三葉青提取物抗炎鎮(zhèn)痛及熱板法的研究

三葉青是葡萄科植物的黃葉崖藤（gilg）干燥的分段根，分布在我國浙江、江西、福建、臺灣、湖北、廣東、四川、貴州、云南等省區(qū)。具有清熱解毒、散粘液、循環(huán)止痛的功效，臨床治療高燒、腹痛、肺炎、哮喘、肝炎等疾病，但未發(fā)現(xiàn)現(xiàn)代藥理治療。本實驗對三葉青提取物在抗炎、鎮(zhèn)痛及解熱等方面進行了藥理學(xué)實驗研究,為其臨床應(yīng)用提供了實驗依據(jù)。材料和方法1材料表面1.1制備含生藥產(chǎn)品三葉青干品,購于浙江省中醫(yī)院中藥房,經(jīng)浙江中醫(yī)學(xué)院資源鑒定教研室鑒定。三葉青提取物(ExtractofRadixTetrastigmae,ERT)的制備:將1000g藥材常規(guī)加工粉碎后過20目篩,用水回流提取2次,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至相當于含生藥0.16g·mL-1,置冰箱備用。伊文思蘭(進口分裝,國藥集團化學(xué)試劑有限公司,批號F20040213);二甲苯(分析純,江蘇三木集團化工廠產(chǎn)品,批號20000410);醋酸(分析純,浙江杭州化學(xué)試劑有限公司,批號20040607);阿司匹林腸溶片(南京白敬宇制藥有限責任公司,批號:040622);羅通定片(廣東省博羅先峰藥業(yè)集團有限公司,批號:030601);干酵母(浙江省富陽市杭富生物制品廠,批號:050121);2,4-二硝基苯酚(上海試劑三廠,批號950920)。1.2動物昆明種小鼠,18~22g,雌雄兼用;SD大鼠180~200g,雌雄兼用。均由浙江中醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。1.3鼠部水質(zhì)及體溫w721型分光光度計(四川分析儀器廠產(chǎn)品);GJ-8402型熱板測痛儀[電壓220V,功率150W,溫度(55±0.2)℃,浙江寧海白石電子醫(yī)藥儀器廠產(chǎn)品];RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);半導(dǎo)體體溫表(上海醫(yī)用儀表廠);TG-328型電子分析天平(上海天平儀器廠);排水法測定鼠爪體積裝置(自制);TDZ5-WS低速自動平衡離心機(湖南賽特湘儀離心機儀器有限公司)。2方法2.1抗炎作用2.1.1小鼠分組及給藥方案取小鼠50只,雌雄各半,隨機均分5組?？瞻讓φ战M給同劑量的生理氯化鈉溶液(NS),ERT高中低劑量3組(4.8,2.4,1.2g·kg-1)、陽性藥組(阿司匹林100mg·kg-1)。各組均ig給藥,qd,連續(xù)4d。于末次給藥后1h,每組每只小鼠依次自尾靜脈注射5%伊文思蘭0.1mL·10g-1,同時腹腔注射0.6%醋酸溶液0.2mL。30min后斷頭處死小鼠,剖開腹腔,每次用5mL生理氯化鈉溶液沖洗腹腔,共3次,用吸管吸取腹腔洗出液,離心5min(3000r·min-1),取上清液,721型分光光度計590nm測吸收度。2.1.2ld503d取小鼠50只,雌雄各半,隨機均分5組,分組情況同2.1.1。各組均ig給藥,qd,連續(xù)4d。于末次給藥后1h,各組小鼠右耳廓兩面均勻涂抹二甲苯(每只0.05mL),4h后脫頸椎處死小鼠,沿耳廓邊緣剪下左、右兩耳,用8mm打孔器在兩耳相同部位取下耳片,電子分析天平稱重,用右耳片重量減去左耳片重量,即得到腫脹凈值,并計算耳腫抑制率。2.1.3大鼠sc10%蛋清取雌雄大鼠50只,隨機均分5組,分組情況同2.1.1。各組均ig給藥,qd,連續(xù)4d。于實驗當日先用排水法測定鼠爪體積裝置測量每只大鼠右后足跖正常體積,給藥后60min,予每只大鼠右后足跖(右后足掌心向踝關(guān)節(jié)方向)sc10%蛋清0.1mL。分別測量給藥后1,2,3及4h大鼠右后足跖體積,用致炎后體積減去正常體積所得差值,即為各時間段足跖腫脹凈值。2.2使用植物鎮(zhèn)痛2.2.1陽性組和陽性藥組10.2.4取雌雄各半小鼠50只,隨機均分5組。分別為空白對照組(NS)、ERT高中低劑量3組(4.8,2.4,1.2g·kg-1)、陽性藥組(羅通定50mg·kg-1)。各組均ig給藥,qd,連續(xù)3d。于末次給藥后1h,各組小鼠均ip0.6%醋酸溶液0.2mL,記錄自注射醋酸致痛后每只小鼠在20min內(nèi)出現(xiàn)的扭體反應(yīng)次數(shù),結(jié)果作組間比較,并計算鎮(zhèn)痛率。