學(xué)家提出“愛里斑”的概念。由于光的衍射，即使一個(gè)無限小的發(fā)光點(diǎn)在通過透鏡成像時(shí)都會(huì)形成一個(gè)彌散的圖案，即愛里斑；1873年，阿貝和亥姆霍茲各自獨(dú)立發(fā)現(xiàn)正弦條件；1873年，阿貝從他的成像理論推導(dǎo)出關(guān)于顯微鏡分辨距離的公式，首先引用“數(shù)值孔徑”；1878年，阿貝設(shè)計(jì)制成油浸顯微鏡，顯微鏡的分辨本領(lǐng)已達(dá)到其理論極限(|im)020世紀(jì)的前半個(gè)世紀(jì)里,光學(xué)顯微鏡有如下兩個(gè)方面的發(fā)展，第一,為了觀察生物標(biāo)本的不同結(jié)構(gòu),提供多方面信息而設(shè)計(jì)成(或改良)一些特種顯微鏡；第二,僅為工作上的方便而設(shè)計(jì)成的一些特種顯微鏡0暗場(chǎng)顯微鏡暗視野顯微鏡(darkfieldmicroscope)的聚光鏡中央有檔光片，使照明光線不直接進(jìn)入物鏡，只允許被標(biāo)本反射和衍射的光線進(jìn)入物鏡，因而視野的背景是黑的，物體的邊緣是亮的。利用這種顯微鏡能見到小至4nm~200nm的微粒子，分辨率可比普通顯微鏡高50倍。圖3-1暗視野照明方式韋納姆于1853年制成了簡(jiǎn)單的暗場(chǎng)聚光器,西登托普夫和齊格蒙第于1903年采用了從單向側(cè)面照明的暗場(chǎng)觀察方法。暗場(chǎng)顯微鏡的進(jìn)一步發(fā)展是沿著改進(jìn)照明器的方向前進(jìn)的。1907年,西登托普夫制成一次反射拋物面型聚光器.他于1908年又為蔡司廠設(shè)計(jì)出心形面聚光器,同年蔡司廠還制成同心球面聚光鏡,這些都是暗場(chǎng)顯微鏡中優(yōu)良的聚光鏡。紫外顯微鏡使用紫外光源可以明顯提高顯微鏡的分辨率，對(duì)于生物樣品使用紫外光照明還具有獨(dú)特的效果。生物細(xì)胞中的原生質(zhì)對(duì)可見光幾乎是不吸收的，而蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子對(duì)紫外光具有特殊的吸收作用。因此，可以使用紫外光顯微鏡研究單個(gè)細(xì)胞的組成與變化情況。1904年科勒制成紫外顯微鏡，它的分辨本領(lǐng)雖有所提高，但不能達(dá)到.而且技術(shù)復(fù)雜，價(jià)格昂貴。1941年布倫伯格第一次描述了“紫外彩色轉(zhuǎn)移顯微術(shù)”，可用紫外顯微鏡制成無色透明標(biāo)本的彩色圖像。偏光顯微鏡偏光顯微鏡是利用光的偏振特性，對(duì)具有雙折射性（即可以使一束入射光經(jīng)折射后分成兩束折射光）的晶體、液晶態(tài)物質(zhì)進(jìn)行觀察和研究的重要光學(xué)儀器。它的特點(diǎn)是光源前有偏振片（起偏器），使進(jìn)入顯微鏡的光線為偏振光，鏡筒中有檢偏器（一個(gè)偏振方向與起偏器垂直的起偏器）。圖3-2偏光顯微鏡結(jié)構(gòu)1669年，丹麥的巴托林發(fā)現(xiàn)冰洲石的雙折射現(xiàn)象。1667年，惠更斯用光的波動(dòng)理論來解釋此現(xiàn)象。1810年，馬呂斯發(fā)現(xiàn)反射光的偏振現(xiàn)象。1821年，費(fèi)涅耳用光是橫波的理論來闡明“偏振光的干涉。1828年，英國人尼科耳用方解石制成尼科耳棱鏡，成為最重要的偏光元件之一。1834年，薛瓦利埃制成的消色差顯微鏡中已附有偏光元件。1865年，英人柯林斯根據(jù)哈利博士的設(shè)計(jì)制成哈利型顯微鏡，其中附有尼科耳棱鏡，可作為偏光顯微鏡使用。1928年，蘭德發(fā)明了偏振片后，現(xiàn)今絕大多數(shù)的偏光顯微鏡中已用偏振片代替尼科耳棱鏡了。熒光顯微鏡熒光顯微鏡(fluorescencemicroscopy)是以紫外線為光源來激發(fā)生物標(biāo)本中的熒光物質(zhì)，產(chǎn)生能觀察到各種顏色熒光的一種光學(xué)顯微鏡。利用它可研究熒光物質(zhì)在組織和細(xì)胞內(nèi)的分布。透射式熒光顯微鏡主要部件：汞燈光源、激發(fā)濾色鏡、暗場(chǎng)聚光鏡、吸收濾色鏡圖3-3透射式熒光顯微鏡實(shí)物圖

