10/7/20231第七章克隆基因的表達10/7/20232遺傳信息從DNA到蛋白質(zhì)的傳遞過程——中心法則（centraldogma）。一、基因表達：10/7/20233二、克隆基因的表達：外源基因在宿主細胞中表達。外源基因表達載體重組載體導入宿主細胞在宿主細胞中表達出蛋白質(zhì)提取蛋白宿主細胞：原核細胞或真核細胞。10/7/2023410/7/20235第七章克隆基因的表達第一節(jié)外源基因在原核細胞中的表達第二節(jié)外源基因在真核細胞中的表達10/7/20236第一節(jié)外源基因在原核細胞中的表達一、原核生物基因表達的特點二、原核生物基因表達的調(diào)控三、外源蛋白在大腸桿菌中的表達部位四、幾種類型的原核表達載體五、影響外源基因表達效率的因素10/7/20237六、提高表達水平常用的方法七、細菌表達載體舉例八、外源蛋白質(zhì)表達后的正確修飾九、原核細胞表達的缺陷10/7/20238用原核生物作宿主。AdividingE.coli第一節(jié)外源基因在原核細胞中的表達原核或噬菌體啟動子MCSSD序列終止子10/7/20239識別原核細胞的啟動子，催化所有的RNA合成。數(shù)個相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因與其調(diào)控區(qū)結(jié)合形成一個表達的協(xié)同單位。一、原核生物基因表達的特點2.以操縱子為單位1.只有一種RNA多聚酶10/7/202310有意義鏈5’反意義鏈3’轉(zhuǎn)錄mRNA5’3’翻譯蛋白質(zhì)NC5’3’3.轉(zhuǎn)錄和翻譯偶聯(lián)、連續(xù)進行。10/7/20231110/7/2023124.不含內(nèi)含子，缺乏轉(zhuǎn)錄后的加工系統(tǒng)。5.調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄水平上。含有一個啟始密碼子和一段同核糖體16SRNA3’末端堿基互補的序列，叫Shine-Dalgarno（S-D）序列。6.mRNA的核糖體結(jié)合位點Shine-Dalgarno（S-D）sequence:10/7/202313是DNA上的能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始mRNA合成的序列。大腸桿菌的所有啟動子中都有兩段一致順序（consensussequence）。二、原核生物基因表達的調(diào)控1.啟動子-35Box和-10Box（1）啟動子序列10/7/202314consensussequences10/7/2023155’-TTGACA-3’5’-TATAAT-3’②-10box（PribnowBox）TTGACATATAAT轉(zhuǎn)錄起始位點17bp5’核糖體結(jié)合位點RNA聚合酶σ亞基的識別位點。①-35box10/7/202316（2）翻譯的起始位點1）Shine-Dalgarno（SD）sequence：mRNA上與核糖體16sRNA結(jié)合的序列。SDmRNA5’—AGGAGGU——AUG——16SrRNA3’UCCUCCAS-D序列距離AUG的距離也影響翻譯10/7/202317全酶是一個5聚體，含有兩個α小亞基，和2兩個大亞基（β和β′），一個σ亞基。2.RNA多聚酶大腸桿菌只有一種類型的RNA多聚酶轉(zhuǎn)錄tRNA，rRNA和mRNA。（1）結(jié)構(gòu)10/7/2023183.轉(zhuǎn)錄終止子內(nèi)終止子intrinsicterminator：E.coli中促使轉(zhuǎn)錄終止的DNA位置有一段反向回文順序，其后緊接一串A，稱為內(nèi)終止子，形成終止信號。在表達載體克隆位點的下游一般設(shè)計一段轉(zhuǎn)錄終止子。啟動子操縱子S-D序列目的基因終止子10/7/202319由于莖環(huán)3’段緊接一串A/U的配對，穩(wěn)定性比較差，有利于轉(zhuǎn)錄物脫落而不利于轉(zhuǎn)錄延續(xù)。原因：反向回文順序被轉(zhuǎn)錄后，立即形成一個莖環(huán)結(jié)構(gòu)，使轉(zhuǎn)錄物與模板之間配對的堿基數(shù)降低，整個減弱了RNA與DNA的互補。①莖環(huán)結(jié)構(gòu)②多聚A/U10/7/2023205-CCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTAACTTCTTTCT-33-GGGTGTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAATTGAAGAAAGA-5(模板)轉(zhuǎn)錄↓5-CCCACAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUU-OH-3(RNA)RNA折疊↓mRNA折疊UCCUGG—CA—UC—GC—GG—CC—GC—GG—CAACCCACUUUU—3DNARNA聚合酶脫落10/7/20232110/7/202322大腸桿菌偏愛UAA。一般安置上全部的三個終止密碼防止核糖體跳躍（skipping）。4.翻譯終止密碼5.翻譯增強子Translationenhancer能夠顯著增強外源基因在大腸桿菌細胞中的表達效率的特殊序列。T7噬菌體基因10前導序列（簡稱g10-L序列）;大腸桿菌atpE基因mRNA5’-UTR中富含U的區(qū)段。10/7/202323①必須是一種強啟動子能使外源基因的蛋白產(chǎn)量達到細胞總蛋白的10%-30%以上。②應呈現(xiàn)低水平的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄便于表達毒性蛋白等。③應是可誘導型的用溫度或化學試劑誘導。（1）最佳啟動子必須具備的條件6.基因工程常用的原核啟動子10/7/202324來自大腸桿菌的乳糖操縱子。用乳糖或其類似物IPTG充當誘導物，與阻遏蛋白結(jié)合，解除抑制。PlacO目的基因（2）乳糖啟動子lac10/7/202325阻遏物與操縱基因結(jié)合10/7/202326阻遏物與DNA的結(jié)合10/7/202327（3）色氨酸啟動子trptrpRP1O

