耐力訓(xùn)練及補(bǔ)救性多糖對大鼠血清il-1和pbmc培養(yǎng)后血清il-1、下丘腦室旁核il-1r表達(dá)的影響

長期高強(qiáng)度訓(xùn)練增加了運動員呼吸道感染的風(fēng)險，這與運動員的免疫功能下降有關(guān)。神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)具有重要的免疫調(diào)節(jié)功能,下丘腦室旁核(PVN)是下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸活動的直接控制部位,下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸激活引起的外周效應(yīng)為糖皮質(zhì)類固醇(主要為皮質(zhì)醇)分泌增加,這是機(jī)體主要的應(yīng)激反應(yīng)體系之一,高濃度的糖皮質(zhì)激素可選擇性抑制細(xì)胞免疫功能。運動可誘發(fā)機(jī)體多種細(xì)胞因子發(fā)生變化,許多細(xì)胞因子有激活HPA軸活動的作用,IL-1、IL-6等對HPA軸有強(qiáng)興奮作用。本研究采用流動水池建立大鼠遞增負(fù)荷游泳訓(xùn)練模型,觀察6周耐力訓(xùn)練后大鼠血清和外周血單核細(xì)胞(PBMC)培養(yǎng)后上清液IL-1β含量變化、下丘腦室旁核IL-1R表達(dá)和血清皮質(zhì)酮含量的變化,探討IL-1及其受體與HPA軸活化的可能關(guān)系和意義,同時選用牛膝多糖和黃芪多糖進(jìn)行干預(yù),為改善耐力訓(xùn)練引起的免疫低下尋找干預(yù)措施。1材料和方法1.1大鼠的篩選6周齡、體重110~130g的SPF/VAF級雄性Wistar大鼠48只(購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,質(zhì)量合格證號0043356),在清潔級動物房常規(guī)飼養(yǎng)近1周后,通過游泳能力篩檢篩選出40只大鼠,按體重隨機(jī)分為安靜對照組、耐力訓(xùn)練組、訓(xùn)練+黃芪多糖組、訓(xùn)練+牛膝多糖組4組,每組10只。清潔級動物房室內(nèi)溫度為20℃~26℃,濕度50%~70%,晝夜節(jié)律用日光燈控制,每日光照時間12小時(早8點~晚8點),大鼠分籠飼養(yǎng),每籠最多5只,自由進(jìn)食和飲水。1.2灌胃1次大型半干2次黃芪多糖(APS)提取物(購自浙江霍夫曼德公司)和牛膝多糖(APBS)提取物(購自上海實久科技有限公司)用雙蒸水配制。從正式實驗開始,每日上午訓(xùn)練開始前60分鐘對大鼠進(jìn)行灌胃1次。訓(xùn)練+黃芪多糖組按2g·kg-1劑量(相當(dāng)于黃芪多糖1g·kg-1)灌服黃芪多糖提取物,訓(xùn)練+牛膝多糖組按1g·kg-1劑量(相當(dāng)于牛膝多糖0.7·kg-1)灌服牛膝多糖提取物,安靜對照組和耐力訓(xùn)練組灌服等量安慰劑(雙蒸水)。1.3水流量4.2安靜對照組不運動,其他3組在流動游泳水池中進(jìn)行訓(xùn)練。水深50~60cm(約為大鼠體長的1.5~2倍),水溫32±2℃,水流量4m3/h。每天上、下午各訓(xùn)練1次,每周訓(xùn)練5天,共6周,訓(xùn)練時間由40min/d逐漸增加到160min/d,具體訓(xùn)練方案見表1。1.4血管腹主動脈采血大鼠腦il-1r最后一次訓(xùn)練結(jié)束36小時后取材。采用25%烏拉坦按0.5ml·100g-1體重的劑量進(jìn)行腹腔麻醉,真空肝素鋰抗凝采血管腹主動脈取血,用于外周血單個核細(xì)胞(PBMC)的分離與培養(yǎng),帶分離膠全血真空管制備血清后放于-80℃低溫冰箱,用于測定IL-1β、睪酮、皮質(zhì)醇。酒精消毒腹部后剖開腹腔,行左心室至主動脈插管,經(jīng)4%多聚甲醛約150ml灌注固定后,取出腦組織,每組取3只大鼠腦組織測定下丘腦IL-1R。因測試試劑和采血量限制,部分指標(biāo)測試樣本數(shù)有所減少。1.5測試指標(biāo)和方法1.5.1試劑盒的制備采用ELISA方法測定血清IL-1β,試劑盒為美國Biosource公司產(chǎn)品。采用放射免疫分析法測定血清睪酮和皮質(zhì)酮,試劑盒均為美國DSL公司產(chǎn)品。1.5.2細(xì)胞培養(yǎng)濃度調(diào)整在超凈臺上按無菌操作分離PBMC細(xì)胞。分離方法及其無菌細(xì)胞懸液的制備方法見文獻(xiàn),最后用RPMI1640將細(xì)胞懸液濃度調(diào)整到2×106個細(xì)胞/ml。