圖3-3透射式熒光顯微鏡原理圖落射式熒光顯微鏡主要部件：汞燈光源、激發(fā)濾色鏡、分色鏡、吸收濾色鏡圖3-5落射式熒光顯微鏡實(shí)物圖S8■比圖3-5落射式熒光顯微鏡實(shí)物圖S8■比H，Bl吐砂嵐卻盹叱片，闈圖平帶魯旳黃比<fi*}a釀律慳垢勻衛(wèi)■-SHIfiirnJMrt.1t.SIOii^ii計(jì)*的比Jh?H-向到皈財(cái)山止的比*a.忡冊(cè)圖3-6落射式熒光顯微鏡原理圖1578年，西班牙的內(nèi)科醫(yī)生和植物學(xué)家莫納德斯第一次記錄了熒光現(xiàn)象。1852年,斯托克斯一1903）在考察奎寧和葉綠素的熒光時(shí),發(fā)現(xiàn)熒光的波長(zhǎng)大于激發(fā)光的波長(zhǎng)（斯托克斯定則）。熒光fluoroscence）這一術(shù)語也是他提出的。1908年，試制成功第一臺(tái)熒光顯微鏡。1914年，有人用喳琳作染料處理纖毛蟲以增加其熒光,開辟了熒光染色的道路。由此開辟了熒光顯微術(shù)的廣闊道路（如熒光免疫技術(shù)）。1938年,用含紫外光特別豐富的超高壓汞燈為光源,為組織學(xué)、細(xì)胞學(xué)和微生物學(xué)等領(lǐng)域中的熒光染色方法奠定了基礎(chǔ)。相襯顯微鏡相襯顯微鏡是利用光的干涉和衍射效應(yīng)把透過標(biāo)本不同區(qū)域的光波光程差轉(zhuǎn)變成振幅差。用于觀察活細(xì)胞和未染色的標(biāo)本，光線只有通過染色標(biāo)本時(shí)其波長(zhǎng)、振幅發(fā)生變化，人眼才能看見，但活細(xì)胞和未染色的標(biāo)本由于光的波長(zhǎng)和振幅不發(fā)生變化，人眼看不到。相襯顯微鏡可以將光波光程差轉(zhuǎn)變成振幅差，使細(xì)胞內(nèi)各種結(jié)構(gòu)之間呈現(xiàn)清晰可見的明暗對(duì)比。,vtlll'i物血.B,vtlll'i物血.B背At圖3-7相襯顯微鏡照明原理如上圖所示，相襯顯微鏡比普通光學(xué)顯微鏡多了2個(gè)部件：在聚光器上增加一個(gè)環(huán)形光闌；在物鏡后焦面增加一個(gè)相板，相板上有一個(gè)環(huán)形區(qū)，通過環(huán)形區(qū)的光比從其它區(qū)域透過的光超前或滯后1/4入，這樣就使通過標(biāo)本不同區(qū)域光波的相位差轉(zhuǎn)變?yōu)檎穹睢?935—1936年間，荷蘭物理學(xué)家塞爾尼克發(fā)現(xiàn)相襯法原理，并制成一種特殊裝置（環(huán)狀光闌和相板），這些裝置可使相位差轉(zhuǎn)變?yōu)楣鈴?qiáng)差，使相位物體產(chǎn)生可見的影像。1936年，蔡司廠生產(chǎn)出第一臺(tái)相襯顯微鏡。塞爾尼克因此獲得了1953年諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)。1947年，0sterberk設(shè)計(jì)成功變偏光相襯顯微鏡也叫變色相襯顯微鏡。干涉相襯顯微鏡干涉相襯顯微鏡利用偏振光，有四個(gè)特殊的光學(xué)組件：偏振器、棱鏡、滑行器和檢偏器。偏振器直接裝在聚光系統(tǒng)的前面，使光線發(fā)生線性偏振。在聚光器中安裝了石英Wollaston棱鏡，可將一束光分解成偏振方向不同的兩束光（x和y）,二者成一小夾角。聚光器將兩束光調(diào)整成與顯微鏡光軸平行的方向。最初兩束光相位一致，在穿過標(biāo)本相鄰的區(qū)域后，由于標(biāo)本的厚度和折射率不同,引起兩束光發(fā)生光程差。在物鏡的后焦面處安裝了第二個(gè)Wollaston棱鏡（滑行器），把兩束光波合并成一束。這時(shí)兩束光的偏振面（x和y）仍然存在。最后光束穿過第二個(gè)偏振裝置（檢偏器）,檢偏器將兩束垂直的光波組合成具有相同偏振面的兩束光,使二者發(fā)生干涉。J7林本像TlfLf卜湘科斯僚槌璉J7林本像TlfLf卜湘科斯僚槌璉一---分允辭肇光辭了如III_一1光山「「兇I閹圖3-8干涉相襯顯微鏡光路圖1893年,荷蘭人西爾克斯提出干涉顯微鏡。1911年,薩亞尼克描述了第一個(gè)雙光束干涉顯微鏡。