一、電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備用槍頭挑取單克隆菌落，投入盛有10mlLB液體培養(yǎng)基的50ml離心管中。（同時做培養(yǎng)基和槍頭的空白對照）2.37°C,220rpm，培養(yǎng)14-16個小時。第二天，以1：100的比例將這10ml菌液倒入1000mlLB液體培養(yǎng)基中，37度，220rpm, 振搖2-3小時，每半小時測一次OD，當(dāng)OD值達(dá)到0.3-0.4時，停止培養(yǎng)。將菌液在冰上預(yù)冷30分鐘，隨后將菌液分裝到500ml預(yù)冷的離心杯中，4C，2500rpm離心10分鐘。棄上清，離心杯中加入少量ddH2O，使沉淀懸浮后，再將水注滿離心杯，4C，4000rpm離心10分鐘。棄上清，加少量滅菌水，重懸菌體，再將水注滿離心杯，4000rpm，4°。，離心10min。棄上清，往離心杯中加入少量10%甘油（滅菌，預(yù)冷），重懸菌體，再加滿10%甘油，4C,4000rpm,離心10min。棄上清，每個離心杯中加入5ml10%的甘油，使沉淀懸浮后，將菌液以300ul/W分裝于1.5ml的離心管中，-80C冰箱中保存。同時取100pl感受態(tài)加0.01ngpuc18直接電穿孔轉(zhuǎn)化，檢測轉(zhuǎn)化效率。次日觀察轉(zhuǎn)化子生長情況，并記錄。二、連接產(chǎn)物純化1.將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至一1.5mlEppendorf管中，加入下列試劑：10plofddH2O2plof3MNaAC（PH5.2）50plof無水乙醇輕輕混勻，稍微離心并將其置于-20°C放置1小時以上；2.4°C,topSpeed離心30分鐘；小心移去上清，避免接觸到管底的沉淀物；加入500^70%的乙醇，輕輕顛倒幾次洗滌沉淀（注：不要離心混勻）；5.4C,topSpeed離心5分鐘；小心移去上清，將此Eppendorf管置空氣中直至無乙醇?xì)馕?；加?0plddH2O重新溶解沉淀，4C短期保存，-20C長期保存?zhèn)溆?；三、電轉(zhuǎn)化從-80C冰箱中取出感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上解凍；取1pl純化后的質(zhì)粒于一1.5ml的離心管中，將其和0.1CM的電極杯一起置于冰上預(yù)冷。將40?100ul解凍的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至此1.5ml的離心管中，小心混勻，冰上放置10min。打開電轉(zhuǎn)儀，調(diào)至Manual，調(diào)節(jié)電壓為2.1KV。將此混合物轉(zhuǎn)移至已預(yù)冷的電極杯中，輕輕敲擊電極杯使混合物均勻進(jìn)入電極杯的底部;將電極杯推入電轉(zhuǎn)化儀，按一下pulse鍵，聽到蜂鳴聲后，向電擊杯中迅速加入1000pl的SOC液體培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞后，轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心管中。37C，220—250rpm復(fù)蘇1小時。取20pl轉(zhuǎn)化產(chǎn)物加160plSOC涂板，放于37C溫室，過夜培養(yǎng)，次日查看轉(zhuǎn)化結(jié)果。其余菌液加1：1的30%的甘油后混勻一80C保存。注：每塊加有Amp的平板上均勻涂有X-Gal80pl,SOC80pl,IPTG20pl。四、電擊杯清洗流程用清水將電擊杯稍沖一下。向電擊杯中加入的75%酒精浸泡2hr。棄去酒精，再用蒸餾水沖洗2~3遍，然后用1ml的槍吸取超純水反復(fù)吹打電擊杯10遍以上。加入無水乙醇2ml于電擊杯中，浸泡30分鐘。