鐵皮石斛組織培養(yǎng)研究進(jìn)展

剝皮科又稱石斛科多年生附生草本植物，又名剝皮科蘭科，為黑色雜生草本植物。莖的節(jié)很黑，所以它是一個(gè)黑節(jié)草。鐵皮石斛是我國傳統(tǒng)的名貴中草藥,其化學(xué)成分為石斛多糖(高達(dá)21.7%)及石斛堿?！吨袊幍洹肥珍?種石斛原植物,鐵皮石斛是之中最珍貴品種,具有滋陰清熱、養(yǎng)胃生津、潤肺止咳等功效,其所含的多糖成分具有增強(qiáng)人體免疫功能、防癌抗癌、恢復(fù)嗓音等功效。由于鐵皮石斛對(duì)生長環(huán)境的要求較高,且受到自身繁殖方式的限制及近年來過度采挖野生藥材和整體生態(tài)環(huán)境的不斷破壞,野生鐵皮石斛資源已接近枯竭。鑒于此,利用組織培養(yǎng)進(jìn)行大量繁殖生產(chǎn),既能發(fā)揮其藥用價(jià)值,又能使這一瀕危植物得到保護(hù)和發(fā)展[4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21]。本文綜述了近年來鐵皮石斛組織培養(yǎng)的研究進(jìn)展,以供參考。1自然生長條件和繁殖1.1石料苔蘚植物群落鐵皮石斛生于海拔2100-2500m的林中樹上或林緣巖石上,或在河溝、溝溪山谷旁峭壁上,并常與石葦?shù)忍μ\植物附生在一起,在我國主要分布于廣西、云南、貴州等地,喜陰涼、濕潤、通風(fēng)多霧的小氣候。石斛在14℃時(shí)開始生長,20-26℃且空氣濕度>80%最適宜;在30℃且相對(duì)濕度<50%的情況下,葉脈變黃,葉片下垂,莖現(xiàn)皺縮,如崖縫滲水過多則易爛根致亡。石斛喜光又怕強(qiáng)陽光直射,忌干燥與高溫。1.2發(fā)酵溫度對(duì)鐵皮石斛的影響鐵皮石斛的有性繁殖極為困難,主要原因包括:(1)其種子極為細(xì)小,胚胎發(fā)育不完全,無胚乳組織,在自然狀態(tài)下發(fā)芽率極低。(2)苛刻的生長環(huán)境,也限制了其有性繁殖。何平榮等研究表明,鐵皮石斛平均自然結(jié)實(shí)率為0.31%。鐵皮石斛主要靠根部無性分蘗繁殖而不斷生出新的植株并成叢生長,有時(shí)也從上部莖節(jié)處生根長出新植株。2組織培訓(xùn)2.1培養(yǎng)基生長情況對(duì)鐵皮石斛種子無菌萌發(fā)及發(fā)芽率的研究表明,鐵皮石斛種子可在1/2MS、改良KC、改良N6、N6、VW培養(yǎng)基上生長,且最高萌發(fā)率可達(dá)100%,最低萌發(fā)率為6%。多數(shù)研究表明其萌發(fā)率較好[5,6,7,8,9,10,11,12]。2.2外植體誘導(dǎo)器官的出現(xiàn)研究表明,用鐵皮石斛的莖段能很好地誘導(dǎo)器官發(fā)生,也可用根尖、莖尖、不定芽、蒴果、幼葉、根蔸誘導(dǎo)器官發(fā)生。2.3誘導(dǎo)供養(yǎng)及培養(yǎng)原球莖袁正仿等將鐵皮石斛帶莖節(jié)的莖段接種于培養(yǎng)基上(N6+2.5mg·L-1BA)誘導(dǎo)莖節(jié)發(fā)芽,再將芽接種于培養(yǎng)基上(N6+2.5mg·L-1BA+0.5mg·L-1IBA)誘導(dǎo)出原球莖,并指出只有將誘導(dǎo)出的小植株再誘導(dǎo),誘導(dǎo)出大量的原球莖,才能擴(kuò)大其繁殖。秦廷豪用鐵皮石斛莖段、帶頂芽的莖段和根蔸3類外植體在培養(yǎng)基上(MS+0.5mg·L-16-BA+0.2mg·L-1NAA)培養(yǎng),僅根蔸能誘導(dǎo)出原球莖。