trpEtrpDP2trpCtrpBtrpAtrpR阻遏蛋白基因；P1P2啟動子；O操縱基因；

衰減子來自大腸桿菌的色氨酸操縱子。10/7/202328trpRP1O

trpEtrpDP2trpCtrpBtrpA鄰氨基苯甲酸合成酶吲哚甘油硼酸合成酶色氨酸合成酶

鏈

鏈分支酸鄰氨基苯甲酸磷酸核糖基鄰氨基苯甲酸CDRP吲哚甘油-磷酸色氨酸阻遏物轉(zhuǎn)錄（P1是主要啟動子，P2的作用只有3%。）沒有色氨酸時，阻遏蛋白不能與操縱基因結(jié)合，能轉(zhuǎn)錄合成色氨酸所需要的酶。10/7/202329trpRP1O

trpEtrpDP2trpCtrpBtrpA阻遏物色氨酸結(jié)合不轉(zhuǎn)錄用于表達載體的trp啟動子一般只包含啟動基因、操縱基因、和部分trpE基因。P1OtrpE目的基因有色氨酸時，阻遏蛋白與色氨酸結(jié)合后才能與操縱基因結(jié)合，從而阻止色氨酸合成酶類的轉(zhuǎn)錄（稱為corepressor）。10/7/20233010/7/202331三、外源蛋白在大腸桿菌中的表達部位1.細胞質(zhì)中表達2.周質(zhì)中表達3.胞外表達10/7/202332三、外源蛋白在大腸桿菌中的表達部位1.細胞質(zhì)中表達（1）包涵體（inclusionbody）是存在于細胞質(zhì)中的一種不溶性蛋白質(zhì)聚集折疊而成的晶體結(jié)構(gòu)物。10/7/202333在大腸桿菌細胞內(nèi)表達人生長激素（humangrowthhormone,hGH）。例：使重組蛋白易于分離、免受蛋白酶降解、不損害寄主細胞?；厥盏牡鞍咨锘钚圆?。②缺點①優(yōu)點10/7/20233410/7/20233510/7/2023362.周質(zhì)中表達（1）周質(zhì)（periplasm）革蘭氏陰性大腸桿菌位于內(nèi)膜和外膜之間的細胞結(jié)構(gòu)部分。蛋白質(zhì)從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)運到周質(zhì)的復雜機理目前不完全清楚優(yōu)點：容易被濃縮和純化、有利于正確折疊、被降解的少。10/7/202337phoA、OmpA、OmpT、OmpF、LamB、β-內(nèi)酰胺酶（lactamase）、腸毒素（enterotoxin）ST-II、LT-B等常用的原核信號肽①大腸桿菌的信號肽：能帶領(lǐng)蛋白穿過膜到達周質(zhì)。但以后需要正確切割掉。（2）信號肽（signalpeptide）一般位于N端。10/7/202338④胡蘿卜歐氏桿菌的PelB蛋白。②金黃色葡萄球菌的蛋白A。③枯草芽孢桿菌的內(nèi)切葡聚糖酶（endoglucanase）。10/7/202339由于需要穿過兩層膜，大腸桿菌只能分泌極少的蛋白質(zhì)到培養(yǎng)基中，效果都不太理想。用溶血素（hemolysin）基因構(gòu)建分泌性融合蛋白；使在大腸桿菌細胞中表達的外源蛋白分泌到細胞外的培養(yǎng)基中。3.胞外表達或與細菌素釋放蛋白（bacteriocinreleaseprotein)共表達。10/7/20234010/7/202341載體表達出的外源基因蛋白質(zhì)不與細菌的任何蛋白質(zhì)融合在一起。S-D序列AUG-外源基因-TAG優(yōu)點:四、幾種類型的原核表達載體1.非融合型表達載體產(chǎn)物結(jié)構(gòu)接近于真核細胞體內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。