棄去無水乙醇，于通風(fēng)廚內(nèi)揮干乙醇。將清洗好的電擊杯放入-20°C冰箱內(nèi)待用。注：1.不同樣品使用的電機(jī)杯應(yīng)分開；每周用1%酒精浸泡30分鐘。各位蟲友好，想請教下大腸桿菌電轉(zhuǎn)化方面的一些問題，希望各位蟲友多多指教.最近一直在做電轉(zhuǎn)化，可每次制備的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞都不行，最開始做的還可以達(dá)到10的六次方，可最近兩次做的，貌似做好的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞里面的菌體全都死了？是為什么呢？有人有遇到這種情況的嗎？還望各位網(wǎng)友多多指教，感激不盡哈！急急急?。。henchuan24891（站內(nèi)聯(lián)系ta）你應(yīng)該自己好好去按文獻(xiàn)的方法檢查一下，大多數(shù)情況下是自己的失誤造成的。如果還是這樣的話，請你把你做的步驟給大家看一下。clx@6016（站內(nèi)聯(lián)系ta）1樓:Originallypostedbyclx@6016at2011-11-211134:各位蟲友好，想請教下大腸桿菌電轉(zhuǎn)化方面的一些問題，希望各位蟲友多多指教.最近一直在做電轉(zhuǎn)化，可每次制備的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞都不行，最開始做的還可以達(dá)到10的六次方，可最近兩次做的，貌似做好的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)...先把新鮮劃好的菌接到含有Amp的3mlSOB試管中，30度過夜培養(yǎng)，第二天以1:50的接種量轉(zhuǎn)接到50ml含有Amp的SOB中（轉(zhuǎn)接之前加入MgCl2），30度搖菌2小時，OD600為0.1左右，然后加入『阿拉伯糖誘導(dǎo)35分鐘，OD600為0.3-0.4左右。5000轉(zhuǎn)，4度離心10分鐘，收菌。然后用10%甘油重懸3次,5000轉(zhuǎn)，4度離心10分鐘。最后將菌體濃縮500到800倍后保存在10%甘油中。然后立刻電轉(zhuǎn)！如果有什么問題，還請各位前輩多多指教哈！clx@6016（站內(nèi)聯(lián)系TA）3樓:Originallypostedbychenchuan24891at2011-11-270956:你應(yīng)該自己好好去按文獻(xiàn)的方法檢查一下，大多數(shù)情況下是自己的失誤造成的。如果還是這樣的話，請你把你做的步驟給大家看一下。恩，謝謝哈！dnaxxx（站內(nèi)聯(lián)系TA）電轉(zhuǎn)的話應(yīng)該按照電轉(zhuǎn)儀的說明來制備感受態(tài)吧，我們買的儀器有很多菌的protocol和建議電轉(zhuǎn)條件發(fā)布時間：2011年03月07日 點擊次數(shù)：：次3.大腸桿菌電轉(zhuǎn)化及電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞的制備電轉(zhuǎn)化法是利用瞬間高壓在細(xì)胞上打孔，同時，DNA在電場力的作用下進(jìn)入細(xì)胞，隨后細(xì)胞復(fù)蘇和彌合，從而實現(xiàn)質(zhì)粒DNA的物理轉(zhuǎn)移。為避免電擊時出現(xiàn)“擊穿”，即產(chǎn)生電流，細(xì)胞懸浮液中應(yīng)含有盡量少的導(dǎo)電離子。轉(zhuǎn)化效率為109?101°轉(zhuǎn)化子/網(wǎng)DNA。3.1.感受態(tài)細(xì)胞的制備（1） 感受態(tài)細(xì)胞及材料準(zhǔn)備同鈣轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備相同。