絲素蛋白在小口徑人工血管中的應(yīng)用

納米納米血管,制備雙抗凝劑1.關(guān)于這個問題的已知信息：目前，大規(guī)模合金材料主要是聚丙烯、絲綢和其他材料，因此長期有效性無法得到滿足。2文章增加的新信息:絲素蛋白具有生物相容性良好,易于化學改性,有助于內(nèi)皮細胞定植等諸多小口徑人工血管必須的特性。結(jié)合最新的納米材料技術(shù),利用靜電紡絲工藝,嘗試通過調(diào)整電紡參數(shù)將絲素蛋白電紡為雙層人工血管,從血管整體順應(yīng)性、抗凝性及促內(nèi)皮細胞附著等諸多方面全面強化血管抗凝功能,以獲得最理想的遠期通暢效果。3臨床應(yīng)用的意義:隨著納米技術(shù)、組織工程學的發(fā)展,結(jié)合最新科技前沿諸如三維打印等技術(shù)的問世,絲素蛋白這種理想的生物材料在人工血管制作中的應(yīng)用必將擁有更廣闊的前景。0小口徑人工血管的未來人工血管作為一種修復和替代病變血管的假體,是一種非來源于自然器官和組織的血管代用品,亦稱為人造血管。目前諸如聚四氟乙烯和聚對苯二甲酸乙二醇酯(滌綸)人造血管已經(jīng)投入商業(yè)量產(chǎn),并取得滿意的遠期效果。據(jù)統(tǒng)計,聚四氟乙烯及滌綸人工血管(內(nèi)徑≥6mm)5年通暢率分別可達到26%-46%和42%-62%,而動物實驗表明,小口徑人工血管(內(nèi)徑<6mm)的遠期通暢率卻只有20%-25%。當今,冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)發(fā)病率不斷提高,冠狀動脈旁路移植作為國際公認治療冠心病的最有效手段,一直受到自體血管橋取材的限制,如何得到合適的血管假體成為亟需解決的問題。因此小口徑人工血管的開發(fā)一直是近年來熱點研究問題。目前,由于生物相容性材料擁有一系列獨特的物理、化學和生物學特性,受到越來越多的關(guān)注。其中,絲素蛋白提取自蠶絲蛋白,而蠶絲是中國自古以來就有廣泛應(yīng)用的農(nóng)產(chǎn)物。蠶絲取材方便,并且擁有理想的組織相容性,優(yōu)良的機械性能這些人工血管必須具備的特性。中國早在21世紀60年代就開展研制絲質(zhì)血管,臨床應(yīng)用于腹主動脈替換等已取得較大成功。目前上海絲綢研究所已制成多種類型和不同直徑的真絲人造血管。近年來,來自日本及國內(nèi)眾多學者將絲素蛋白應(yīng)用到小口徑人工血管的研發(fā)過程中,得到的人工血管擁有較好的抗血栓性及優(yōu)秀的機械強度,在動物實驗中也取得了滿意的遠期通暢率。文章旨在概述絲素蛋白在小口徑人工血管中的具體應(yīng)用。1小口徑人造血管血液分辨率應(yīng)用計算機檢索中國知網(wǎng)、Medline及ScienceDirect數(shù)據(jù)庫1980年1月至2013年12月有關(guān)小口徑人造血管血液相容性方面的文獻,中文檢索詞為“人工血管,絲素蛋白”,英文檢索詞為“Vasculargraft,silkfibroin”。1.2納入研究文獻的類型與人造血管研究現(xiàn)狀、人造血管血液相容性有關(guān)的文獻;與絲素蛋白性能及絲素蛋白人工血管制作工藝相關(guān)的文獻,以及最新人工血管前沿科技信息。重復研究或不相干文章。1.3數(shù)據(jù)提取共檢索到213篇文獻,其中中文文獻62篇,英文文獻151篇,排除與研究目的相關(guān)性及內(nèi)容陳舊、重復的文獻159篇,納入54篇符合標準的文獻進行綜述。