缺點：容易被宿主菌的蛋白酶所破壞。10/7/202342哈佛大學的Gilbert實驗室建立的。表達能力強。（1）pKK223-3載體組成結(jié)構(gòu)：①強啟動子:tac（trp-lac）:trp的-35區(qū)lacUV5的-10區(qū)lac操縱基因②操縱基因：乳糖操縱子系統(tǒng)。10/7/202343④終止子：③調(diào)節(jié)基因：LacI宿主菌染色體上的乳糖操縱子系統(tǒng)。如JM105菌。rrnB的強終止子rrnB強終止子S-D插入位點區(qū)⑤S-D序列和插入位點區(qū)：10/7/202344tacPLacOS-D插入位點區(qū)rrnBT宿主lacI⑥載體的其余部分：來自pBR322質(zhì)粒。⑦表達誘導物：IPTG（乳糖的類似物，不會被降解）阻遏物IPTG10/7/202345必須選擇一個有l(wèi)acI（β-半乳糖苷酶的調(diào)節(jié)基因）的宿主菌。條件：10/7/202346載體表達出的外源蛋白質(zhì)與細菌的分泌信號肽連在一起，可被宿主菌分泌到細胞周質(zhì)中。如：pINIII系列：2.分泌型表達載體pINIII-comA1,pINIII-comA2,pINIII-comA3,（1）組成結(jié)構(gòu)10/7/202347IpplacPlacOS-D/AUGompa插入位點Ipp（脂蛋白基因啟動子）和lacUV5啟動子。②調(diào)節(jié)基因：lacI③S-D序列和起始密碼AUG。④分泌信號肽：大腸桿菌外膜蛋白基因ompa。⑤插入位點區(qū)（多克隆位點）。①強啟動子：10/7/202348pINIII-comA1以pBR322為基礎(chǔ)構(gòu)建的。調(diào)節(jié)基因不必借助于宿主的lacI.10/7/202349表達出的外源基因產(chǎn)物蛋白是與質(zhì)粒載體上的菌體蛋白連接在一起的。①啟動子：tac②操縱基因：lacP③調(diào)節(jié)基因：lacI④S-D序列3.融合蛋白表達載體系統(tǒng)----pGEX系列（1）優(yōu)點（2）組成結(jié)構(gòu)便于融合蛋白的分離和純化。10/7/202350lacItaclacOS-D/ATGGST插入位點TGAlacP⑤ori：pBR322ori⑥融合肽：GST(谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶）GST融合蛋白用GlutathioneSepharose（谷胱甘肽瓊脂糖凝膠）親和層析柱分離純化。（3）產(chǎn)物提純10/7/202351（4）產(chǎn)物分離用凝血酶或Xa因子（一種絲氨酸蛋白酶）可以把外源蛋白從GST上切下來。柱（column）GST外源蛋白凝血酶外源蛋白柱（column）GSTGST洗脫柱（column）可再利用10/7/2023525’-TTGACA-3’5’-TATAAT-3’①-35box②-10box（PribnowBox）五、影響外源基因表達效率的因素1.啟動子的結(jié)構(gòu)對表達效率的影響RNA聚合酶σ亞基的識別位點（1）一致順序10/7/202353（2）-35區(qū)與-10區(qū)之間的距離間隔為17bp時，啟動子最強。（3）-35區(qū)和-10區(qū)的堿基順序越接近一致順序，啟動子越強。5’-TTGACATATAAT一致順序lactrp