（2） 選合適的大腸桿菌在4°C，3000rpm下離心10min，棄上清液（如需要，沉淀可在4°C的10%甘油中保存1?2天）。（3） 棄上清，離心管中加入少量ddHO，輕柔的懸浮沉淀后，再將水2注滿離心杯，4°C，3000rpm離心10min。（4）重復(fù)步驟（3）1次。（5）小心棄上清（沉淀可能會很松散），再往離心管中加入少量10%甘油（滅菌，預(yù)冷），重懸菌體，再加滿10%甘油，4笆，4000rpm離心10min。（6） 用10%甘油重懸浮細(xì)胞至最終體積為2?3ml，將細(xì)胞按200Ml等份裝入微量離心管，放置于一80°C下保存。（7） 按照鈣轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化效率和抗性檢測。3.2.電轉(zhuǎn)化為了降低離子濃度，待轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA，如質(zhì)?；蛎高B產(chǎn)物，在電轉(zhuǎn)化前應(yīng)該進(jìn)行純化（乙醇沉淀），以下所有步驟都需要保持無菌操作。（1） 從一80C冰箱中取出感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上解凍；加入待轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA，冰浴10min；同時將電轉(zhuǎn)化杯進(jìn)行冰浴。實際操作中，如果電轉(zhuǎn)化杯浸泡在乙醇中，可提前取出電轉(zhuǎn)化杯，在無菌的超凈臺上吹干。（2） 打開電轉(zhuǎn)儀，調(diào)至Manual，調(diào)節(jié)電壓為2.1KV。特別注意，不同的電轉(zhuǎn)化杯，所使用的電壓不同。防止電壓不夠，難以有效轉(zhuǎn)化，以及，電壓過高，擊爆電轉(zhuǎn)化杯，產(chǎn)生火花，產(chǎn)生危險。（3） 將冰浴后的感受態(tài)細(xì)胞（含DNA）轉(zhuǎn)移到電轉(zhuǎn)化杯中，輕輕敲擊電極杯使混合物均勻進(jìn)入電極杯的底部（注意：其體積以填充電轉(zhuǎn)化杯到電極之間空間即可，具體的用量可參見具體所使用的電轉(zhuǎn)化杯的說明）。

（4） 將電極杯推入電轉(zhuǎn)化儀中，按一下pulse鍵，聽到蜂鳴聲后，向電擊杯中迅速加入800Ml的LB液體培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞后，轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心管中。（5） 37°C，220~250rpm復(fù)蘇40min。（6） 按照鈣轉(zhuǎn)步驟進(jìn)行涂板培養(yǎng)?！倦姄舯逑戳鞒獭浚?） 用清水將電擊杯稍沖一下。（2） 向電擊杯中加入75%酒精浸泡2h。（3） 去酒精，再用蒸餾水沖洗2~3遍，然后用1ml的槍吸取超純水反復(fù)吹打電擊杯10遍以上。（4） 加入無水乙醇2ml于電擊杯中，浸泡30min。（5） 去無水乙醇，于通風(fēng)廚內(nèi)揮發(fā)干乙醇。（6） 將清洗好的電擊杯放入一20C冰箱內(nèi)待用?！咀⒁狻坎煌瑯悠肥褂玫碾娹D(zhuǎn)化杯應(yīng)分開；若長期不用，應(yīng)將清洗好的電轉(zhuǎn)化杯浸泡在乙醇中。高效感受態(tài)的制備一一方法、技術(shù)要點總結(jié)轉(zhuǎn)自螺旋講堂標(biāo)簽：講堂螺旋感受態(tài)要點制備2010-11-2416:10