1.4質(zhì)量評價符合納入標準的54篇文獻中,其中文獻介紹了絲素蛋白的應(yīng)用歷史及人工血管的演變,文獻[6-10]探討了絲素蛋白的化學結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì),文獻[11-13]通過細胞動物實驗驗證絲素蛋白的組織相容性,文獻[14-18]探討了絲素蛋白特殊的抗凝功能及促內(nèi)皮細胞生長功能,文獻[19-23]介紹了絲素蛋白脫膠的普遍方法,文獻[24-42]探討了靜電紡絲技術(shù)的原理特性及在絲素蛋白人工血管中的應(yīng)用,文獻[43-47]探討了多層人工血管的研究近況,文獻[48-51]探討了組織工程學人工血管支架中絲素蛋白的應(yīng)用及特性,文獻[52-54]探討了關(guān)于小口徑人工血管的最新科研近況及方法。2結(jié)果的結(jié)果絲素蛋白是理想的人工血管應(yīng)用材料,靜電紡絲技術(shù)制作的納米級絲素蛋白紡絲構(gòu)成的多層血管將從全方位提升血管的遠期通暢率。2.1絲素蛋白生物局域生物結(jié)構(gòu)的調(diào)控蠶絲蛋白由絲素蛋白和絲膠兩部分組成。絲素蛋白是蠶絲中主要的組成部分,通常通過蠶繭脫膠過濾得到,約占蠶絲蛋白質(zhì)量的70%。其中絲素蛋白由輕、重兩條鏈構(gòu)成,相對分子質(zhì)量分別為25000和325000,兩條鏈緊緊纏繞,結(jié)構(gòu)致密。一般認為絲素蛋白具有從無規(guī)卷曲到絲素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型等4種高級結(jié)構(gòu),這些高級結(jié)構(gòu)具有不同的物理性能,之間可以相互轉(zhuǎn)化。研究表明絲素蛋白構(gòu)象轉(zhuǎn)變的本質(zhì)是氫鍵的重組過程,并且SilkⅠ結(jié)構(gòu)包含水合作用,而轉(zhuǎn)變成SilkⅡ后則不存在水合作用,SilkⅠ結(jié)構(gòu)是絲素蛋白無規(guī)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)為SilkⅡ結(jié)構(gòu)的中間結(jié)構(gòu)。絲素在高濕、高溫、高滲,或加入乙醇、甲醇、聚乙二醇等其他物質(zhì)時容易形成SilkⅡ結(jié)構(gòu)。在多種改變絲蛋白構(gòu)象的方法中,用醇處理是最直接、簡便、有效的方法,已經(jīng)得到了深入研究和廣泛應(yīng)用。絲素蛋白的這些化學特性,可以通過控制絲素蛋白生成不同的結(jié)構(gòu)及各種結(jié)構(gòu)之間的比例得到不同需要的性能。蠶絲作為外科縫合材料已有幾個世紀的歷史,但是早期應(yīng)用蠶絲縫線常導致機體產(chǎn)生較嚴重的炎癥反應(yīng)和異物反應(yīng),之后的研究發(fā)現(xiàn),脫膠處理后的絲素蛋白在體內(nèi)實驗中所引起的機體炎癥反應(yīng)較可吸收外科縫線還要輕微,這就說明分離提純的絲素蛋白有著優(yōu)秀的生物相容性。動物實驗方面,上海材料研究測試中心在小鼠身上分別對醫(yī)用絲素蛋白進行了細胞毒性及溶血反應(yīng)測試,結(jié)果表示絲素蛋白無細胞毒性。