藥物致兔視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞損傷的實(shí)驗(yàn)研究

現(xiàn)代光學(xué)治療方法包括對(duì)光學(xué)藥物的藥物治療、皮膚科的治療、手術(shù)的治療和視覺(jué)功能的治療。目前大部分臨床醫(yī)生對(duì)原發(fā)性開角型青光眼尤其是早期患者仍選擇藥物為首選治療方法,而高眼壓癥患者、開角型和閉角型青光眼不能或不愿行激光或手術(shù)治療者則需終生使用青光眼藥物以控制眼壓。長(zhǎng)期使用青光眼藥物后,藥物本身及眼藥中添加的防腐劑將不可避免地對(duì)患者的眼表結(jié)構(gòu)(淚膜、結(jié)膜、角膜上皮)產(chǎn)生影響,引起淚膜功能破壞、球結(jié)膜亞臨床炎癥、球結(jié)膜和角膜上皮細(xì)胞的損傷,導(dǎo)致患者眼部不適、長(zhǎng)期用藥依從性降低、甚至干眼的發(fā)生。此外,當(dāng)部分患者由于藥物治療后眼壓控制不良而行濾過(guò)手術(shù)治療時(shí),眼表結(jié)構(gòu)的變化可能促進(jìn)濾過(guò)道的瘢痕化,導(dǎo)致濾過(guò)手術(shù)的失敗。目前國(guó)外已開展抗青光眼藥物對(duì)眼表毒性的研究,國(guó)內(nèi)對(duì)我國(guó)常用的抗青光眼藥物眼表毒性作用的相關(guān)報(bào)道較少。并且,國(guó)內(nèi)外臨床醫(yī)師應(yīng)用一線青光眼藥物種類有所差異,藥物中添加的防腐劑種類也有所不同。例如,國(guó)外進(jìn)行眼表毒性研究最多的是前列腺素類藥物,因價(jià)格昂貴,目前還未能成為國(guó)內(nèi)的主要抗青光眼用藥。而作為最古老的抗青光眼藥物之一的毛果蕓香堿,由于它使用后引起的調(diào)節(jié)痙攣、視物模糊、視網(wǎng)膜脫離等副作用,在國(guó)外已不屬于最主要的青光眼用藥;但因其價(jià)格低廉,制備工藝成熟,在我國(guó)許多基層醫(yī)院仍在廣泛使用。國(guó)外眼藥中最常用的防腐劑是氯化苯甲烴胺(benzalkoniumchloride,BAC),但該防腐劑在國(guó)產(chǎn)眼藥中使用較少,國(guó)內(nèi)常用的防腐劑種類包括硫柳汞、三氯叔丁醇、洗必泰及新潔爾滅等。因此,為探討目前臨床上常用的國(guó)產(chǎn)青光眼藥物與進(jìn)口青光眼藥物對(duì)眼表影響的區(qū)別、國(guó)內(nèi)外常用防腐劑對(duì)眼表的影響的不同,我們選用毛果蕓香堿滴眼液(1%pilocarpine,國(guó)產(chǎn))和布林佐胺滴眼液(1%brinzolamide,進(jìn)口)以及各自添加的防腐劑進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn),以評(píng)價(jià)它們對(duì)結(jié)膜和角膜等眼表結(jié)構(gòu)的影響及差異。材料和方法1氯縣丁醇酯、前光醇酯及其他alcon本研究中使用的1%毛果蕓香堿滴眼液(1%pilocarpine,粵藥制字H03020639,批號(hào)060817)由中山大學(xué)中山眼科中心制備,所含防腐劑為0.01%三氯叔丁醇;1%布林佐胺滴眼液(1%brinzolamide,批號(hào)06D26I)由Alcon生產(chǎn),所含防腐劑為0.01%BAC。防腐劑溶液0.01%三氯叔丁醇和0.01%BAC由中山眼科中心藥劑室配制。2眼底藥物使用組選用新西蘭大白兔15只,體重1.5-2.0kg,雌雄兼用。常規(guī)裂隙燈顯微鏡檢查排除眼部疾病。隨機(jī)選擇3只兔列入空白對(duì)照組,其余12只兔隨機(jī)分為2組,列入藥物組,每組6只兔,命名為毛果蕓香堿組(A組)和布林佐胺組(B組)。