第十六章藥品質(zhì)量控制中的現(xiàn)代

分析方法與技術(shù)

基本要求

毛細管氣相色譜分析法

手性藥物的液相色譜分析法

核磁共振光譜分析法氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)返回主目錄基本要求一、熟悉毛細管氣相色譜法、手性藥物的高效液相色譜法的基本內(nèi)容及其在藥物分析中的應(yīng)用。二、熟悉核磁共振光譜分析法的定量方法及其在藥物分析中的應(yīng)用。三了解毛細管電泳分析法、紅外光譜法、聯(lián)用技術(shù)在藥物分析中的應(yīng)用。返回

毛細管氣相色譜法使用的色譜柱是空心的毛細管柱，叫開管柱：固定液涂漬或固定化在柱管內(nèi)壁上，而載氣和其中的樣品從中心的通道上通過。柱材料主要是熔融石英（FSOT）。

一、高分辨氣相色譜法（一）色譜柱

1．毛細管柱的類型：

柱類型柱內(nèi)徑柱長液膜厚度

普通開管柱0.2～0.53mm5～60m0.1～1.0μm

壁涂開管柱

多孔層開管柱

擔(dān)體涂漬開管柱

微內(nèi)徑開管柱﹤100μm

大內(nèi)徑開管柱0.32mm1μm或5μm

2．毛細管柱的選擇

常用的固定液有：SE-31、OV-1、SE-54、SE-52、OV-1701、Carbowax20M。

柱的選擇：根據(jù)樣品組分的沸點，一般地，相差2℃或2℃以上的組分，采用非極性毛細管柱分離；若沸點相差在2℃以內(nèi)的組分，則需在極性較大的毛細管柱上分離。

3．毛細管柱的性能評價

評價指標(biāo)：分離效率、表面惰性、熱穩(wěn)定性。

評價方法：在一定的色譜條件下，分離各種測試物質(zhì)，獲得的特征性數(shù)據(jù)和峰對稱性，以此來評價柱效和表面活性。在測定了柱效和表面活性之后，用流失速率試驗來評價熱穩(wěn)定性。

（二）進樣方式

分流進樣：使用方便，對分流比、進樣溫度

樣品和載氣的情況、進樣體積和

濃度、進樣重復(fù)性需要注意。

不適于痕量分析和寬沸程樣。

適合大多數(shù)類型的樣品，樣品濃濃高、各組分的濃度相近

不分流進樣：須利用溶劑效應(yīng)或冷阱，操作較難

特別適用于痕量分析和寬沸程樣品

柱頭進樣：必須使用外徑為0.17～0.23mm的

細針，柱內(nèi)徑必須大于0.32mm,

不能通過隔墊進樣，緩慢進樣

對熱不穩(wěn)定、稀的和寬沸程樣品較

理想；能給出定量結(jié)果

非揮發(fā)物在柱的中積累導(dǎo)致柱變性

和柱效損失

直接進樣：樣品無須事先濃縮，進樣器溫度可較低，載氣消耗量小，分析所需樣量小適用于濃度范圍要比不分流進樣寬一個數(shù)量級以上的樣品，有利于對熱不穩(wěn)定的樣品；當(dāng)樣品中含有揮發(fā)性低的組分時，難于定量分析

（三）應(yīng)用示例----人尿中勞拉西泮的檢測

1.測定意義：勞拉西泮(簡稱LRZ)上用為催眠、鎮(zhèn)靜和抗癲癇藥物,常被犯罪分子作為麻醉藥物用于麻醉搶劫等麻醉后犯罪。為了確證這類案件的性質(zhì),經(jīng)常需要對受害人的血、尿等體液中麻醉藥物或其代謝物進行檢測。人體攝入該藥后其血液中藥物濃度較低,且犯罪分子所用藥量一般不使受害人死亡,而且此類案件一般報案較遲，因此血中藥物濃度較低,對其檢測較為困難。該藥主要以葡萄糖醛酸苷的形式由尿液排泄。

2.色譜條件：HP-5毛細管柱(30ｍ×0.32mm,膜厚0.1μｍ)。氮磷檢測器,不分流進樣(閥關(guān)閉時間0.75min),進樣口溫度:280℃,柱溫:200℃(1min)20℃/min280℃(15min),載氣為高純氮(2.2ｍml/min),尾吹氣為高純氮(10ml/min)。3.樣品預(yù)處理----酶解及萃取

取檢尿1ml,加10mg/L的羥乙基氟西泮(HEF)標(biāo)準工作液10μl,再加pH4.8的乙酸鹽緩沖液50μl及β-葡萄糖醛酸苷酶溶液0.1μl,置于55℃水浴中水解4ｈ冷至室溫后加pH10.8的碳酸鹽緩沖液0.5ml及乙醚5ml,渦旋2min,離心,分取上層有機相4ml置于經(jīng)硅烷化處理的帶尾管的雞心瓶中,加甲醇0.4ml,于40℃水浴中揮發(fā)至約0.1ml,進樣1μl進行GC分析

4.方法學(xué)評價

（1)選擇性:空白尿1ml及空白尿1ml加LRZ和HEF標(biāo)準液,經(jīng)酶解、萃取后進樣分析所得色譜圖表明尿中雜質(zhì)不干擾檢測.

（2)線性試驗:用空白尿配制不同濃度的LRZ標(biāo)準液進行酶解、萃取、進樣分析,將LRZ與HEF色譜峰面積的比值與LRZ在尿液中的質(zhì)量濃度進行線性回歸,得到工作曲線方程:Y=3.1×10-3X–3.0×10-3,ｒ=0.998。LRZ在尿中的濃度為50～500μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性.（3)萃取液的選擇及萃取率:作者進行了多種溶劑萃取LRZ的研究,由經(jīng)萃取與未經(jīng)萃取所得色譜峰面積比計算LRZ的萃取率,得(mean±SD)為(83.4±3.1)%。

（4）檢出限:以3倍信噪比計算檢出限,得本法的檢出限為5μg/L。

（5)回收率:由工作曲線計算LRZ的質(zhì)量濃度及其回收率,得(mean±SD)為(103.3±5.1)%。

5.尿液檢測:志愿者口服LRZ2ｍｇ后,于32小時內(nèi)收集其排泄的尿液進行檢測,LRZ于9h達尿中最高濃度為444μｇ/L,檢測結(jié)果表明,本方法適合于麻醉后犯罪案件中ＬＲＺ的檢測要求。

返回二、手性藥物的高效液相色譜法

（一）手性藥物拆分機理

為了使對映體轉(zhuǎn)化為化學(xué)和物理性質(zhì)不同的非對映體，就要提供一種手性源，使待拆分的對映異構(gòu)體（樣品）、手性作用物（如固定相）和手性源之間形成一個非對映異構(gòu)分子的絡(luò)合物。在對映體拆分理論中頗為流行的是“三點手性識別模式”。

（二）手性HPLC拆分法的類型

直接法：柱前手性衍生化法

間接法：手性流動相拆分法、手性固定相拆分法

1．柱前手性衍生化法：對映體混合物以手性試劑作柱前衍生化，形成非對映體，然后以常規(guī)（偶見手性）固定相分離。

對手性衍生化試劑的要求：高光學(xué)純度。

常用的手性衍生化試劑：羧酸衍生物類、胺類、異硫氰酸酯類、異氰酸酯類、萘衍生物類、光學(xué)活性氨基酸類、固相衍生化試劑。

2．手性流動相拆分法（手性洗脫法或手性流動相添加劑法）：將手性試劑加入流動相中，手性添加劑與樣品形成手性絡(luò)合物。

常用的手性添加劑：配基交換