PLrecAtacItacII5’-TTTACATATGTT5’-TTGACATTAACT5’-TTGACAGATACT5’-TTGATATATAAT5’-TTGACATATAAT5’-TTGACATTTAAT-35box-10box10/7/2023545’-AGGAGGU-3’S-D序列后面的4個堿基：如果是A（T）,翻譯效率最高；如果是G（C）,效率只有50%或25%。2.轉(zhuǎn)譯起始序列對表達效率的影響（1）S-D序列？？？？10/7/202355AUG左側(cè)的三個堿基也有影響。（2）起始密碼AUG

-半乳糖苷酶的mRNA中：AUG左側(cè)如果是UAU或CUU時，最為有效；如果是UUC、UCA或AGG時下降20倍。10/7/2023563.啟動子與外源基因之間的距離10/7/202357轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的存在保證載體不會轉(zhuǎn)錄非必須基因，不必浪費資源量和能量、不會干擾正常的表達。增加載體的拷貝數(shù)會增加轉(zhuǎn)錄出的mRNA數(shù)目。增加表達效率。4.轉(zhuǎn)錄終止區(qū)對表達效率的影響5.載體拷貝數(shù)及穩(wěn)定性對表達效率的影響6.外源蛋白在菌體中的穩(wěn)定性對表達效率的影響但過度的外源基因的表達會影響宿主的正常生長。10/7/202358選擇強啟動子序列，如tac

等六、提高表達水平常用的方法2.調(diào)整S-D序列與AUG的距離距離過長或過短都影響真核基因的表達。根據(jù)不同的啟動子選擇不同的距離。3.改變起始密碼下面的幾組密碼子能提高翻譯的起始效率。10/7/2023594.增加mRNA的拷貝數(shù)和穩(wěn)定性在外源基因的下游插入“重復性基因外回文序列”能防止mRNA受到3’

5’外切酶的攻擊。5.減輕宿主細胞的代謝負荷合理地調(diào)節(jié)代謝負荷與外源基因高效表達的關(guān)系。10/7/202360N末端：由原核基因編碼一段多肽，C末端：是完整的真核外源基因。（1）設(shè)計成融合蛋白這是避免被降解的最好措施。質(zhì)?；虍a(chǎn)物目的基因產(chǎn)物NC切割6.提高表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性防止被宿主的酶降解。10/7/202361①使用次黃嘌呤核苷（lon）缺陷型菌株，減少宿主菌的蛋白酶合成。②大腸桿菌的htpR基因突變也減少蛋白酶的降解作用。③T4噬菌體的pin基因產(chǎn)物能抑制細菌的蛋白酶?？砂裵in增加到載體上。（2）使用突變菌株，保護外源蛋白不被降解減少宿主菌本身的蛋白酶的表達。10/7/202362（3）表達分泌蛋白細胞質(zhì)外膜內(nèi)膜周間質(zhì)質(zhì)粒染色體“外排”：蛋白質(zhì)從細胞質(zhì)跨過內(nèi)外膜到培養(yǎng)液中?！胺置凇保旱鞍踪|(zhì)從細胞質(zhì)跨過內(nèi)膜到周間質(zhì)中。10/7/202363七、細菌表達載體舉例colEorilacIinteinCBDMCST7PromotorAmprM13orirop維持拷貝數(shù)pTYB1，pTYB2，pTYB11，pTYB12幾丁質(zhì)結(jié)合1.pTYB1，pTYB2:intein在C端pTYB系列E.coli表達載體：10/7/202364intein指蛋白質(zhì)的內(nèi)含子。