右眼使用青光眼藥物,歸為1組;左眼使用防腐劑,歸為2組。3方法3.1連續(xù)給藥時(shí)間及用藥時(shí)間參考目前臨床上青光眼患者的用藥方法,毛果蕓香堿和對(duì)應(yīng)的防腐劑三氯叔丁醇每天滴眼4次(用藥時(shí)間:上午8點(diǎn)、中午12點(diǎn)、下午4點(diǎn)、晚上8點(diǎn)),布林佐胺及防腐劑BAC每日滴眼2次,用藥時(shí)間為上午8點(diǎn)和晚上8點(diǎn),均連續(xù)用藥30d。3.2球薄膜的固定新西蘭大白兔用藥30d后,經(jīng)耳緣靜脈空氣栓塞處死。為了減少取材偏差,每只兔的球結(jié)膜組織均取自上方12點(diǎn)鐘,自角膜緣至角膜緣后約6mm剪取上方的球結(jié)膜,迅速置于4%多聚甲醛中固定,4℃保存,固定時(shí)間24h。沿角膜緣剪取全周角膜,用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗,表面干凈后立即置于3%戊二醛中固定,4℃保存,固定時(shí)間4h。3.3細(xì)胞漿和細(xì)胞核的染色結(jié)膜在4%多聚甲醛中固定24h后,用60%、70%、80%、90%及無(wú)水乙醇梯度脫水,石蠟包埋,連續(xù)切片,厚5μm。行蘇木素-伊紅(HE)染色:石蠟切片脫蠟至水,蘇木素溶液染色3min,自來(lái)水充分水洗、顯藍(lán);1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒,洗滌;伊紅復(fù)染3min后,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封固后置于光學(xué)顯微鏡下觀察。染色結(jié)果顯示為細(xì)胞漿呈紅色,細(xì)胞核呈藍(lán)色。于高倍鏡下(×40)進(jìn)行上皮層炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù),任意計(jì)數(shù)3個(gè)高倍視野后取平均值。3.4去蛋白鏡分級(jí)角膜組織在戊二醛中固定后,用0.1mol/LPBS沖洗3次,每次10min。用30%、50%、70%、90%及無(wú)水乙醇逐級(jí)梯度脫水,醋酸異戊酯置換。臨界點(diǎn)干燥,用離子濺射鍍膜儀于標(biāo)本表面噴鍍金屬導(dǎo)電層后,由一位觀察者用掃描電鏡(SEM,PhilipXL-30)進(jìn)行觀察評(píng)分。每1個(gè)角膜標(biāo)本均任意選取距離角膜頂點(diǎn)2mm的3個(gè)觀察點(diǎn),在3000倍和6000倍下觀察角膜上皮細(xì)胞微絨毛有無(wú)丟失、細(xì)胞膜有無(wú)皺縮、上皮細(xì)胞表面的空洞數(shù)量、上皮細(xì)胞的形態(tài)、細(xì)胞交界邊緣、暗細(xì)胞數(shù)量以及上皮細(xì)胞有無(wú)丟失等。根據(jù)Berdy等的角膜上皮損害的掃描電鏡分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí),設(shè)0-5級(jí),0級(jí)表示無(wú)損害,5級(jí)表示嚴(yán)重?fù)p害。