在24孔板上每個樣品設(shè)2孔,每孔加細(xì)胞懸液1ml,加入有絲分裂原ConA(終濃度為5μg/ml),將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36小時后收獲培養(yǎng)上清液,2000r/min離心10分鐘,上清移出置-80℃凍存,用ELISA方法測定上清液IL-1β(試劑盒為美國Biosource公司產(chǎn)品)。1.5.3免疫組化染色取腦組織放入30%蔗糖溶液浸泡,4℃過夜。經(jīng)干冰-正己烷(-70℃)驟冷,參照大鼠腦圖譜進(jìn)行下丘腦室旁核定位,做額狀面連續(xù)切片(20μm),將4張切片裱于同一張玻片上。腦組織Nissl染色:Nissl染液20分鐘,蒸餾水洗,50%酒精分色,無水乙醇脫水,二甲苯透明,樹膠封固。腦組織免疫化學(xué)染色:冷凍切片經(jīng)冷風(fēng)吹干后,用PV-6001/6002二步法顯示下丘腦室旁核IL-1R。加入3%H2O2孵育10分鐘,阻斷內(nèi)源性過氧化氫酶;加入兔抗鼠多克隆抗體(1:100),37℃放置1h,4℃冰箱過夜,第2日取出,室溫放置1h,用0.01MPBS沖洗;滴加羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體(1:100),37℃,1h,用0.01MPBS沖洗;加入DAB復(fù)合物顯色5~10分種,用0.01MPBS沖洗,蒸餾水終止反應(yīng);50%、70%、80%、95%酒精脫水各5分鐘,100%酒精脫水5分鐘2次,二甲苯透明,樹膠封固。光密度測定:免疫組織化學(xué)染色后,每組取3只動物,每只動物取2~3張片子,每張片子隨機(jī)取3個視野,在相同的光學(xué)和光源條件下,采用Leica公司Q550CW圖像分析系統(tǒng)采集圖像和Qwin圖像分析軟件分析測定觀察部位的平均光密度值(AOD)。1.6方差及不同大小的anva使用SPSSforWindows11.0統(tǒng)計分析軟件完成,用One-WayANOVA進(jìn)行方差分析,方差齊次性時,采用LSD法進(jìn)行多組之間比較;方差不齊次性時,用Tamhane’sT2法復(fù)選項進(jìn)行多組之間比較。統(tǒng)計數(shù)值用mean±SD表示,顯著性差異水平α=0.05。2結(jié)果2.1pbmc對大鼠il-1的影響表2顯示,耐力訓(xùn)練組血清IL-1β含量最高,與安靜對照組相比有顯著性差異(P<0.01)。2個補(bǔ)充組大鼠血清IL-1β顯著低于耐力訓(xùn)練組(P<0.05),而與安靜對照組水平接近(P>0.05)。耐力訓(xùn)練組大鼠PBMC培養(yǎng)后上清液IL-1β含量最高,與安靜對照組相比有顯著性差異(P<0.01)。2個補(bǔ)充組PBMC生成IL-1β能力高于安靜對照組(分別高26.1%、21.3%),低于耐力訓(xùn)練組(分別低10.2%、13.6%),但均無統(tǒng)計學(xué)意義。2.2大鼠臟器旁核il-1r表達(dá)水平由表3可見,耐力訓(xùn)練組大鼠下丘腦室旁核IL-1R表達(dá)最高,與安靜對照組相比有顯著性差異(P<0.05)。補(bǔ)充牛膝多糖組大鼠下丘腦室旁核IL-1R表達(dá)與安靜對照組相同,顯著低于耐力訓(xùn)練組(P<0.01)。補(bǔ)充黃芪多糖組高于安靜對照組,略低于耐力訓(xùn)練組,但均無統(tǒng)計學(xué)意義。2.3皮質(zhì)酮與強(qiáng)力訓(xùn)練組p>0.1表4顯示,耐力訓(xùn)練組大鼠血清皮質(zhì)酮含量最高,與安靜對照組相比有顯著性差異(P<0.05)。補(bǔ)充牛膝多糖組血清皮質(zhì)酮與安靜對照組相同,但顯著低于耐力訓(xùn)練組(P<0.01);補(bǔ)充黃芪多糖組血清皮質(zhì)酮低于耐力訓(xùn)練組(低17.3%),高于安靜對照組(高26.5%)。耐力訓(xùn)練組大鼠血清總睪酮最低,與安靜對照組相比有顯著性差異(P<0.05)。2個補(bǔ)充多糖組血清總睪酮分別高于耐力訓(xùn)練組54.3%和54.4%,低于安靜對照組21.4%和21.2%。3運動與血液相關(guān)指標(biāo)的變化目前,關(guān)于高強(qiáng)度、長期運動影響機(jī)體免疫功能的確切機(jī)制尚不清楚。高強(qiáng)度、長期運動訓(xùn)練是一種刺激,會引起機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng),機(jī)體出現(xiàn)的應(yīng)激反應(yīng)首先涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)機(jī)能,繼而出現(xiàn)內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)機(jī)能的改變。