同mRNA一樣，一些前體蛋白質(zhì)具有內(nèi)含子(intein)序列，位于多肽序列的中間,經(jīng)加工切除后，兩端的蛋白質(zhì)外顯子(extein)連接為成熟蛋白質(zhì)分子。

特點：

①.切割位點保守：

內(nèi)含子前面常為半胱氨酸，后面序列是組氨酸－天門冬酰胺；內(nèi)含子后面外顯子序列的前面常是半胱氨酸、絲氨酸

和蘇氨酸；存在一些保守序列。

②.具有自動切割加工能力：

如果蠅胚胎發(fā)育的內(nèi)含子蛋白質(zhì)(Hedgehog)。

③.蛋白質(zhì)內(nèi)含子片段具有核酸內(nèi)切酶活性：

雜合體中，無內(nèi)含子的DNA序列，經(jīng)內(nèi)含子的切割跳躍而成為純合子。10/7/2023652.pTYB11，pTYB12:intein在N端10/7/202366利用Intein分離純化外源蛋白Intein與Chitin柱結(jié)合DTT或β-巰基乙醇或半胱氨酸能夠誘導Intein的自我裂解活性10/7/20236710/7/202368八、外源蛋白質(zhì)表達后的正確修飾分子內(nèi)二硫鍵、分子間二硫鍵。二硫鍵異構(gòu)酶催化。使蛋白質(zhì)能夠正確折疊。1.形成正確的二硫鍵10/7/202369人胰島素分子10/7/202370抗體分子人血紅蛋白分子10/7/202371如信號肽、內(nèi)含肽（intein）等序列的切割。2.前體切割10/7/202372（1）O-糖基化（Ser,Thr）增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和某些特殊性質(zhì)。3.蛋白質(zhì)糖基化糖基10/7/202373（2）N-糖基化（Asn）Dol：長醇Mannose：甘露糖Glucose：葡萄糖N-AcGlc：N乙酰氨基葡萄糖10/7/202374磷酸化、乙?；⒘蛩峄?、丙烯酸化、羰基化、豆冠酸化、軟脂化4.氨基酸殘基的修飾羥脯氨酸甲基組氨酸羥賴氨酸羧基谷氨酸10/7/202375缺乏蛋白質(zhì)的加工。（如糖基化、氨基酸修飾等）。九、原核細胞表達的缺陷10/7/202376酵母菌、植物原生質(zhì)體、動物培養(yǎng)細胞等。第二節(jié)外源基因在真核細胞中的表達真核或病毒啟動子MCSPolyA信號終止子外源基因10/7/202377①能在E.coli中克隆和擴增。1.酵母克隆載體一、在酵母中表達Leu2+、His+、Ura3+、Trp1+;④有合適的克隆位點。③有酵母的選擇標記Ori②有大腸桿菌的選擇標記Ampr、Tetr。10/7/202378Leu-

酵母原生質(zhì)體感受態(tài)酶去壁CaCl2、PEG整合到染色體上，或獨立在酵母細胞內(nèi)轉(zhuǎn)化Leu營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化子克隆生長酵母載體大腸桿菌提取插入外源基因鑒定克隆發(fā)酵表達外源基因產(chǎn)物分離、純化2.酵母轉(zhuǎn)化和表達的一般過程10/7/202379診斷試劑丙肝病毒蛋白HIV-1抗原種類名稱疫苗乙肝病毒表面抗原瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白HIV-1外殼蛋白3.在啤酒酵母中表達的重組蛋白10/7/202380人類治療用蛋白藥物上皮生長因子胰島素類胰島素生長因子血小板源生長因子胰島素前體成纖維細胞生長因子集落刺激因子