0級(jí):無(wú)微絨毛的破壞和細(xì)胞膜皺縮,無(wú)上皮細(xì)胞剝脫,細(xì)胞空洞數(shù)量正常;1級(jí):微絨毛輕度受損,發(fā)生細(xì)胞膜皺縮的細(xì)胞數(shù)少于上皮細(xì)胞總量的10%,上皮細(xì)胞剝脫數(shù)<2%,細(xì)胞空洞增加,暗細(xì)胞增加;2級(jí):微絨毛中度彌漫受損,發(fā)生細(xì)胞膜皺縮的細(xì)胞數(shù)介于上皮細(xì)胞總量的10%-50%,上皮細(xì)胞剝脫數(shù)占細(xì)胞總量2%-25%,上皮細(xì)胞的六邊形結(jié)構(gòu)發(fā)生改變;3級(jí):發(fā)生細(xì)胞膜皺縮的細(xì)胞數(shù)超過(guò)上皮細(xì)胞總量50%,彌漫性的上皮細(xì)胞剝脫,超過(guò)上皮細(xì)胞總量25%,細(xì)胞間的間距增寬;4級(jí):表層上皮細(xì)胞完全丟失,第2層細(xì)胞層完整;5級(jí):在4級(jí)的基礎(chǔ)上發(fā)生第2層細(xì)胞丟失。4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)(xˉ±s)表示;采用Mann-WitneyU檢驗(yàn)進(jìn)行各個(gè)獨(dú)立組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;Wilcoxon檢驗(yàn)進(jìn)行左右兩眼之間炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)和角膜上皮評(píng)分的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果1球結(jié)膜組織光度檢查1.1上皮細(xì)胞的排列正常對(duì)照組兔眼球結(jié)膜組織常規(guī)石蠟切片光鏡下檢查可見(jiàn):上皮細(xì)胞排列整齊,杯狀細(xì)胞數(shù)量正常,上皮基底膜完整;上皮下膠原組織疏松;無(wú)明顯的急性或慢性炎癥表現(xiàn),僅見(jiàn)少量散在的炎癥細(xì)胞,見(jiàn)圖1A。1.2治療前后球結(jié)晶上皮質(zhì)炎癥細(xì)胞數(shù)毛果蕓香堿組(A1、A2組)兔球結(jié)膜光鏡檢查結(jié)果與對(duì)照組相比,球結(jié)膜上皮層炎癥細(xì)胞增多不明顯;而布林佐胺組(B1、B2組)的上皮層炎癥細(xì)胞數(shù)較正常對(duì)照組顯著增多(表1、圖1B-E)。A1組和B1組(Z=-2.923,P<0.01)、A2和B2組(Z=-2.898,P<0.01)之間球結(jié)膜上皮層炎癥細(xì)胞數(shù)均差異顯著。同時(shí),為分析青光眼藥物與防腐劑各自在對(duì)眼表的影響中的作用,我們對(duì)兩組左右兩眼的炎癥細(xì)胞數(shù)進(jìn)行了對(duì)比分析。結(jié)果顯示A1組與A2組(Z=-0.674,P>0.05)、B1組與B2組(Z=-0.105,P>0.05)之間球結(jié)膜上皮層炎癥細(xì)胞數(shù)均無(wú)顯著差異。2綜合掃描電鏡檢查結(jié)果2.1視網(wǎng)膜微絨毛細(xì)胞正常對(duì)照組兔角膜上皮組織掃描電鏡觀察可見(jiàn):角膜上皮細(xì)胞呈多邊形,邊界清晰、排列整齊,細(xì)胞膜無(wú)皺縮,細(xì)胞表面微絨毛豐富,細(xì)胞空洞和暗細(xì)胞數(shù)量少、幾乎不可見(jiàn),見(jiàn)圖2A。2.2布林佐胺對(duì)兔視網(wǎng)膜組織形態(tài)變化的影響毛果蕓香堿組兔角膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化,呈規(guī)則的多邊形,邊界清晰,細(xì)胞膜皺縮不明顯;但上皮細(xì)胞表面的細(xì)胞空洞增加,可見(jiàn)散在分布的暗細(xì)胞,微絨毛輕度丟失,見(jiàn)圖2B。單純使用三氯叔丁醇后兔角膜上皮組織的形態(tài)與使用毛果蕓香堿后的角膜上皮組織的形態(tài)變化無(wú)明顯差別,見(jiàn)圖2C。