大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備體外連接的DNA重組分子導(dǎo)入合適的受體細(xì)胞才能大量增殖。野生型E.coli并不容易轉(zhuǎn)化，這是由于細(xì)菌產(chǎn)生一種酶能迅速降解進(jìn)入的外源DNA。為了提高受體菌攝取外源DNA的能力，提高轉(zhuǎn)化效率以獲得更多的轉(zhuǎn)化子，人們摸索出不同的方法處理細(xì)菌，經(jīng)過多年的努力，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)了可以增加細(xì)胞吸收外源DNA效率的方法，那就是用化學(xué)方法處理細(xì)胞，使其改變膜對DNA的通透性。這種經(jīng)過理化方法誘導(dǎo)細(xì)胞，使其處于最適攝取和容納外來DNA的生理狀態(tài)，該細(xì)胞就稱為感受態(tài)細(xì)胞，即細(xì)胞處于能攝入核酸分子時的生理狀態(tài)。這種方法已經(jīng)成為基因工程的常規(guī)技術(shù)，它對于我們利用體外DNA重組技術(shù)來了解真核和原核生物的基因功能特別重要。細(xì)菌的轉(zhuǎn)化有兩種類型：一種是自然轉(zhuǎn)化(naturaltransformation)，在自然轉(zhuǎn)化中細(xì)菌可以自由地吸收DNA，通過它來進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化；另一種是工程轉(zhuǎn)化(engineeredtransformation)，在這種轉(zhuǎn)化中，細(xì)菌發(fā)生改變使得它們能攝入并轉(zhuǎn)化外源DNA。枯草桿菌中的轉(zhuǎn)化屬于自然轉(zhuǎn)化，E.coli轉(zhuǎn)化就屬于工程轉(zhuǎn)化。對于E.coli，目前主要采用電轉(zhuǎn)化法和CaCl2法將外源DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞中，并需要相應(yīng)地制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞和CaCl2感受態(tài)細(xì)胞。其中，電轉(zhuǎn)化法是利用瞬間高壓在細(xì)胞上打孔，因而需用冰冷的超純水多次洗滌處于對數(shù)生長前期的細(xì)胞，以使細(xì)胞懸浮液中應(yīng)含有盡量少的導(dǎo)電離子。其轉(zhuǎn)化效率為109?1010轉(zhuǎn)化子/pgDNA。而對于熱激法，是利用冰冷的CaCl2處理對數(shù)生長期的細(xì)胞，可以誘導(dǎo)其產(chǎn)生短暫的“感受態(tài)”，易于攝取外源DNA。轉(zhuǎn)化效率為106?107轉(zhuǎn)化子/pgDNA。一、CaCl2感受態(tài)細(xì)胞的制備CaCl2感受態(tài)細(xì)胞的制備實驗步驟1.前夜接種受體菌(DH5a或DH10B)，挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中37°C搖床培養(yǎng)過夜(約16小時)；取1ml過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于100mlLB培養(yǎng)基中，在37°C搖床上劇烈振蕩培養(yǎng)約2.5-3小時（250-300rpm）；3.將0.1MCaCl2溶液置于冰上預(yù)冷；以下步驟需在超凈工作臺和冰上操作4.吸取1.5ml培養(yǎng)好的菌液至1.5ml離心管中，在冰上冷卻10分鐘；5.4C下3000g冷凍離心5分鐘；6.棄去上清，加入100pl預(yù)冷0.1MCaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細(xì)胞重新懸浮，在冰放置20分鐘；7.4C下3000g冷凍離心5分鐘；棄去上清，加入100pl預(yù)冷0.1MCaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細(xì)胞重新懸浮；細(xì)胞懸浮液可立即用于轉(zhuǎn)化實驗或添加冷凍保護(hù)劑（15%-20%甘油）后超低溫冷凍貯存?zhèn)溆茫ㄒ?0C）。