王春等研究表明,鐵皮石斛原球莖誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為1/2MS+1.0mg·L-1BA+0.5mg·L-1NAA,誘導(dǎo)率為58%。王麗萍等研究表明,選用鐵皮石斛幼嫩莖段為外植體誘導(dǎo)出原球莖的最佳培養(yǎng)基為MS+0.5mg·L-16-BA+0.5mg·L-1NAA+1.0mg·L-12,4-D。鄭寬瑜等以鐵皮石斛種子為外植體誘導(dǎo)出原球莖。蘇鈦等研究表明,BA相對(duì)于其他激素對(duì)鐵皮石斛原球莖誘導(dǎo)效果最好,以2.0mg·L-1BA誘導(dǎo)率最高。2.4最佳培養(yǎng)基的確定周俊輝等研究表明,以1.0mg·L-1NAA誘導(dǎo)鐵皮石斛生根效果最明顯。袁正仿等將鐵皮石斛原球莖接種在分化培養(yǎng)基上(N6+1.5mg·L-1BA+1.2mg·L-1NAA+5%香蕉汁)誘導(dǎo)原球莖分化,結(jié)果表明,添加一定濃度的土豆汁、香蕉汁有利于原球莖分化,且添加濃度直接影響分化率和分化時(shí)間;用N6+2.5mg·L-1NAA+10%香蕉汁培養(yǎng)基使苗快速長高,把長高的苗轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基上(N6+2.5mg·L-1NAA+10%土豆汁),使莖變得粗壯。徐雪榮等研究表明,鐵皮石斛原球莖最佳分化培養(yǎng)基是MS+0.3mg·L-16-BA+3.0%白糖,分化率為74%;分化出的叢芽接種在生根培養(yǎng)基中(MS+0.05%AC+3.0%白糖),28d生根率達(dá)到87%。朱艷等研究表明,鐵皮石斛叢生芽在培養(yǎng)基上(1/2MS+10%香蕉汁+0.5%AC)生根效果最好。林叢發(fā)等研究表明,最適于鐵皮石斛原球莖分化的培養(yǎng)基是1/2MS+0.5mg·L-1NAA+20%馬鈴薯汁+20g·L-1蔗糖+0.8g·L-1瓊脂。王春等研究表明,鐵皮石斛不定芽最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.5mg·L-1NAA,生根率為100%,平均生根數(shù)為7.1條。2.5鐵皮石斛原球莖鮮重與干重增長的變化韓曉紅等研究表明,液體懸浮培養(yǎng)能顯著提高原球莖的增殖率。魏小勇在建立的鐵皮石斛原球莖增殖的懸浮培養(yǎng)體系中,發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛原球莖鮮重與干重增長都最快。宋經(jīng)元等研究表明,鐵皮石斛原球莖鮮重與干重在液體培養(yǎng)基上均極顯著高于固體培養(yǎng)基。褐變是液體懸浮培養(yǎng)中的限制因素,在懸浮培養(yǎng)時(shí)加入較高濃度的抗氧化劑Vc可以防止原球莖出現(xiàn)褐變。2.6u3000脂石斛在花芽誘導(dǎo)中的應(yīng)用王光遠(yuǎn)等報(bào)道了鐵皮石斛試管開花,李璐進(jìn)一步比較了6-BA和TDZ對(duì)鐵皮石斛試管花芽誘導(dǎo)的影響,并指出使用TDZ誘導(dǎo)試管苗花芽更容易得到正常的花芽,誘導(dǎo)其試管開花最優(yōu)培養(yǎng)基為:1/2MS+0.2mg·L-1TDZ+100mg·L-1CW+20g·L-1白糖。