Dal-Pra將絲素蛋白支架植入大鼠皮下6個月后,顯示支架被上皮血管等填充生長,未發(fā)現(xiàn)細胞免疫反應(yīng)發(fā)生。這些研究表明絲素蛋白不會引起明顯的體內(nèi)炎性反應(yīng),具有良好的生物相容性。絲素蛋白擁有促表皮生長的功能,謝菁等使用絲素膜表面培養(yǎng)豬髖動脈內(nèi)皮細胞株,結(jié)果顯示絲素薄膜是對貼壁依賴型內(nèi)皮細胞的生長具有支持作用的表面材料,并可通過整合酸性成纖維細胞生長因子,增強對內(nèi)皮細胞生長的促進功能。Yamada等研究發(fā)現(xiàn)絲素蛋白膜可促進人皮膚成纖維細胞的增殖生長,并通過分離絲素蛋白分解肽,確定絲素蛋白H鏈N-末端有2段基序NINDFDED和VITTDSDGNE對人皮膚成纖維細胞增殖有促進作用。Inouye等發(fā)現(xiàn)用溴化鋰溶解得到的絲素蛋白可以很好地支持人和動物細胞系的黏附和增殖,這主要是由于絲素蛋白序列中的羧基端可以同帶有負電荷的細胞表面形成緊密黏合。此外,抗凝作用是小口徑人工血管保持通暢的另一個必要因素。絲素蛋白的氨基酸排列是以-(Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ser)-重疊結(jié)構(gòu)為特征的,其中Ser(絲氨酸)之間的距離,與肝磷脂中硫酸基間的距離十分相近,因此如果在絲素中的絲氨酸上引入硫酸基進行改性處理就可以增加其血液相容性。Tamada報道將絲素蛋白磺酸化后具有抗凝血作用。絲素蛋白分子擁有穩(wěn)定安全的生物活性,結(jié)構(gòu)已知,自身同降解產(chǎn)物均無生物毒性?？梢酝ㄟ^調(diào)控化學結(jié)構(gòu)構(gòu)造不同的物理機械性能以滿足特定需求。此外,還擁有促細胞生長,抗凝等諸多優(yōu)點?？煽氐臋C械性能可以調(diào)節(jié)出合適的血管順應(yīng)性,以滿足體內(nèi)動態(tài)的血流波動環(huán)境,此外,抗凝及促內(nèi)皮細胞定植能力都是提高人工血管假體遠期通暢率的重要性質(zhì),并且可以通過共價嫁接功能集團來提高絲素蛋白的血液相容性,方法簡單,效果可靠。2.2納米級纖維紡絲技術(shù)絲膠蛋白易于溶于熱堿水中,在中國,自古就有用熱堿水沸煮蠶絲達到脫膠目的的手法。目前,實驗室常用的脫膠溶液主要包括高濃度尿素,中性pH值肥皂水或碳酸鈉溶液,還有韓國學者用電解純水制備出強堿性電解水,其實驗證明此電解水可減少脫膠過程對絲素蛋白機械性能的影響。其中最常用的方法將蠶絲蛋白放入2g/L,5g/LNa2CO3溶液煮沸30min,然后用蒸餾水反復沖洗,以去除附著的少量絲膠蛋白。然后放入76-78℃的CaCl-CH-CHOH–HO(moleratio=1∶2∶8)溶液中(另有使用溴化鋰作為溶劑),不停攪拌,直至完全溶解。隨后應(yīng)用透析膜反復進行透析,最終可得到絲素蛋白溶液。溶解后的絲素蛋白于去離子水中透析至鹽離子完全移除,在室溫、鼓風烘箱、冷凍抽干機中可分別制得室干膜、烘干膜及海綿狀冷凍膜。Smith等曾偶然于動物實驗體內(nèi)的絲質(zhì)縫線中發(fā)現(xiàn),體內(nèi)細胞組織可以透過織物的孔隙在內(nèi)部結(jié)構(gòu)生長,形成類似于血管內(nèi)皮的包覆體,從而使修復材料逐漸被機化而不致形成血栓。以此為啟發(fā),隨后Voorhees等將聚乙烯維縈人工血管成功應(yīng)用于臨床,隨后研制出奧綸及尼龍人工血管。