以上是基本步驟，基本同“分子克隆指南”，具體的體積（一次制作感受態(tài)細(xì)胞的量）由個人根據(jù)實際情況掌握，不一定要死守以上的體積，但要保持試劑、菌體等量的平衡。提高感受態(tài)效率的關(guān)鍵如下述 注意事項：克隆的新鮮程度，一定要選新鮮平板的單克隆，即剛涂布生長過夜的平板菌體的OD600值，JM109或BL21，OD值為0.35，DH5a為0.4，要盡量保證OD值不要過高，更不能超過0.6；低溫處理的時間，做完后冰上保存12到24h后分裝，并保存于一80C試劑和用品，非如果有可能，所有的用品（離心管、搖瓶等等）用新的，如果使用舊的，要確保干凈，CaCl2溶液要過濾除菌，不要高壓滅菌。二、電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞的制備1、 -80°C冰箱保存的菌種在SOB固體平板上劃單菌落；2、 次晨，挑選單克隆感至內(nèi)含1mlSOB液體培養(yǎng)基的試管中，37C,300rpm,6hr；3、 然后轉(zhuǎn)接到含400mlSOB液體培養(yǎng)基的2L搖瓶中（按1:500的量轉(zhuǎn)接），300rpm,4hr,然后每隔2min測一次OD600,至OD600=0.76；4、 立刻置冰水浴中驟冷，可以選擇在一個大的裝有冰水混合物的容器里快速旋轉(zhuǎn)搖動內(nèi)有培養(yǎng)物的三角瓶，盡快使培養(yǎng)物溫度降下來；5、 隨后在250ml預(yù)冷的離心杯中離心，4C，2000g，10min；6、 棄上清后，用預(yù)冷的水（滅菌的重蒸水）洗：先加少量水懸浮菌體（具體辦法：在一個大的裝有冰水混合物的容器里旋轉(zhuǎn)搖動離心杯使菌體懸?。w懸浮后再把水加滿，2200g，10min，棄上清；7、 再用10%的甘油同樣方法洗兩次，2400g，10min；8、 最后一次倒盡甘油后（盡量去干凈），用殘存在管底的甘油懸浮細(xì)胞，每120〃l分裝到1.5mLEp管（EP管要-70度預(yù)冷），用-70C的乙醇迅速冰凍；9、 保存在-80C冰箱中備用。以DH10B為例說明：步驟1：每次做感受態(tài)都要新鮮劃菌，不要使用保存于4C或室溫的平板；盡量使用原代菌，最好不要用多次傳代的菌；LB平板也可以，但效率可能會降低；SOB使用GIBCO公司的試劑配制，效果最好；但若電轉(zhuǎn)的連接子為一般性載體，使用普通的試劑配制培養(yǎng)基即可；步驟2：該步驟與步驟3中出現(xiàn)的數(shù)字存在相關(guān)性，條件允許的話盡量按照要求做，不允許的話則按照實驗室實際情況稍做修改，確保菌體生長良好；步驟3：確保OD達(dá)到要求，寧可低一點，也不要高一點，建議在達(dá)到0.5后過2-3min就測一次OD值;步驟4：一定要在冰水混合物中快速旋轉(zhuǎn)搖動內(nèi)有培養(yǎng)物的三角瓶，盡快使培養(yǎng)物溫度降下來，不要靜置于冰水混合物中，搖動大約10min;步驟5：建議使用離心杯，因為其底是平的，并且滅菌時里面要裝上雙蒸水利于步驟6,7與8中的懸浮操作;步驟6：懸浮菌體時不要使用移液槍，開始時加入的水量要少，避免過多，等菌體重懸起來以后再加滿。用手搖動時保證培養(yǎng)基液面低于冰面，重懸過程中注意懸浮的菌團(tuán)出現(xiàn)，需將其全部分散開;步驟7：同上步驟8：盡量倒盡甘油，使感受態(tài)更濃，每400ml培養(yǎng)物制備1-1.5mL感受態(tài)為益；關(guān)于EP管預(yù)冷與-70°C的乙醇迅速冰凍的具體辦法：在菌種保藏盒內(nèi)加入適量的乙醇，再把空的￡?管蓋上帽子后放入其中，置于-70度冰箱（或-80C冰箱）預(yù)冷，分裝感受態(tài)的時候?qū)⑵淙〕觯ㄟB帶保藏盒），在超凈臺分裝，分裝時使用滅菌并剪去尖頭的槍頭，盡量使用ml藍(lán)色大槍頭。