1931年,列別杰夫于在雅曼干涉折射計(jì)的基礎(chǔ)上改制成雅曼—列別杰夫型干涉顯微鏡。1952年,諾瑪斯基發(fā)明了諾馬斯基裝置,使用這一裝置的儀器叫做微分干涉相襯顯微鏡,成像比相襯顯微鏡清晰,且沒有光輪出現(xiàn)。激光掃描共聚焦顯微鏡20世紀(jì)后半個(gè)世紀(jì)，將激光技術(shù)引入顯微鏡，激光掃描共聚焦顯微鏡以單色激光作為光源，使樣品被激發(fā)出熒光，利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像處理。共聚焦顯微鏡利用激光掃描束經(jīng)照明孔形成點(diǎn)光源對(duì)標(biāo)本內(nèi)焦平面上的每一點(diǎn)掃描，照明孔與檢測(cè)孔相對(duì)于物鏡焦平面是共軛的焦平面上的點(diǎn)同時(shí)聚焦于照明孔和檢測(cè)孔，焦平面以外的點(diǎn)不會(huì)在檢測(cè)孔處成像，這樣就得到了標(biāo)本清晰的光學(xué)切面圖，克服了普通光鏡圖像模糊的缺點(diǎn)。共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別：抑制圖像的模糊，獲得清晰的圖像。具有更高的軸向分辨率，并可獲取連續(xù)光學(xué)切片。增加側(cè)向分辨率。由于點(diǎn)對(duì)點(diǎn)掃描去除了雜散光的影響?！豕釯SM■孔圖3-9激光掃描共聚焦顯微鏡光路圖近場(chǎng)掃面光學(xué)顯微鏡依據(jù)探針原理發(fā)展起來的一種掃描探針顯微技術(shù)（SPM）技術(shù)。分辨率突破光學(xué)衍射極限，達(dá)到10~200nm。其光學(xué)探針尖端的孔徑遠(yuǎn)小于光的波長(zhǎng)。當(dāng)把這樣的亞波長(zhǎng)光孔放置在近場(chǎng)區(qū)域時(shí)，可以探測(cè)到豐富的亞微米光學(xué)信息。采用孔徑遠(yuǎn)小于光波長(zhǎng)的探針代替光學(xué)鏡頭，將小于波長(zhǎng)的超分辨極限的精細(xì)結(jié)構(gòu)和起伏的信息從近場(chǎng)區(qū)的電磁場(chǎng)（隱失場(chǎng)）獲取。顯徴獄筒樣品臺(tái)XY擁描會(huì)—顯徴獄筒樣品臺(tái)XY擁描會(huì)—[fesiF?咒電倍增習(xí)激光束圖3-10近場(chǎng)掃面光學(xué)顯微鏡光路圖1928年，提出“近場(chǎng)探測(cè)原理”。1972年，等人在微波波段(入=3cm)實(shí)現(xiàn)了入/60()的分辨率。年，IBM的發(fā)明了STM。年，實(shí)現(xiàn)了SNOM分辨率為25nm。90年代后,Bell實(shí)驗(yàn)室的解決了鍍Al膜的光纖超探針制備和針尖一樣品間距控制這兩個(gè)難題。倒置顯微鏡倒置顯微鏡(InvertedMicroscope)的組成和普通顯微鏡一樣，物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，前者在載物臺(tái)之下，后者在載物臺(tái)之上。1867年，史密斯制成倒置顯微鏡用于細(xì)胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)和微生物研究。體視顯微鏡法國的奧伯豪澤爾于1840年前后制成了解剖顯微鏡.許多廠商就加以仿制和改進(jìn)。采用兩個(gè)物鏡和兩個(gè)目鏡的體視顯微鏡是蔡廠在美國動(dòng)物學(xué)家格里諾的激勵(lì)下于1896年制成的,現(xiàn)在許多書上稱之為格里諾顯微鏡(greenoughmicroscope),它實(shí)質(zhì)上就是今天的小型體視顯微鏡。袖珍顯微鏡1665年,GinseppeCampani做成了一個(gè)木制的小顯微鏡,可視為袖珍顯微鏡的先驅(qū).1776年西森(Jeremiahsisson)根據(jù)Demai-nbray的設(shè)計(jì)制成了袖珍顯微鏡。重大事件16世紀(jì)末荷蘭眼鏡商Janssen父子發(fā)明原始光學(xué)顯微鏡，兩個(gè)凸鏡放在一個(gè)筒中，可以放大物體。