大蒜素和枸杞多糖對(duì)草魚血清酶活性的影響

大蒜是大蒜的主要生物活性成分，包括各種丙烯基有機(jī)物質(zhì)。研究表明,大蒜素有多種生物學(xué)功能,具有抗菌、降低膽固醇、抗血小板聚集、護(hù)肝、預(yù)防心血管疾病和降低血壓等生理學(xué)作用;枸杞多糖(1yciumbarbarumpo1ysaccharidesLBP)是枸杞子中主要免疫活性成分,具有調(diào)節(jié)免疫、清除自由基、抑制腫瘤、延緩衰老、降血脂、降血糖和抗疲勞等作用。目前,國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)大蒜素和枸杞多糖在水產(chǎn)動(dòng)物上的應(yīng)用已有報(bào)道。王常安等研究了大蒜素對(duì)哲羅鮭血液非特異免疫因子的影響;王遠(yuǎn)吉就枸杞多糖對(duì)鯽魚血清溶菌酶活性的影響進(jìn)行了研究和報(bào)道。而關(guān)于大蒜素和枸杞多糖以飼料添加劑形式用于草魚抗病性的研究報(bào)道甚少。魚類的非特異免疫抵抗,包括溶菌酶、堿性磷酸酶、超氧化物歧化酶、丙二醛、補(bǔ)體C3等非特異免疫體液因子及巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞的吞噬等,對(duì)于魚類抵抗病原的侵襲和感染具有重要的作用。本研究通過在草魚飼料中分別添加上述兩種添加劑,經(jīng)過一段時(shí)間飼喂后,測(cè)定其血清溶菌酶、堿性磷酸酶、超氧化物歧化酶、丙二醛、補(bǔ)體C3和白細(xì)胞吞噬率六個(gè)免疫指標(biāo),評(píng)價(jià)兩種添加劑對(duì)草魚非特異性免疫功能的影響,以期為草魚抗病性添加劑的開發(fā)和應(yīng)用提供參考資料。1材料和方法1.1組a0b3在基礎(chǔ)飼料(表1)中分別添加不同濃度的大蒜素0.4%(A1組)、0.8%(A2組),枸杞多糖0.066%(A3組)、0.132%(A4組)兩種添加劑(表2),未添加組(基礎(chǔ)飼料組)為對(duì)照組(A0組)。共4個(gè)試驗(yàn)組,一個(gè)對(duì)照組,每組設(shè)兩個(gè)平行。飼料配制時(shí),所添加的免疫增強(qiáng)劑以等量減少麥麩用量保持配方平衡。1.2試驗(yàn)分組與投喂試驗(yàn)草魚購(gòu)自遼寧省遼陽市佟二堡東荒農(nóng)場(chǎng),體重(108±5)g,暫養(yǎng)15d,期間投喂基礎(chǔ)飼料。將健康的草魚隨機(jī)分為5組,即一個(gè)對(duì)照組(A0)和A1、A2、A3、A4共5個(gè)試驗(yàn)組,每組設(shè)兩個(gè)平行。將試驗(yàn)魚飼養(yǎng)在1.0m×0.5m×1.0m的網(wǎng)箱內(nèi),每箱25尾,分別投喂相應(yīng)飼料,日夜充氧。每天投喂3次(8:00-9:00、13:00-14:00、18:00-19:00),投餌量為魚體重的4%,每7d調(diào)整一次投餌量,每天排污一次。試驗(yàn)從2010年7月下旬至9月上旬,共42d,試驗(yàn)期間水溫(25±2)℃,pH(7.0±0.2),DO≥5mg/L,NH3-N<0.3mg/L。每天觀察并記錄試驗(yàn)魚的攝食及活動(dòng)情況。1.3指標(biāo)和方法的測(cè)量1.3.1血清中c7活性的測(cè)定在試驗(yàn)的14d,28d,35d,42d,從各組中隨機(jī)抽取3條魚,尾靜脈抽血,于4℃條件下3000r/min離心10min,收集上部血清,在4℃冰箱中保存,供溶菌酶、堿性磷酸酶、丙二醛、超氧化物歧化酶活性和補(bǔ)體C3活性的測(cè)定用。