2.7影響鑄鐵板巖組織培養(yǎng)的因素2.7.1培養(yǎng)基對(duì)鐵皮石斛壯苗生根的影響目前,鐵皮石斛組織培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基根據(jù)不同生長階段而異。1/2MS、MS和KC等培養(yǎng)基都適合原球莖增殖;劉驊等研究了1/2MS、B5、VW、KC培養(yǎng)基對(duì)鐵皮石斛壯苗生根的影響,結(jié)果表明,B5和1/2MS較適宜鐵皮石斛的壯苗培養(yǎng);李璐等研究表明,1/2MS培養(yǎng)基適宜鐵皮石斛壯苗生根培養(yǎng),而且是誘導(dǎo)鐵皮石斛試管開花的最優(yōu)培養(yǎng)基。2.7.2鐵皮石斛原球莖的增殖目前,鐵皮石斛組織培養(yǎng)中常使用的外源激素主要是生長素類(如IAA、IBA、NAA等)和細(xì)胞分裂素類(如BA、ZT和KT)。不同生長發(fā)育階段所需激素的量和種類都不盡相同。唐桂香等研究表明,1.0mg·L-1BA和0.1mg·L-1NAA有利于鐵皮石斛原球莖增殖;蔣波等研究表明,2.0mg·L-1BA+0.5mg·L-1NAA或3.0mg·L-16-BA+0.5mg·L-1NAA適宜鐵皮石斛原球莖增殖。莫昭展等研究表明,在改良MS中加入0.5mg·L-1ABA,原球莖增殖的效果比較好。劉驊等研究表明,2.0mg·L-1NAA對(duì)鐵皮石斛的壯苗生根較好;唐桂香等研究表明,0.5mg·L-1NAA對(duì)鐵皮石斛的生根效果最好。李璐比較了6-BA和TDZ對(duì)鐵皮石斛花芽誘導(dǎo)的影響,結(jié)果表明,0.2mg·L-1TDZ最適宜誘導(dǎo)其開花。2.7.3椰子汁、蘋果汁對(duì)鐵皮石斛原球莖的增殖椰子汁、香蕉泥、蘋果汁、馬鈴薯汁等添加物對(duì)鐵皮石斛組織培養(yǎng)過程中有重要影響。椰子汁、蘋果汁對(duì)鐵皮石斛原球莖增殖有較好的效果,劉煒?gòu)O等研究表明,添加50g·L-1香蕉泥可使增殖的原球莖大而健壯,顏色濃綠,分化程度較低,且緊密程度較好。香蕉泥、蘋果汁、馬鈴薯汁、椰子乳也都能促進(jìn)鐵皮石斛的壯苗生根。2.7.4對(duì)原球莖的生長蔗糖作為培養(yǎng)基的能源物質(zhì)和滲透調(diào)節(jié)劑,對(duì)原球莖的生長影響較大,馮瑩等研究表明,白糖對(duì)原球莖的培養(yǎng)效果優(yōu)于蔗糖,以20g·L-1白糖效果最好。2.7.5ph值pH值影響細(xì)胞的透性、代謝和培養(yǎng)物的生長與分化。陳青青等研究表明,pH值對(duì)鐵皮石斛的苗鮮重和生根率有顯著影響,以pH5.4為宜。2.7.6x時(shí)鐵皮石斛的生長陳青青等研究表明,溫度和光照對(duì)鐵皮石斛的生長影響顯著,在25℃、光照強(qiáng)度為1500lx時(shí),最適宜鐵皮石斛生長。鮑順淑等研究了不同光照時(shí)間對(duì)鐵皮石斛組培苗生長發(fā)育的影響,指出光照時(shí)間為12h·d-1時(shí),組培苗的凈光合速率和葉綠素含量較高,干重和腋芽數(shù)增加較多,表現(xiàn)出良好的生長與繁殖能力,因此,鐵皮石斛組培苗的適宜光照周期為12h·d-1。3時(shí)間和穩(wěn)定性研究目前,鐵皮石斛在組織培養(yǎng)方面已經(jīng)取得很大的進(jìn)展,并已應(yīng)用于生產(chǎn),這對(duì)瀕臨滅絕的野生鐵皮石斛資源有緩解作用。當(dāng)前鐵皮石斛價(jià)格昂貴,供不應(yīng)求。如何縮短其生長周期,且提高藥用成分含量是解決鐵皮石斛大規(guī)模生產(chǎn)的關(guān)鍵