一種新的老年性癡呆大鼠模型的建立

阿爾茨海默?。╝d）是老年人常見的疾病，主要表現(xiàn)為記憶力低下、日常生活繼續(xù)障礙、行為和人格障礙。以青年腫瘤（cp）和神經(jīng)纖維（ntfs）為主要病理改變的神經(jīng)精神疾病。近年來,雖然復(fù)制出許多AD動物模型,但多數(shù)未能很好反映或接近反映AD病人的臨床全貌而僅模擬了AD部分特征,因此研制理想的動物模型是近年來AD研究的熱點。本課題組用高齡大鼠加左側(cè)側(cè)腦室一次性注射聚集態(tài)的Aβ25-35建立AD大鼠模型,通過行為學(xué)試驗和腦組織病理檢查等方法來研究這種復(fù)合式AD動物模型與人類AD的相似程度。1材料和方法1.1實驗動物及抗雄性Wistar大鼠,(18～24)月齡,體重450g～550g(山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供),按國際通用標(biāo)準(zhǔn)和方法,選出正常老年大鼠。Aβ25-35(美國Sigma);兔抗大鼠Aβ1-40(武漢博士德);羊抗兔的二抗(北京中杉);AgNO3(北京化工)。1.2模型定位問題正常老年大鼠24只,隨機分為正常組、假手術(shù)組和模型組,每組8只。5%的水合氯醛6mL/kg腹腔注射,麻醉大鼠,將鼠頭固定于江灣I—C型腦立體定位儀上保持前后囪在同一水平,頭頂部正中切口,暴露前囟,按大鼠腦立體定位圖譜進行定位,在前囟點后方1.3mm,中線旁開2.0mm,用5mL注射器針頭鉆一小孔,垂直插入10μL微量注射器,深度為4.0mm(達側(cè)腦室)。模型組緩慢注射5μL聚集態(tài)的Aβ25-35,假手術(shù)組注入等容積生理鹽水,注射時間持續(xù)10min,留針10min。注射完畢后,局部撒復(fù)方新諾明藥粉防止感染,縫合頭皮,術(shù)后肌肉注射青霉素每只4×104U/d,連續(xù)3d。1.3大鼠游泳路徑檢測造模7d后應(yīng)用Morris水迷宮進行行為學(xué)檢測。平臺設(shè)于迷宮東北象限正中,水平面高出平臺1.5cm,水溫保持在19℃～20℃,大鼠連續(xù)訓(xùn)練4d,每天2次,設(shè)定最長游動時間為120s,,記錄大鼠找到平臺所需時間(逃避潛伏期),第5天撤除平臺,記錄2min內(nèi)大鼠的游泳路徑,分析大鼠在平臺象限游泳路徑長度占總路徑長度的百分比。1.4免疫組化染色造模滿2周后,麻醉,快速斷頭,取出全腦,分別取左側(cè)額葉、顳葉和海馬組織,浸泡于10%的中性福爾馬林液固定24h,石蠟包埋,切片,Aβ免疫組化染色和銀染色。1.5統(tǒng)計處理計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,采用SAS10.0軟件進行分析,P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1逃避刑期的延長第1天至第4天訓(xùn)練,假手術(shù)組和正常組逃避潛伏期無差異,表明注射本身對實驗結(jié)果無影響。與正常組、假手術(shù)組比較,模型組逃避潛伏期明顯延長(P<0.01),第5天游經(jīng)平臺象限的路徑長度占總路徑長度的百分比也明顯減小(P<0.01)。詳見表1、圖1。2.2病理試驗的結(jié)果2.2.1低生物量的測定模型組較假手術(shù)組海馬、額葉和顳葉Aβ陽性細胞數(shù)均明顯增加,且平均灰度顯著降低(P<0.01,見圖2～6)。同時,模型組腦皮質(zhì)微血管發(fā)生了腦淀粉樣血管病變(CAA)致微血管阻塞,在腦實質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了老年斑(SP)和小膠質(zhì)細胞,而假手術(shù)組較正常組Aβ的表達量無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,見圖7、圖8)。2.2.2bielschwsky神經(jīng)纖維染色方法的染色結(jié)果模型組與正常組、假手術(shù)組比較可見較多的星形膠質(zhì)細胞,但并未見到典型的NFTs(見圖9)。3老年大鼠a25-33的學(xué)習(xí)記憶能力β-淀粉樣蛋白(Aβ)是各種原因誘發(fā)AD的共同通路,是AD形成和發(fā)展的關(guān)鍵因素。Aβ的生物活性區(qū)域在羧基端第25個～第35個氨基酸,故Aβ25-35能夠刺激小膠質(zhì)細胞內(nèi)信號的級聯(lián)放大,進而形成AD。Yamaguchi等采用大鼠側(cè)腦室內(nèi)一次性注射聚集態(tài)Aβ25-35,發(fā)現(xiàn)AD模型大鼠迷宮作業(yè)時出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶障礙。本實驗結(jié)果也顯示,模型組逃避潛伏期明顯延長,并且隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加,各組的逃避潛伏期均逐步減少,提示隨著學(xué)習(xí)訓(xùn)練次數(shù)的增加,大鼠空間記憶能力得到加強。模型組大鼠在第1次訓(xùn)練時,其逃避潛伏期大于假手術(shù)組和正常組(P<0.01),說明Aβ?lián)p傷十分明顯,其空間短期記憶能力受到明顯的損害。在第2次訓(xùn)練時,正常組、假手術(shù)組的下降斜率非常大,表明未受損大鼠空間記憶能力一般是較強的,而模型組的改變斜率則相對較為緩和,更進一步說明模型組大鼠空間記憶能力受損。結(jié)果表明,Aβ25-35損害的老年大鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降,從行為學(xué)上來評價,該模型是相當(dāng)成功的。β-淀粉樣蛋白沉積在腦實質(zhì)形成SP,以顳葉、海馬和額葉數(shù)量為多,而Aβ在皮質(zhì)血管壁沉積可致CAA,是AD最明顯的血管病變。越來越多的證據(jù)進一步證實Aβ在血管細胞誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)可在CAA和AD病理機制中占有重要角色。本實驗?zāi)Ｐ徒M腦實質(zhì)可見大量SP,同時皮質(zhì)微、小血管發(fā)生了腦淀粉樣血管病變(CAA),甚至導(dǎo)致微血管阻塞。但未發(fā)現(xiàn)典型的NFTs,說明該模型在模擬AD病人的腦內(nèi)NFTs上還有一定的缺陷。此外,Aβ沉積激活小膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)在AD早期病理機制中起著重要的作用。炎癥過程產(chǎn)生的白細胞介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等細胞因子和補體蛋白,進一步活化膠質(zhì)細胞釋放細胞因子或毒性物質(zhì),最終導(dǎo)致神經(jīng)元變性壞死,從而出現(xiàn)癡呆癥狀。實驗結(jié)果示:模型組腦內(nèi)可見大量的小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞,提示炎癥過程參與了AD的發(fā)生。老年大鼠左側(cè)側(cè)腦室一次性注射聚集態(tài)的Aβ25-35所致的復(fù)合