1.3.2抗氧化酶活性測(cè)定溶菌酶活性測(cè)定采用比濁法;堿性磷酸酶活性測(cè)定采用對(duì)硝基苯磷酸鹽法;丙二醛采用硫代巴比妥酸法(TBA);超氧化物歧化酶活性測(cè)定采用黃嘌呤氧化酶法;補(bǔ)體C3采用免疫比色法;上述5種指標(biāo)測(cè)定均使用南京建成生物技術(shù)研究所的試劑盒。1.3.3感染活性的測(cè)定于試驗(yàn)的35d,從各箱中隨機(jī)抽取一條草魚,采血管和注射器先用1%肝素抗凝劑潤(rùn)洗一下,于尾靜脈采血0.5mL,加入新制備的過夜培養(yǎng)的嗜水氣單胞菌懸液(由黑龍江水產(chǎn)研究所惠贈(zèng))0.2mL,菌液濃度為1×108cfu/mL.混勻,37℃水浴孵育30min,并于孵育過程前20min,每隔5min輕輕振蕩一次,共4次,后10min靜置。孵育結(jié)束后用毛細(xì)管從紅細(xì)胞層表面吸取上清少許推片。自然干燥后滴加甲醇固定3min,蒸餾水沖洗,瑞士染液染色1min,蒸餾水沖洗,晾干,油鏡鏡檢。以吞噬百分比計(jì)算吞噬活性。吞噬百分比=(100個(gè)吞噬細(xì)胞中參與吞噬的細(xì)胞數(shù)/100)×100%。1.4數(shù)據(jù)分析和處理試驗(yàn)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,采用SPSS13.0在a=0.05水平下進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)經(jīng)方差分析后進(jìn)行組間兩兩(LSD)比較。2結(jié)果與分析2.1不同枸杞多糖添加量對(duì)導(dǎo)致保肝作用的影響由表1數(shù)據(jù)可知,添加大蒜素的草魚血清溶菌酶活性除第14d外,均隨著添加大蒜素量的增加而升高,但沒有顯著差異(P>0.05)。添加枸杞多糖的草魚血清溶菌酶活性均隨著添加枸杞多糖量的增加而升高,第28d時(shí),A4組的草魚血清溶菌酶活性顯著升高(P<0.05)。與對(duì)照組比較,A1、A2、A3和A4組的草魚血清溶菌酶活性在第28d時(shí)均有所升高。其中,A1、A2和A4組的草魚血清溶菌酶活性均在28d時(shí)顯著升高(P<0.05),并達(dá)到最大值,分別達(dá)到0.033±0.008、0.045±0.006、0.044±0.011。2.2小鼠血清中抗菌藥活性的比較由表2數(shù)據(jù)可知,添加大蒜素的草魚血清堿性磷酸酶活性均隨著添加大蒜素量的增加而降低,但沒有顯著差異(P>0.05)。添加枸杞多糖的草魚血清堿性磷酸酶活性均隨著添加枸杞多糖量的增加而升高,但沒有顯著差異(P>0.05)。與對(duì)照組比較,A1、A2、A3、A4組的草魚血清堿性磷酸酶活性均有所升高,A1組的草魚血清堿性磷酸酶活性在第28d、35d時(shí)顯著升高(P<0.05)。其中,A1和A2組的草魚血清堿性磷酸酶活性分別在35d、28d時(shí)達(dá)到最大值,分別達(dá)到81.487±24.553、66.961±38.997;A3和A4組的草魚血清堿性磷酸酶活性在35d時(shí)達(dá)到最大值,分別達(dá)到58.40±22.994、64.923±18.959。2.3不同處理對(duì)枸杞多糖量的影響由表3數(shù)據(jù)可知,添加大蒜素的草魚血清超氧化物岐化酶活性均隨著添加大蒜素量的增加而升高,但沒有顯著差異(P>0.05)。添加枸杞多糖的草魚血清超氧化物岐化酶活性均隨著添加枸杞多糖量的增加而升高,但沒有顯著差異(P>0.05)。與對(duì)照組比較,除第14d、42d外,A1、A2、A3、A4組的草魚血清超氧化物岐化酶活性均有所升高;A3、A4組的草魚血清超氧化物岐化酶活性在第35d時(shí)顯著升高(P<0.05)。