隨著纖維材料和生物醫(yī)學材料的不斷發(fā)展,有孔隙的人造血管不斷出現(xiàn),合適的孔隙有利于內(nèi)皮細胞快速形成穩(wěn)定覆蓋,以提高血管整體的遠期通暢率。現(xiàn)如今生物醫(yī)學應(yīng)用材料已逐漸進入納米級材料范疇,目前大量研究表明,直徑接近細胞外基質(zhì)的納米級纖維可同內(nèi)皮細胞形成穩(wěn)定鏈接,更能促進內(nèi)皮細胞增殖生長。Bondar和他的同事分別對比了血管內(nèi)皮細胞在納米及微米級纖維絲增殖過程中細胞形態(tài),細胞間接觸及黏附分子表達水平的差別,結(jié)果顯示納米級纖維組在促內(nèi)皮細胞定植及細胞與基質(zhì)交互作用水平方面明顯優(yōu)于微米級纖維組。大量研究表明,促使人工血管的表面盡快內(nèi)皮化,形成具有功能的完整內(nèi)皮層可以有效抑制血管狹窄及堵塞的發(fā)生。Soffe及Zhang等利用納米級絲素電紡絲制作出管狀血管,體外實驗用人冠狀動脈平滑肌細胞及人大動脈內(nèi)皮細胞孵化一段時間后,觀察到細胞都有非常穩(wěn)定緊密的附著。這些都足以證明納米級纖維可以有效促進細胞生長、黏附和增殖。綜上,模擬細胞外基質(zhì)的納米級纖維可以有效促進細胞增殖,形成快速、穩(wěn)定的貼附。而目前,得到近于細胞外基質(zhì)的納米級纖維,一般有3種方法-自體組裝、相分離和靜電紡絲。自體組裝及相分離方法一般操作復雜,生產(chǎn)效率較低,所以在推廣應(yīng)用及制作環(huán)節(jié)限制了其的發(fā)展。而靜電紡絲技術(shù)是一種獨特的得到納米纖維的方法,已日益引起人們的重視,其操作簡單,費用低廉,可以大規(guī)模量化生產(chǎn)。此外,通過調(diào)整靜電紡絲過程中的參數(shù),還能可控的將多種聚合材料電紡為直徑從幾微米纖維到幾十納米不等的纖維。靜電紡絲技術(shù)最早為Formhals在納米纖維無紡布的構(gòu)建中使用,而后該技術(shù)才廣為人知。其基本原理是使帶電流體在靜電場中流動與變形,最終得到纖維狀物質(zhì)。一般的靜電紡絲機由噴絲頭、高壓電場、接收器組成,通過噴絲頭噴出的電紡液在電場中受力運動形成納米級纖維紡絲,然后于接收板上獲得?？梢酝ㄟ^調(diào)節(jié)注射速率、電場強度、噴絲頭距接收器距離等參數(shù)得到不同納米級別直徑的纖維紡絲。進行靜電紡織,首先需要將絲素蛋白溶解形成電紡液,有學者使用再生蛋白水溶液,也可以將絲素蛋白溶于甲酸或者六氟異丙醇制備出電紡液,進行電紡。但經(jīng)過研究分析,單純由絲素溶液進行電紡,得到的纖維機械強度均比原始絲的機械性能有所降低,不能達到人工血管等材料的強度要求。因此有人嘗試將絲素蛋白與其他高聚物共紡,以提高血管假體的機械強度,McClure等把絲素蛋白分別與聚己內(nèi)酯和聚二惡烷酮共混進行電紡,另有使用絲素蛋白同明膠共混,得到的絲素蛋白纖維紡絲抗斷強度及延展性能等都有明顯的改善。另外,有多名學者在電紡溶液中直接加入肝素鈉及促內(nèi)皮生長因子等來增加血管的血液相容性。Wang等利用靜電紡絲技術(shù),將電紡液濃度,電場強度,噴絲流速及噴絲頭與收集器之間的距離等參數(shù)分別設(shè)定為13%,30kV,0.2mL/h,13cm,制作出納米級人工血管支架,對比了等離子肝素接枝及直接共混肝素鈉溶液電紡兩種方式處理的人工血管。