1抗胰蛋白酶凝血因子VIIIa10/7/202381（1）細胞質(zhì)內(nèi)表達例：人Cu/Zn-SOD在酵母中表達：4.在啤酒酵母中表達外源蛋白的方式超氧化物H+H2O2H2O過氧化物酶表達出的SOD修飾正確：起始氨基酸被切掉，第二個氨基酸丙氨酸也被乙酰化。SOD(超氧化物歧化酶)10/7/202382宿主：亮氨酸合成缺陷型酵母。GAPD：甘油醛磷酸脫氫酶10/7/202383（2）表達分泌型蛋白在啤酒酵母中，只有分泌型的蛋白質(zhì)才能被糖基化。需要糖基化的重組蛋白必須是分泌蛋白。方法：構(gòu)建載體在重組蛋白的前面加一段編碼酵母菌交配類型因子a1的前導肽，與重組蛋白的N端通過Lys-Arg相連。前導肽（leaderpeptide）：10/7/202384蛋白質(zhì)分泌到壁膜間隙時，酵母菌的內(nèi)切蛋白酶識別這個切點信號，把重組蛋白正確切下來。信號肽的切割：前導肽Lys-Arg重組蛋白（水蛭素）內(nèi)切蛋白酶10/7/2023855.其它酵母表達系統(tǒng)（1）乙肝表面抗原在嗜甲烷酵母中表達在大型發(fā)酵反應器中容易生長；以甲醇作唯一的碳源和能源，成本低。有甲醇時，表達的乙醇氧化酶高達胞內(nèi)總蛋白的40%?、偈燃淄榻湍福≒ichiapastoris）的特點10/7/202386HBsAg:乙肝表面抗原。可以作為疫苗。Aox1：乙醇氧化酶基因1啟動子（受甲醇激活調(diào)控）。His4：組氨酸合成所需的組氨酸脫氫酶基因。3’-aox1：整合到特定染色體的位點序列。②表達載體構(gòu)建（整合型）：誘導物：甲醇。產(chǎn)量：9×106劑疫苗/240L發(fā)酵液。10/7/202387整合到染色體中10/7/202388（2）牛溶菌酶C2在嗜甲醇酵母中的表達作為飼料添加劑促進反芻動物消化。產(chǎn)量：10L，200h連續(xù)發(fā)酵產(chǎn)出50g溶菌酶。10/7/202389二、昆蟲培養(yǎng)細胞表達系統(tǒng)1.桿狀病毒（Baculovirus）廣泛侵染包括許多昆蟲在內(nèi)的無脊椎動物。（1）侵染周期：兩種形式①單獨病毒粒子形式病毒粒子宿主細胞病毒粒子侵染釋放10/7/202390病毒粒子宿主細胞侵染宿主細胞侵染合成多角體蛋白裂解釋放多面體溶解一般使用苜蓿銀紋夜蛾細胞核型多角體病毒（Autographacaliforniamultiplenuclearpolyhedrosisvirus，AcMNPV）②多面體形式10/7/202391（2）桿狀病毒的表達特點①感染后36-48h，病毒開始合成大量的多角蛋白。②多角蛋白的啟動子特別強。③多角蛋白基因可以被替換掉而不影響病毒的繁殖。10/7/202392多角體基因被外源基因取代后，病毒仍然能形成有感染能力的病毒粒子，但不能形成多面體。3.轉(zhuǎn)化子篩選通過顯微鏡檢查看是否有多面體形成。源自草地夜蛾的細胞株，在這種細胞中，多角蛋白的啟動子特別活躍。2.最普遍應用的宿主細胞株10/7/202393（1）轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建大腸桿菌質(zhì)粒，插入兩段AcMNPV序列以供同源重組。4.桿狀病毒轉(zhuǎn)化載體桿狀病毒的基因組太大（13kb環(huán)狀DNA），不能直接插入。必須使用同源重組的辦法。多角蛋白的啟動子和終止子及polyA加尾信號。啟動子與終止子之間插入多克隆位點10/7/202394轉(zhuǎn)移載體10/7/202395（2）桿狀病毒載體轉(zhuǎn)化過程①轉(zhuǎn)移載體中插入外源基因②轉(zhuǎn)移載體與野生型AcMNPVDNA共同轉(zhuǎn)染宿主細胞③轉(zhuǎn)移載體與病毒基因組發(fā)生雙交換④外源基因被交換轉(zhuǎn)入病毒基因組中⑤重組病毒侵染宿主4-5天后即可收獲重組蛋白。