其中,A1和A2組的草魚血清超氧化物岐化酶活性在28d時(shí)達(dá)到最大值,分別達(dá)到100.351±4.283、109.901±7.152;A3和A4組的草魚血清超氧化物岐化酶活性在35d時(shí)達(dá)到最大值,分別達(dá)到115.663±4.142、117.761±7.294。2.4不同處理對(duì)咸魚血清二醛活性的影響由表4數(shù)據(jù)可知,添加大蒜素的草魚血清丙二醛含量均隨著添加大蒜素量的增加而升高,但沒有顯著差異(P>0.05)。添加枸杞多糖的草魚血清丙二醛含量隨著添加枸杞多糖量的增加而升高,但沒有顯著差異(P>0.05)。與對(duì)照組比較,A1、A2、A3、A4組的草魚血清丙二醛活性均有所降低,但沒有顯著差異(P>0.05);其中,A1和A2組的草魚血清丙二醛含量在28d時(shí)達(dá)到最小值,分別達(dá)到9.552±0.853、8.000±1.523;A3和A4組的草魚血清丙二醛含量在35d時(shí)達(dá)到最小值,分別達(dá)到6.202±0.667、6.873±0.974。2.5不同濃度枸杞多糖對(duì)金槍魚血清補(bǔ)體c3活性的影響由表5數(shù)據(jù)可知,添加大蒜素的草魚血清補(bǔ)體C3活性均隨著添加大蒜素量的增加而降低,35d時(shí),A2組的草魚血清補(bǔ)體C3活性顯著降低(P<0.05)。添加枸杞多糖的草魚血清補(bǔ)體C3活性均隨著添加枸杞多糖量的增加而升高,但沒有顯著差異(P>0.05)。與對(duì)照組比較,A1、A2、A3、A4組的草魚血清補(bǔ)體C3活性均有所升高;A1組的草魚血清補(bǔ)體C3活性在第35d時(shí)顯著升高(P<0.05)。A3組的草魚血清補(bǔ)體C3活性在第28d時(shí)顯著升高(P<0.05)。A4組的草魚血清補(bǔ)體C3活性在第28d、35d時(shí)顯著升高(P<0.05)。其中,A1、A2、A3、A4組的草魚血清補(bǔ)體C3活性在35d時(shí)達(dá)到最大值,分別達(dá)到0.7102±0.234、0.4385±0.238、0.5627±0.037、0.7185±0.0957。2.6大蒜素對(duì)金槍魚血液管質(zhì)中正反應(yīng)的活性的影響35d持續(xù)投喂不同劑量添加劑對(duì)草魚血液白細(xì)胞吞噬活性影響的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖1。由圖1可知,與對(duì)照組相比,A1、A2、A3、A4組草魚血液白細(xì)胞吞噬活性均有所升高;A1、A2組草魚血液白細(xì)胞吞噬率顯著提高(P<0.05),A1組草魚血液白細(xì)胞吞噬率活性最高,達(dá)到34.68±6.63。添加大蒜素的草魚血液白細(xì)胞吞噬活性均隨著添加大蒜素量的增加而降低,但沒有顯著差異(P>0.05);添加枸杞多糖(LBP)的草魚血液白細(xì)胞吞噬活性均隨著添加枸杞多糖(LBP)量的增加而升高,但沒有顯著差異(P>0.05)。3其他常見水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)近幾年來,大蒜素、枸杞多糖作為餌料添加劑,具有天然的抗菌物質(zhì),有著和抗生素相似的作用效果,且無抗生素的藥物殘留等副作用,因而廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中。如高紅梅,王明學(xué)闡述了大蒜素在水產(chǎn)健康養(yǎng)殖中的應(yīng)用;蔡春芳等在銀鯽飼料中添加0.5%大蒜素時(shí),表現(xiàn)出顯著的免疫增強(qiáng)作用;王遠(yuǎn)吉在鯽魚飼料中添加45mg/kg的枸杞多糖時(shí),鯽魚血清的溶菌酶活力效果最好。