體外凝固時間實驗表明,肝素修飾支架活化部分凝血活酶時間、凝血酶原時間和凝血酶時間均明顯優(yōu)于未經(jīng)處理的單純絲素蛋白血管。目前存在多種血管表面改性,包括物理、化學、生物等多種方式,但改性集團同材料之間都難以形成穩(wěn)固的鏈接,共混電紡為材料改性提供了一種很好的選擇。靜電紡絲技術(shù)是得到納米級纖維紡絲的最佳方式,可以通過甲醛、乙醇等后處理增加機械性能,以及共混功能集團改善材料的生物相容性。絲素蛋白取材方便,機械性能良好,目前幾種絲素蛋白電紡絲血管,對比膠原等其他常用天然生物材料,無論在抗拉強度上及機械性能方面都表現(xiàn)出明顯的優(yōu)越性。自體血管是由多種蛋白及細胞構(gòu)成的極其復雜的多層組織結(jié)構(gòu)。不同層分的細胞在維持血管功能機械強度上共同發(fā)揮作用,以適應(yīng)高血流速,以及動態(tài)波動壓力構(gòu)成的內(nèi)部復雜環(huán)境。自體血管壁由3層結(jié)構(gòu)組成,分別是血管內(nèi)膜、平滑肌層及血管外膜。內(nèi)膜直接與血流接觸,由單層內(nèi)皮細胞構(gòu)成,是防止血栓形成的主要屏障;平滑肌層較厚,由多層平滑肌細胞構(gòu)成。針對血管內(nèi)的復雜環(huán)境,已有眾多學者嘗試制作多層人工血管,以模擬自體血管的抗凝功能、機械強度及彈性等。之前,研究者常在已有滌綸人工血管上采用簡單浸漬涂層方法模擬自體血管內(nèi)膜,密封管壁孔隙,減少人工血管滲漏,同時便于組織的浸潤生長和生物性愈合。由于絲素蛋白相比傳統(tǒng)材料對成纖維細胞和內(nèi)皮細胞均有較好的黏附性,取材方便,具有優(yōu)良的生物相容性,既往有研究應(yīng)用甲醛蒸汽將絲素蛋白溶液與滌綸血管交聯(lián)制備人工血管,相比傳統(tǒng)滌綸血管可以更快內(nèi)膜化,同時滌綸血管無明顯機械性能損失。同樣,在原有機械性能良好血管表面覆膜的技術(shù)也是試圖模擬血管內(nèi)皮的抗凝功能,提高血管遠期通暢率,國內(nèi)學者根據(jù)肝素抗凝機制在絲素蛋白膜中整合磺酸基團,然后分別利用等離子技術(shù)與人工血管交聯(lián),體外實驗已證明血管的抗凝性明顯增強。目前,已有許多學者利用絲素制作出多層人工血管。Michael等利用不同濃度比例的絲素蛋白、膠原蛋白、彈性蛋白及聚己酸內(nèi)酯模擬3層血管結(jié)構(gòu)組成,采用分層套管的方法制造出3層血管假體。體外實驗中證實其機械性能已接近于最常用于血管置換的自體大隱靜脈。國內(nèi)Liu等研制出的雙層人工血管,分別由包含肝素的強化纖維內(nèi)膜及由高孔隙的絲素外層組成,外層納米級電紡纖維絲層具有高孔隙,為平滑肌細胞和成纖維細胞的生長提供了合適環(huán)境,而內(nèi)部層絲纖維增強膜可以持續(xù)釋放肝素,也增強了血管機械性能。體外實驗證明其擁有較理想的機械強度、爆破壓力、順應(yīng)性等。在小口徑人工血管中,單層結(jié)構(gòu)難以在抗血栓性、彈性、機械強度上得到全面滿意的效果,多層結(jié)構(gòu)更能適應(yīng)機體復雜的壓力動態(tài)波動環(huán)境。組織工程血管是指通過提供血管細胞種植的三維機制材料,使特定增殖細胞定位貼附生長,分化形成完整的血管3層結(jié)構(gòu)。因此組織工程血管的研究主要集中在定植細胞的研究、支架即細胞外基質(zhì)替代物的研上。