完成后置于-80C冰箱;步驟9：關(guān)于保存感受態(tài)的溫度，-70C、-80C皆可，建議實驗室現(xiàn)有的溫度最低的冰箱;以上方法適用于很多E.coli菌株，例如：XL1-Blue，DH10B，DH5a，Top10，JM109，BL21等做電轉(zhuǎn)感受態(tài)，可能不同的菌株生長速度有差異，方案中的培養(yǎng)時間與最佳OD值可能有變化，不妨用此方案嘗試一下，如果效率不夠高的話可以對所用的菌株進(jìn)一步進(jìn)行優(yōu)化。注意：所用的搖瓶和離心管要洗的特別干凈，禁用任何洗滌劑，用NaOH溶液洗數(shù)次；2.重懸菌體用手振蕩，不用振蕩器;用槍吸打要輕，槍頭需要剪去尖頭;如果做的效果好，效率可以達(dá)到10*10以上。對于E.coli感受態(tài)制備，以上實驗方案都要特別注意：所有的容器要用新的，不用洗滌劑，用手洗且保證徹底干凈；相應(yīng)的器材要作為制備感受態(tài)細(xì)胞專用，不做其他用途；試劑要選用最好的，盡量過濾除菌，不用高壓滅菌等等。因為電轉(zhuǎn)化效率更高，對要求轉(zhuǎn)化率的實驗，建議采用電轉(zhuǎn)化的方法。下面奉送大家晶美公司和小木蟲總結(jié)的有關(guān)高效感受態(tài)制備的方法，供參考：附件1.晶美公司高效感受態(tài)細(xì)胞制作方法：版權(quán)歸晶美公司所有，僅供大家參考！方法一A液：1M，MnCl2：B液：1M，HEPES，pH=6.2-6.8，用無菌水配，配后不需滅菌；C液稱取CaCl20.10g，KCl1.18g，全部轉(zhuǎn)入細(xì)口試劑瓶，然后加入46ml三蒸水，輕輕振蕩使所有組分充分溶解。將瓶塞蓋上并用牛皮紙、棉線包扎，然后放入滅菌鍋121°C高壓滅菌備用。取1管B液（0.6ml），全部加入C液（46ml）中，混勻后，再用1ml移液器加入3.3mlA液，混勻冰浴即可使用。劃線得到單菌落,37C培養(yǎng)箱培養(yǎng)約17小時，挑取2-4個形態(tài)飽滿的單菌落接種于裝有100mlSOB培養(yǎng)基的三角瓶,37C劇烈振蕩（300rpms）培養(yǎng)3-4小時，將培養(yǎng)溫度調(diào)至18C劇烈振蕩（3280rpms）培養(yǎng)，其余與普通感受態(tài)差不多，每管加入4mlTB緩沖液，輕輕振蕩，使菌體重新懸浮，加入280mlDMSO（可用國產(chǎn)分析純），混勻后分裝入1.5mlEP管，冰上靜置15分鐘。用紗布將所有裝有感受態(tài)的EP管包好，用棉線系好后放入液氮中速凍，在液氮中靜置12小時以上。取出感受態(tài)放入-70'C超低溫冰箱備用。效率非常高，一般可到10*8，好時可到10*9，特別適宜于大片段與文庫構(gòu)建及珍貴材料的連接轉(zhuǎn)化。潔凈是最重要的。無菌都無所謂，在操作臺上可正常操作。離心力要注意不要超過2500g,建議1500-2000g5min。涂板要注意，不要覺得不勻而多次反復(fù)，輕輕在平板上帶一下感覺板上大部分地方走過即可，特別在冰箱中保存過或在溫箱中溫浴2小時以上的板。涂完后建議空氣晾干（20-30分鐘）這樣會減少衛(wèi)星菌落出現(xiàn)。預(yù)冷是必要的。整個過程的低溫也并非特別重要，只要注意就行了，我在去殘液時經(jīng)常在室溫倒置1min，對感受態(tài)效率提高有幫助，第一次多加一點緩沖液，我經(jīng)常加至20ml，效果不錯。關(guān)于大腸桿菌的感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化的方法很多，最復(fù)雜的莫過于電轉(zhuǎn)化，而最簡單的則是將LB平板上的菌落直接挑入裝有緩沖液的EP管冰箱即開始轉(zhuǎn)化。對于做克隆工作的人而言，高而穩(wěn)定的感受態(tài)可減輕不少麻煩?，F(xiàn)在大腸桿菌轉(zhuǎn)化效率最高的要數(shù)電轉(zhuǎn)化，可達(dá)到1010，但是操作起來比較麻煩。