10/7/20239610/7/2023974.目前已經(jīng)用桿狀病毒在真核生物細胞中表達的外源蛋白外源蛋白外源蛋白α干擾素腺苷酸脫氫酶β淀粉酶前體蛋白β干擾素Bluetonguevirus中和抗原紅細胞生成素HIV-1外殼蛋白流感病毒凝集素白細胞介素2Lassavirus蛋白鼠單克隆抗體脊髓灰質(zhì)炎病毒蛋白類狂犬病病毒蛋白狂犬病病毒糖蛋白Simianrotavirus外殼蛋白抗原組織型纖溶酶原激活劑10/7/2023985.桿狀病毒大規(guī)模表達存在的問題桿狀病毒侵染昆蟲幼蟲，在幼蟲體內(nèi)表達外源蛋白，成為“低成本蛋白工廠”。22只粉蚊夜蛾幼蟲4天后表達的人腺苷酸脫氫酶占幼蟲總蛋白的2%-5%。共產(chǎn)出9mg很純的產(chǎn)物。（1）壽命短感染4-5天后宿主細胞裂解或幼蟲死亡。（2）共同轉(zhuǎn)染率低0.1%-1%。10/7/202399三、外源基因在植物中表達根瘤存在于能引起植物形成冠癭瘤的土壤農(nóng)桿菌中，誘導冠癭瘤形成，又稱腫瘤誘導質(zhì)粒（tumorinducingplasmid）。1.Ti質(zhì)粒:10/7/2023100Tiplasmid10/7/2023101環(huán)狀雙鏈DNA，1.5×105-2.0×105bp（185kb）(相當于細菌染色體的3%-5%）。（1）Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)10/7/2023102轉(zhuǎn)移DNA，編碼冠癭堿的合成，能隨機整合到植物的染色體上。長度一般為12-24kb，是Ti質(zhì)粒最重要的部分。左邊界右邊界生長素基因細胞分裂素基因冠癭堿合成基因①T-DNA（transfer-DNA）生長素基因:iaaM（tms1）和iaaH（tms2）編碼合成吲哚乙酸（植物生長激素）的酶iaaM:色氨酸-2-單加氧酶10/7/2023103色氨酸-2-單加氧酶色氨酸吲哚-3-乙酰胺iaaH:吲哚-3-乙酰胺水解酶吲哚-3-乙酰胺水解酶吲哚-3-乙酰胺吲哚乙酸細胞分裂素基因tmr（ipt）：異戊烯轉(zhuǎn)移酶,催化：二磷酸異戊烯（IPP）異戊烯酰嘌呤單磷酸（IPA）5’-AMP10/7/2023104②毒性基因（vir）決定土壤農(nóng)桿菌對植物的感染和T-DNA的轉(zhuǎn)移，進入和整合。vir的產(chǎn)物能誘導Ti質(zhì)粒產(chǎn)生T-DNA區(qū)域的單鏈拷貝。單鏈拷貝從Ti質(zhì)粒脫離后，可與vir的產(chǎn)物VIRD2蛋白結(jié)合，并在VIRD4和VIRB蛋白的幫助下穿過農(nóng)桿菌內(nèi)膜、外膜、壁和植物細胞壁、細胞膜及核膜，最后整合到植物染色體上。10/7/2023105章魚堿代謝基因和胭脂堿代謝基因：④不相容性基因控制Ti質(zhì)粒的不相容性。③冠癭堿代謝基因分別編碼代謝這兩種冠癭堿的酶。維持農(nóng)桿菌生長。10/7/2023106（1）第一步:植物受傷植物受傷后能分泌酚類化合物（如乙酰丁香酮、

羥基乙酰丁香酮），誘導Ti質(zhì)粒上的毒性基因表達。2.農(nóng)桿菌的感染和生存10/7/2023107（2）第二步感染植物（3）第三步毒性基因（vir）表達T-DNA上的產(chǎn)物催化產(chǎn)生過量的生長素和細胞分裂素，形成植物冠癭瘤。農(nóng)桿菌吸附于植物的表面?zhèn)诓课唬ǔＴ谇o的基部）。virA、virG、virD、virB（4）第四步T-DNA轉(zhuǎn)移T-DNA被vir基因產(chǎn)物切下來，并運送到植物細胞核里，整合到植物基因組中。（5）第五步誘導冠癭瘤10/7/202310810/7/2023109（6）第六步土壤農(nóng)桿菌代謝冠癭堿。10/7/2023110裸子植物、雙子葉被子植物、禾谷類單子