研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞因子不但是重要的免疫調(diào)節(jié)因子,而且具有廣泛的中樞調(diào)節(jié)作用。從細(xì)胞因子-神經(jīng)-內(nèi)分泌調(diào)節(jié)角度探討訓(xùn)練對免疫功能的影響已經(jīng)引起一些學(xué)者的關(guān)注。我們以前的研究發(fā)現(xiàn),6周耐力訓(xùn)練可引起大鼠T細(xì)胞數(shù)量和功能變化,主要表現(xiàn)為活化的T淋巴細(xì)胞數(shù)量下降、T細(xì)胞亞群中CD4+細(xì)胞數(shù)量下降及CD4+/CD8+比值下降、T淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化能力降低等,這些變化提示6周的耐力訓(xùn)練可引起大鼠細(xì)胞免疫功能下降。研究顯示運動訓(xùn)練能引起體液中細(xì)胞因子的改變。一次運動或長期訓(xùn)練均可使血漿或血清IL-1水平或單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1的能力顯著提高。有學(xué)者提出,長時間劇烈運動時,由于內(nèi)臟器官與運動器官之間血液重新分配,機(jī)體高代謝反應(yīng)以及其它未確定的原因,腸腔內(nèi)革蘭氏陰性菌的胞壁成份LPS穿過腸粘膜屏障移位進(jìn)入血液,運動者會出現(xiàn)類內(nèi)毒素血癥反應(yīng)。LPS進(jìn)入血液后可以刺激單核-巨噬細(xì)胞合成與分泌IL-1等細(xì)胞因子,推測這是運動后血漿IL-1等細(xì)胞因子濃度增加的一個主要原因。同時IL-1被認(rèn)為是運動應(yīng)激刺激釋放的首批細(xì)胞因子之一,被分類為促炎性細(xì)胞因子,通過與相應(yīng)高親和力受體IL-1R結(jié)合發(fā)揮作用,有致熱和介導(dǎo)炎癥的作用,與機(jī)體免疫反應(yīng)有密切關(guān)系。本研究結(jié)果顯示,6周耐力訓(xùn)練能引起大鼠血清IL-1β含量和PBMC生成IL-1β的能力提高,而訓(xùn)練同時補(bǔ)充黃芪多糖提取物或牛膝多糖提取物可防止血清中IL-1β含量明顯升高以及PBMC生成IL-1β過多的趨勢。在生理情況下,腦內(nèi)的血管內(nèi)皮細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、星形細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞均具有合成IL-1的能力。外周血中少量IL-1可經(jīng)腦室周圍組織如正中隆起、終板血管器等進(jìn)人中樞神經(jīng)系。IL-1有IL-1α和IL-1β兩種亞型,均須與IL-1R結(jié)合后才發(fā)揮作用。IL-1和IL-1R在中樞神經(jīng)系統(tǒng)定位于下丘腦和腦干等部位,下丘腦弓狀核、室旁核等均有IL-1β的免疫陽性細(xì)胞,下丘腦、海馬、小腦、大腦皮質(zhì)等部位均有IL-1R及受體mRNA表達(dá)。下丘腦室旁核是HPA軸活動的直接控制部位,IL-1對HPA軸主要是興奮作用,引起的外周效應(yīng)為糖皮質(zhì)類固醇(主要為皮質(zhì)醇)分泌增加,具體表現(xiàn)為IL-1作用于下丘腦神經(jīng)元,通過HPA軸引起促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)及其前體阿黑皮原mRNA表達(dá),最終血漿糖皮質(zhì)激素(如皮質(zhì)酮)升高。IL-1還能抑制下丘腦-垂體-性腺軸功能(HPG),從而抑制促性腺激素誘導(dǎo)的睪酮分泌,表現(xiàn)為血液睪酮含量下降,下丘腦室旁核IL-1R表達(dá)升高將有利于IL-1發(fā)揮對HPA軸的激活和對HPG軸的抑制作用。本研究結(jié)果顯示,6周耐力訓(xùn)練引起大鼠下丘腦室旁核IL-1R表達(dá)升高,同時耐力訓(xùn)練大鼠血清中皮質(zhì)酮含量增加、總睪酮含量明顯下降,提示下丘腦IL-1R表達(dá)升高、血清中IL-1增高及血清皮質(zhì)酮升高、睪酮下降這些在耐力訓(xùn)練中的改變與IL-1及IL-1R對HPA軸的激活和對HPG軸的抑制作用表現(xiàn)的外周效應(yīng)一致。本實驗關(guān)于2種中藥多糖的干預(yù)研究顯示,訓(xùn)練同時補(bǔ)充牛膝多糖或黃芪多糖有防止大鼠下丘腦室旁核I