而本實(shí)驗(yàn)以草魚血清溶菌酶、堿性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶、丙二醛、補(bǔ)體C3和白細(xì)胞吞噬率為指標(biāo)來評(píng)價(jià)大蒜素、枸杞多糖對(duì)草魚非特異性免疫的影響。3.1不同劑量大蒜素、枸杞多糖對(duì)咸魚血清溶菌酶活性的影響溶菌酶是評(píng)價(jià)非特異性免疫的重要指標(biāo),廣泛存在于魚類體表黏液、鰓、血清、腸胃分泌液及吞噬細(xì)胞的溶酶體顆粒中。溶菌酶能水解細(xì)胞壁中的黏肽的乙酰氨基多糖并使之裂解被釋放出來,從而破壞和消除侵入體內(nèi)的異物,實(shí)現(xiàn)機(jī)體防御的功能。曹丹等在暗紋東方純的飼料中添加100mg/kg的大蒜素,極顯著地提高暗紋東方純脾臟中溶菌酶的活力。王遠(yuǎn)吉在鯽魚飼料中添加45mg/kg的枸杞多糖時(shí),鯽魚血清的溶菌酶活力效果最好。本實(shí)驗(yàn)中,在第28d、35d、42d,不同添加劑試驗(yàn)組草魚血清溶菌酶活性均隨劑量的增大而升高;這表明不同劑量的大蒜素、枸杞多糖在飼喂相同天數(shù)后對(duì)草魚血清溶菌酶活性的影響不同,飼喂高劑量大蒜素、枸杞多糖的草魚血清溶菌酶活性活力好于低劑量大蒜素、枸杞多糖的草魚血清溶菌酶活性。與對(duì)照組比較,各試驗(yàn)組的草魚血清溶菌酶活性在第28d時(shí)均有所升高;其中,A1、A2和A4組的草魚血清溶菌酶活性在第28d時(shí)顯著升高(P<0.05),并達(dá)到峰值?？梢?不同劑量的大蒜素、枸杞多糖在經(jīng)過一段時(shí)間飼喂后能提高草魚血清溶菌酶活性,并在一定時(shí)間范圍內(nèi)達(dá)到酶活力最高峰,增強(qiáng)草魚的非特異性免疫力,從而提高草魚的抗病力。這可能與大蒜、枸杞多糖可激活單核細(xì)胞的分泌水平,活化巨噬細(xì)胞,提高免疫酶活性、改變血液細(xì)胞因子含量有關(guān)。3.2對(duì)魚類血清堿性磷酸酶活力的影響堿性磷酸酶是生物體內(nèi)的一種重要的代謝調(diào)控酶,直接參與磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移和鈣磷代謝,也能通過改變病原體的表面結(jié)構(gòu)而增強(qiáng)被侵襲機(jī)體對(duì)病原體的識(shí)別和吞噬能力,有助于魚體抗病力的高。李嬋等在虹鱒飼料中添加15mg/kg的大蒜素,顯著提高了腎臟中堿性磷酸酶的活力。黃培池,王娟研究表明連續(xù)灌胃200mg/kg枸杞多糖可顯著提高小鼠的血清堿性磷酸酶活力;而枸杞多糖添加在魚類飼料中,其魚類血清堿性磷酸酶活力高低尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)期間,A2組的草魚血清堿性磷酸酶活力均小于A1組草魚血清堿性磷酸酶活力,A4組的草魚血清堿性磷酸酶活力均大于A3組草魚血清堿性磷酸酶活力。這表明不同劑量的大蒜、枸杞多糖在飼喂相同天數(shù)后對(duì)草魚血清堿性磷酸酶活性的影響不同,過高劑量大蒜素可能會(huì)抑制草魚血清堿性磷酸酶活性。其中,大蒜素低劑量組、枸杞多糖高劑量組草魚血清堿性磷酸酶活力好于大蒜素高劑量組、枸杞多糖低劑量組草魚血清堿性磷酸酶活性。與對(duì)照組比較,不同添加劑劑量組的草魚血清堿性磷酸酶活性在試驗(yàn)期均有所升高;其中,A2組的草魚血清堿性磷酸酶活性在28d時(shí)達(dá)到最大值;A1、A3和A4組的草魚血清堿性磷酸酶活性在35d時(shí)達(dá)到最大值?？梢?各試驗(yàn)組在試驗(yàn)期間均能提高草魚血清堿性磷酸酶活性,并在一定時(shí)間范圍內(nèi)達(dá)到酶活力最高峰,從而增強(qiáng)草魚的非特異性免疫力,提高草魚的抗病力。