目前常用的支架材料主要有脫細胞基質(zhì)、生物可降解的高分子聚合物與天然蛋白等。體外酶解及生物酶抑制劑的應(yīng)用首先,同非組織工程人工血管相同,該材料必須具有生物相容性,在促進定植細胞增殖生長的同時,不能引起局部或全身炎癥反應(yīng)等;其次,該材料血管支架應(yīng)該具有較高的孔隙率以提供足夠的表面積,來承載更多的定植細胞。同時較高的孔隙率可以增強細胞與支架材料間的交互作用;此外,同其他非組織工程血管不同的是,大多數(shù)組織工程血管應(yīng)用材料需要可完全生物降解吸收,并且降解速率需要控制在一定的范圍內(nèi),過快的降解速率將可導致組織完整性及功能的損失,而太慢的降解速率可能會阻礙組織的正常分化形成。而前文已介紹絲素蛋白擁有良好的生物相容性,體內(nèi)試驗證明無炎性反應(yīng)發(fā)生,表面易化學共價修飾黏附位點和細胞因子以加強定植細胞的生長;可部分生物降解,在體內(nèi)外降解速率可控,降解產(chǎn)物不僅對組織無毒副作用,還對周圍組織有營養(yǎng)與修復作用。Li等使用α-糜蛋白酶、膠原酶ⅠA、蛋白酶ⅩⅩ研究多孔絲素膜的體外酶降解行為發(fā)現(xiàn),不同酶類得到的降解產(chǎn)物稍有不同,半數(shù)以上為游歷氨基酸。Horan等體外酶類實驗表明,絲素蛋白會在一個相對較長的時間內(nèi)緩慢降解。綜上,絲素蛋白是適應(yīng)組織工程血管制作的理想材料,不僅可以促進細胞增殖,擁有良好的組織相容性及較好的機械性能,并可以在一個相對合適的時間內(nèi)緩慢降解,為組織生成提供足夠的時間。人工血管在材料方面經(jīng)歷有多聚合物到生物大分子,然后是組織工程類血管的建立,而最終目的就是建立可以擁有良好組織相容性的人工血管,在結(jié)構(gòu)和功能上盡可能模擬自體血管。隨著近年來材料及制作技術(shù)的發(fā)展,涌現(xiàn)出大量的新技術(shù),新材料等。三維打印是一種快速成形技術(shù),它以數(shù)字化模型為基礎(chǔ),運用粉末狀材料,應(yīng)用黏合劑通過逐層“打印”的方式構(gòu)造物體,擁有高精度、材料多樣性等優(yōu)點。已有德國學者運用化學高分子材料結(jié)合能夠有效抵抗排異反應(yīng)的生物分子制作出了一種特殊的“印刷墨水”,其印制出來的物質(zhì)經(jīng)化學反應(yīng),然后用密集程度極高的激光脈沖能激發(fā)材料中的分子,使其聚集在一個焦點上完成交聯(lián),以這種方式研制出高精度,擁有良好彈性結(jié)構(gòu)的人工血管假體。同時為提高血管假體的生物相容性,他們已嘗試在血管壁進一步進行分子修飾,并開始研制共混肝素等化學物質(zhì)的打印墨水,可以在一開始的血管打印中就整合進各種基團,以增強血管的組織相容性。三維打印在人工血管等生物材料制備中有廣闊前景。誘導多能干細胞是由日本學者Yamanaka小組將Oct3/4,Sox2、c-Myc和Klf4這4種轉(zhuǎn)錄因子導入小鼠成纖維細胞,誘導其轉(zhuǎn)化成的全能性干細胞。雖然由于誘導多能干細胞自身的安全性問題,到目前為止,誘導多能干細胞還無法應(yīng)用于臨床治療,但在生物醫(yī)學領(lǐng)域,對誘導多能干細胞研究的熱潮絲毫未減。誘導多能干細胞在血管方面主要是應(yīng)用其全能性,誘導出血管細胞前體細胞,以分化出完整血管結(jié)構(gòu)。目前,美國學者Samuel等近期已利用人體