2.2.2給藥前痛閾值的測定取雌性小鼠若干,于正式實驗前先逐只用熱板測痛儀進行篩選。篩選時每次取小鼠1只,記錄自放入測痛儀中至出現(xiàn)舔后足所需時間(s),以此作為該小鼠給藥前痛閾值,凡是5s內(nèi)出現(xiàn)舔后足或30s內(nèi)不出現(xiàn)舔后足者棄之不用。將預(yù)選合格的小鼠作正式實驗,每組10只,共5組,分組情況同2.2.1。各組均ig給藥,于給藥后每隔30min測定各組小鼠痛閾值,連續(xù)測3次。超過60s者則按60s計算。2.3set的解熱作用2.3.1大鼠前近代血清學(xué)指標檢測大鼠前因子檢測取雌雄大鼠若干,預(yù)測體溫3d,bid。實驗當日測定大鼠基礎(chǔ)體溫,篩選體溫波動小者為實驗用大鼠,用20%酵母混懸10mg·kg-1注入大鼠背部皮下,6h后測量肛溫,凡直腸溫度上升不到0.8℃的大鼠剔除不用,取合格大鼠50只分為5組,空白對照組(NS)、ERT3組(4.8,2.4,1.2g·kg-1)、陽性藥組(阿司匹林100mg·kg-1),均ig給藥,于給藥后每隔60min測定各組大鼠肛溫,連續(xù)測3次。2.3.2實驗用大鼠分組取雌雄大鼠50只,預(yù)測體溫3d,bid。實驗當日測定大鼠基礎(chǔ)體溫,篩選體溫波動小者為實驗用大鼠。隨機均分5組,分組情況同2.3.1,均ig給藥。灌胃給藥后60min,于背部皮下注射2,4-二硝基苯酚10mL·kg-1(160mg·kg-1)致熱,每隔30min測量大鼠體溫1次,連續(xù)測定3h。3實驗數(shù)據(jù)處理鎮(zhèn)痛、抗炎及解熱各實驗結(jié)果數(shù)據(jù)均采用ˉx±s表示。結(jié)果統(tǒng)計均采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行。結(jié)果1影響小鼠和大鼠的急性炎癥反應(yīng)1.1細血管透皮張力結(jié)果表明,ERT高、中劑量組對小鼠毛細血管通透性有顯著的抑制作用,見表1。與對照組比較,a:P<0.05,b:P<0.01,c:P<0.001(下同)1.2耳廓急性炎癥性水腫結(jié)果表明,ERT各劑量組可明顯抑制二甲苯所致小鼠耳廓急性炎癥性水腫,與空白對照組比較差異顯著。提示ERT對二甲苯所致小鼠耳腫脹有明顯抑制作用,見表2。1.3ert的抑制作用結(jié)果表明,在蛋清致大鼠足跖致炎4h的不同時間段內(nèi),ERT各劑量組均有抑制腫脹作用,與空白對照組比較差異顯著,提示ERT對蛋清致大鼠足腫脹有顯著抑制作用,見表3。2影響小鼠疼痛反應(yīng)的因素2.1致小鼠扭體次數(shù)與空白對照對結(jié)果表明,ERT高、中劑量組對醋酸所致小鼠扭體次數(shù)與空白對照組比較明顯減少,具有顯著差異。提示藥物對醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)有明顯抑制作用,見表4。2.2影響熱板反應(yīng)的因素結(jié)果表明,ERT各劑量組均能提高熱致痛小鼠的痛閾率,提示其可抵抗熱致痛對小鼠的影響,并使其痛感潛伏期明顯延長,見表5。3解熱作用3.1兩組大鼠體溫下降持續(xù)時間比較結(jié)果表明,ERT高、中劑量組能使酵母致熱的大鼠體溫下降持續(xù)時間達180min;而低劑量組只有在180min時才體現(xiàn)降溫作用。提示ERT對干酵母所致大鼠高熱有解熱作用,見表6。3.2兩組體溫下降ERT高、中劑量組能使2,4-二硝基苯酚致熱的大鼠體溫下降,持續(xù)時間達180min之久;而低劑量組于150min后才體現(xiàn)明顯的降溫作用。提示ERT對2,4-二硝基苯酚所致大鼠高熱有解熱作用,見表7。熱板法小鼠炎癥因子各組ERT能明顯抑制醋酸所致小鼠腹腔毛細血管通透性,其中以4.8g·kg-1作用最明顯(P<0.001);對二甲苯所致小鼠耳殼腫脹有明顯的抑制作用,與阿司匹林作用相似(P<0.001);ERT還可抑制大鼠蛋清性足腫脹,尤其在2.4g·kg-1作用顯著(P<0.001),優(yōu)于阿司匹林。結(jié)果提示ERT對急性炎癥有明顯的抑制作用。ERT各組對醋酸所致小鼠扭體次數(shù)較空白對照組明顯減少,其中2.4g·kg-1作用最明顯(P<0.001);同時ERT各組還能顯著提高熱板法小鼠痛閾值,提示ERT有明顯的鎮(zhèn)痛作用。ERT各組能顯著降低干酵母