這可能與大蒜素、枸杞多糖能激活單核細(xì)胞的分泌水平、活化巨噬細(xì)胞,提高免疫活性酶的含量,刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)有關(guān)。3.3不同劑量復(fù)合飲料對(duì)金槍魚血清超氧化物歧化酶活力和丙二醛含量的影響超氧化物歧化酶是機(jī)體清除氧自由基的重要抗氧化物酶。在正常情況下,體內(nèi)抗氧化酶可以清除氧化代謝產(chǎn)物,而當(dāng)其氧化能力下降時(shí),過量的氧自由基與不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)化氧化,會(huì)損傷細(xì)胞膜及細(xì)胞內(nèi)的大分子蛋白和核酸,對(duì)動(dòng)物造成損傷。因此,抗氧化酶系統(tǒng)在維持機(jī)體正常代謝和功能上起著十分重要作用。丙二醛是細(xì)胞氧化代謝產(chǎn)物,其含量高低,反應(yīng)了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的程度。李嬋等在虹鱒飼料中添加15mg/kg的大蒜素,顯著提高了肝臟、腎臟中超氧化物歧化酶的活力,降低了丙二醛含量;梁杰等灌胃試驗(yàn)小鼠劑量為20mg/(kg·d)枸杞多糖,與衰老組比較,超氧化物歧化酶活力極顯著增加(P<0.01),丙二醛含量極顯著降低(P<0.01)。而枸杞多糖添加在魚類飼料中,其魚類血清超氧化物歧化酶活力與丙二醛含量高低尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)期間,不同劑量添加劑試驗(yàn)組均隨添加劑量的升高,草魚血清超氧化物歧化酶活力與丙二醛含量也隨之升高;這表明不同劑量的大蒜素、枸杞多糖在飼喂相同天數(shù)后對(duì)草魚血清超氧化物歧化酶活力與丙二醛含量影響不同。與對(duì)照組比較,除第14d、42d外,A1、A2、A3、A4組的草魚血清超氧化物岐化酶活性均有所升高;A1和A2組的草魚血清超氧化物岐化酶活性在28d時(shí)達(dá)到最大值;A3、A4組的草魚血清超氧化物岐化酶(SOD)活性在第35d時(shí)顯著升高(P<0.05),并達(dá)最大值。而A1、A2、A3、A4組的草魚血清丙二醛含量在試驗(yàn)期間均有所降低;其中,A1和A2組的草魚血清丙二醛含量在28d時(shí)達(dá)到最小值;A3和A4組的草魚血清丙二醛含量在35d時(shí)達(dá)到最小值。之所以表現(xiàn)上述規(guī)律,可能由于大蒜素、枸杞多糖(LBP)具有一定抗氧化能力,使機(jī)體處于某種良好的生理狀態(tài),維持機(jī)體旺盛的新陳代謝,從而促進(jìn)超氧化物岐化酶的生物合成,抑制了脂質(zhì)成分的過氧化程度,從而使得草魚血清的丙二醛濃度降低。3.4多次注射-葡聚糖對(duì)大鼠血清補(bǔ)體c3活力的影響補(bǔ)體是機(jī)體抵抗微生物感染的重要成分,由存在于體液的多種具有酶活性的球蛋白組成,可以通過經(jīng)典途徑和旁路途徑激活,在魚類早期抗感染過程中發(fā)揮著重要作用。血清中C3是補(bǔ)體系統(tǒng)中主要成分,目前尚無大蒜素、枸杞多糖對(duì)魚類血清補(bǔ)體活性影響的報(bào)道。張志勉等研究表明,服用大蒜素后,人體紅細(xì)胞C3b受體花環(huán)率顯著高于對(duì)照(P<0.05),淋巴細(xì)胞免疫功能接近或高于對(duì)照組。Misra等通過多次注射β-葡聚糖可顯著提高羅非魚血清補(bǔ)體C3的含量。本試驗(yàn)期間,A2組的草魚血清補(bǔ)體C3活