布林佐胺組兔角膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜皺縮、細(xì)胞間隙增寬,細(xì)胞交界處邊界模糊;上皮細(xì)胞表面微絨毛丟失較嚴(yán)重,細(xì)胞空洞和暗細(xì)胞數(shù)量顯著增加,甚至部分上皮細(xì)胞剝脫丟失,見(jiàn)圖2D。單純使用0.01%BAC也可引起類似的角膜上皮損害,見(jiàn)圖2E。根據(jù)角膜上皮損害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn),正常對(duì)照組角膜上皮評(píng)分為0.50±0.55,A1組為1.33±0.52,A2組為1.50±0.55,B1組為2.83±0.68,B2組為2.75±0.76,各組的損害評(píng)分均顯著高于對(duì)照組(表2)。B1組(Z=-2.802,P<0.01)、B2組(Z=-2.514,P<0.05)的損害評(píng)分分別較A1組、A2組的損害評(píng)分顯著增高;A1組與A2組(Z=-1.000,P>0.05)、B1組與B2組(Z=-0.378,P>0.05)損害評(píng)分無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。球從藥物的作用國(guó)外針對(duì)局部應(yīng)用青光眼藥物對(duì)眼表的毒副作用已進(jìn)行了體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn),但是國(guó)外的研究結(jié)果并不完全適用于國(guó)內(nèi)的用藥情況。國(guó)內(nèi)外的一線青光眼藥物選擇存在差別,國(guó)外對(duì)眼表毒副作用研究最多的前列腺素類藥物,如拉坦前列腺素、曲伏前列素、貝美前列素等。然而由于此類藥物價(jià)格昂貴,在國(guó)內(nèi)還未能向大部分患者推廣使用。毛果蕓香堿是最古老的抗青光眼藥物之一,自19世紀(jì)使用至今,在青光眼的治療中起了重要作用。但由于使用后會(huì)引起調(diào)節(jié)痙攣、視物變暗、眉弓疼痛等副作用,高濃度頻繁滴眼還可能導(dǎo)致胃腸道反應(yīng)、頭痛、出汗等全身中毒癥狀,因此隨著新的抗青光眼藥物的研發(fā)成功,在國(guó)外它已不屬于一線青光眼用藥。然而,在我國(guó)尤其在許多基層醫(yī)院仍是占主導(dǎo)地位的青光眼藥物。且我國(guó)的閉角型青光眼的發(fā)病率明顯高于西方國(guó)家,對(duì)一部分不能或不愿行激光或手術(shù)治療的患者或者激光治療后需要聯(lián)合藥物治療的患者,毛果蕓香堿因其能夠使瞳孔括約肌收縮的藥理作用而具有其它青光眼藥物不可替代的地位。毛果蕓香堿可以使瞳孔括約肌收縮,減少虹膜組織在房角的堆積從而開放房角,使房水流經(jīng)小梁網(wǎng)進(jìn)入Schlemm管而降低眼內(nèi)壓,對(duì)閉角型青光眼的治療效果較好。碳酸酐酶抑制劑是另一類十分重要的抗青光眼藥物,傳統(tǒng)劑型是以乙酰唑胺為代表的口服制劑,可以抑制房水生成,降低眼壓,但長(zhǎng)期服用會(huì)導(dǎo)致指趾麻木、腎絞痛、血尿等全身副作用,因此,限制了它的臨床應(yīng)用。布林佐安滴眼液是新型的局部碳酸酐酶抑制劑,在有效降低眼壓的同時(shí)不會(huì)引起明顯的全身毒副作用,因此研發(fā)上市后已較廣泛運(yùn)用于臨床。球結(jié)膜的健康狀況與青光眼用藥的舒適度密切相關(guān),球結(jié)膜炎癥引起的眼部不適和刺激癥狀將影響青光眼患者長(zhǎng)期用藥的依從性;同時(shí),球結(jié)膜的炎癥和纖維化程度也將直接影響青光眼濾過(guò)手術(shù)的成功率,因此,球結(jié)膜的情況一直很受治療青光眼醫(yī)生的重視。