荷蘭人AnthonyVonLeeuwenhoek和英國人RobertHooke在成像原理和實(shí)踐中不斷改進(jìn)，實(shí)現(xiàn)光學(xué)顯微鏡雛形。1665年胡克提出細(xì)胞概念。1835年，英國科學(xué)家提出“愛里斑”的概念。1873年，德國著名科學(xué)家ErnstAbbe提出了著名的阿貝光學(xué)衍射極限理論。1993年，EricBetzing發(fā)展了掃描近場(chǎng)光學(xué)顯微鏡，突破光學(xué)衍射極限2006年是超高分辨率熒光顯微鏡技術(shù)發(fā)展的重要一年,Betzing和Lippincott-Schwarz以及合作發(fā)明了基于熒光蛋白單分子定位原理的PALM技術(shù)；同時(shí)，哈佛大學(xué)莊小威研究組發(fā)表了基于熒光染料單分子定位的STOPM技術(shù);隨后,SamuelHess研究組也獨(dú)立發(fā)明了FPALM技術(shù)。本世紀(jì)研究成果與趨勢(shì)超高分辨率顯微鏡超高分辨率熒光顯微技術(shù)通過應(yīng)用一系列物理原理、化學(xué)機(jī)制和算法“突破”了光學(xué)衍射極限，把光學(xué)分辨率提高了幾十倍。超高分辨率熒光顯微技術(shù)大體可分為兩類，一類通過調(diào)制照明光斑縮小系統(tǒng)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)來實(shí)現(xiàn)超分辨成像，主要貢獻(xiàn)者包括諾貝爾獎(jiǎng)得主StefanHell以及MatsGustafsson;另一類則是基于單分子定位的超分辨技術(shù)，主要貢獻(xiàn)者包括諾貝爾獎(jiǎng)得主EricBetzig、以及哈佛大學(xué)莊小威教授和SamuelHess?；邳c(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)調(diào)制的超分辨率技術(shù)受激發(fā)射損耗（TED）顯微技術(shù)基于受激發(fā)射損耗（STED）顯微技術(shù)，通過兩個(gè)脈沖激光，使樣品發(fā)射熒光的體積限制在非常小的范圍內(nèi)。通過減少激發(fā)光的光斑大小，從而直接減少點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的半高寬來提高分辨率，成像突破衍射極限，分辨率先達(dá)100nm,再進(jìn)一步達(dá)到30nm分辨率。2002年，Patterson和Lippincott-Schwartz[14]首次利用一種綠色熒光蛋白（GFP）的變種（PA-GFP）來觀察特定蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)動(dòng)軌跡。同年德國科學(xué)家EricBetzig認(rèn)識(shí)到，結(jié)合這種熒光蛋白的發(fā)光特性，可以來突破光學(xué)分辨率的極限。2000年，Hell用一束激光激發(fā)熒光分子發(fā)光，再用另一束環(huán)狀激光消除激發(fā)光周圍的熒光，實(shí)現(xiàn)了超高分辨率成像，將光學(xué)顯微鏡分辨率提高10倍。2008年超高分辨率熒光顯微鏡問世，史蒂芬?赫爾（Stefanw.Hell）、埃里克?本茨格（EricBetzig）和威廉?默爾納（William）因在超分辨率熒光顯微技術(shù)方面的貢獻(xiàn)共享了2014年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。飽和結(jié)構(gòu)照明顯微技術(shù)利用飽和結(jié)構(gòu)照明顯微技術(shù)(saturatedstruetureilluminationmicroscopy,SSIM)分辨率可以小于50nm。其原理是利用兩束強(qiáng)光干涉，使絕大多數(shù)熒光分子達(dá)到飽和，僅有干涉圖像陰影里的體積非常小的熒光未飽和，當(dāng)增加光強(qiáng)度，這些體積變得非常小，比任何PSF的寬度還小。2000年，美國科學(xué)家