我們的研究結(jié)果表明在使用青光眼藥物和防腐劑30d后,毛果蕓香堿組的兔球結(jié)膜組織的上皮層炎癥細(xì)胞與對(duì)照組無(wú)明顯差異,而布林佐胺滴眼液和BAC導(dǎo)致球結(jié)膜上皮層炎癥細(xì)胞顯著增多。參考目前臨床上青光眼患者的用藥方法,在本研究中盡管毛果蕓香堿滴眼液和防腐劑三氯叔丁醇每日點(diǎn)藥4次,而布林佐胺滴眼液和BAC僅點(diǎn)藥2次,但它們對(duì)球結(jié)膜組織的副作用仍輕于布林佐胺滴眼液和BAC。究其原因,由于左右兩眼之間的球結(jié)膜炎癥并無(wú)顯著差異,我們推測(cè)防腐劑在球結(jié)膜炎癥的發(fā)生過(guò)程中起主要作用。Debbasch等選擇Chang結(jié)膜細(xì)胞進(jìn)行青光眼藥物各種防腐劑的毒性研究,發(fā)現(xiàn)三氯叔丁醇對(duì)結(jié)膜上皮細(xì)胞的毒性很低,BAC與三氯叔丁醇、硫柳汞相比,則是毒性最強(qiáng)的一類防腐劑。BAC對(duì)結(jié)膜細(xì)胞的毒性作用呈劑量依賴性,在較低濃度(≤0.005%)范圍時(shí),BAC濃度越高對(duì)結(jié)膜上皮細(xì)胞的毒性作用越明顯,可引起細(xì)胞的凋亡;而短期、高濃度使用BAC,將直接導(dǎo)致細(xì)胞壞死。Baudouin等推測(cè)防腐劑成份首先引起球結(jié)膜細(xì)胞分泌的炎癥介質(zhì)增多(如IFN-γ、血小板激活因子等),炎癥介質(zhì)誘導(dǎo)HLA-DR抗原和CD-23的表達(dá),從而進(jìn)一步引起球結(jié)膜細(xì)胞群的變化和炎癥的產(chǎn)生。鑒于毛果蕓香堿滴眼液對(duì)球結(jié)膜的損害輕于布林佐胺滴眼液,盡管毛果蕓香堿滴用后存在一些副作用,但對(duì)已經(jīng)存在球結(jié)膜慢性炎癥或者干眼的患者,如果不存在藥物使用禁忌癥,從對(duì)眼表毒性的角度考慮,毛果蕓香堿滴眼液優(yōu)于布林佐胺滴眼液。掃描電鏡檢測(cè)顯示青光眼藥物和防腐劑均會(huì)導(dǎo)致兔角膜上皮超微結(jié)構(gòu)的損傷,表現(xiàn)為角膜上皮細(xì)胞六邊形結(jié)構(gòu)變?yōu)椴灰?guī)則、邊界不清、細(xì)胞膜皺縮、細(xì)胞間距增寬、上皮細(xì)胞表面的微絨毛丟失、細(xì)胞空洞和暗細(xì)胞增加等。布林佐胺滴眼液和BAC對(duì)角膜上皮細(xì)胞的損傷顯著重于毛果蕓香堿滴眼液和三氯叔丁醇。Noecker等為探討青光眼藥物對(duì)角膜的影響,曾對(duì)新西蘭大白兔使用酒石酸溴莫尼定、噻嗎心胺、拉坦前列腺素等青光眼藥物并進(jìn)行角膜掃描電鏡檢測(cè),結(jié)果表明這些藥物均會(huì)導(dǎo)致角膜上皮超微結(jié)構(gòu)的損傷,也表現(xiàn)為微絨毛丟失、上皮細(xì)胞空洞增多和暗細(xì)胞增多等,角膜暗細(xì)胞的性質(zhì)可能是凋亡的角膜上皮細(xì)胞。由于左右兩眼的角膜上皮細(xì)胞的損害并無(wú)顯著差異,我們分析防腐劑是導(dǎo)致角膜上皮細(xì)胞損害的主要因素。三氯叔丁醇屬于丙酮的氯衍生物,雖然對(duì)角膜上皮細(xì)胞有直接的細(xì)胞毒性,但毒性較輕、且可逆。BAC是一種四價(jià)氨化合物,可以嵌入細(xì)胞膜改變細(xì)胞膜的離子電阻而導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中BAC對(duì)角膜細(xì)胞的毒性作用也呈劑量依賴性,在較低濃度(≤0.005%)范圍時(shí),引起細(xì)胞的凋亡;而短期、高濃度使用BAC,將直接導(dǎo)致細(xì)胞壞死。同時(shí),由