要想又簡單，又能有較高的轉(zhuǎn)化效率，最好的莫過于1990年《gene》上刊登的由InoueH.等提出的高效感受態(tài)的制備與轉(zhuǎn)化方法。根據(jù)實驗室的實際情況，我們將其稍作修改，做成了GLP文件，但其中仍有許多可改進(jìn)或需要注意的地方，其中有一些對普通感受態(tài)效率的提高也有一定的幫助。1、 所用器具的潔凈程度。這一點非常重要，是所有與感受態(tài)有關(guān)的方法與文章上必講的，毋庸置疑。2、 培養(yǎng)基的裝量：培養(yǎng)基的裝量是很重要的，這關(guān)系到菌體生長過程中的能量代謝問題，是有氧還是無氧生長。厭氧生長出來的菌體是做不出效率高的感受態(tài)的。建議裝量不要高于此值為：培養(yǎng)基體積/三角瓶容量=100ml/500ml，50ml/250ml。3、 培養(yǎng)基的pH值。這是講的pH值并非單指配置或滅菌后的pH值，而且還包括整個搖瓶結(jié)束后的pH值。一般來說，接種前的pH值在6.8-7.2，等菌搖好后，可以測一下pH值，不要低于6.0，最好在6.5以上。這表示菌體的代謝為有氧代謝，生長狀態(tài)良好，按要求做，肯定效率不低。4、 培養(yǎng)后的OD值。其實這并非一個非常重要的參數(shù)，只是當(dāng)OD值大到一定的程度后，菌體要保持對數(shù)生長已經(jīng)不太可能，因此很多指導(dǎo)方法上強(qiáng)調(diào)OD不得大于0.6,0.8等等。同時，OD值大時菌體總量大，因而感受態(tài)絕對數(shù)量要大一點，因而需要在OD值的兩方面影響中找一個平衡點。5、 培養(yǎng)基中的各種離子。經(jīng)驗證明，當(dāng)培養(yǎng)基中存在一定量的Mg2+離子時，該方法制得的感受態(tài)要相對較高。在制備普通感受時，使用20mMMgCl2做為培養(yǎng)基的添加物，在感受態(tài)收獲之前20-30分鐘加入，會收到很好的效果。6、 培養(yǎng)溫度。文獻(xiàn)及經(jīng)驗告訴我們，較低的溫度培養(yǎng)有利于感受態(tài)的形成，這樣可以獲得較高的感受態(tài)，但太低又不實用，因而產(chǎn)生了Inoue的高效感受態(tài)制備方法，它實際是利用了所有有利于感受態(tài)的文獻(xiàn)而得出的一個非常理想方法。7、 此外文獻(xiàn)報道，在保存感受態(tài)時，DMSO要比甘油的效果要好，它會使感受態(tài)的效率增加。8、 液氮速凍也會使感受態(tài)的效率提高，因此推薦用液氮速凍感受態(tài)，然后保存于超低溫冰箱內(nèi)。至于在液氮中保存12小時以后再轉(zhuǎn)入超低溫冰箱，這點未做實驗，只是一種感覺，第一次這樣做了，沒問題，以后就照此辦理而已。方法二液氮或低溫冰箱中取出的大腸桿菌*￡"。皿DH5,JM109,HB101等，在LB平板上劃線,37度過夜至長出單菌落.挑直徑1-3毫米的單菌落*可多個，接種到250毫升/3升錐形瓶或80毫升/1升錐形瓶的SOB培養(yǎng)基.培養(yǎng)基量不可再多,會影響效率.在18度150-250RPM培養(yǎng)19-50小時*沒有冷卻搖床的可在室溫，但不可高于37度.4.OD600約0.4-0.8時停止培養(yǎng)，放在冰水中冷卻10分鐘4度，300RPM離心15分鐘，回收菌體去掉上清后，用1/3體積的冰冷TB溶液懸浮，在冷10分鐘再次離心回收菌體用1/12.5體積的TB懸浮，添加最終濃度為7%的DMSO,再冷卻10分鐘9.0.1-1毫升分裝，直接在液氮中凍上.10.在液氮或-80度保存.附件2.小木蟲發(fā)布的高效感受態(tài)細(xì)胞的制作小木蟲網(wǎng)站所有，供大家參考。作者：noah方法一A液：1M，MnCl2：B液：1M，HEPES，pH=6.2-6.8，用無菌水配，配后不需滅菌；C液稱取CaCl20.10g，KCl1.18g，全部轉(zhuǎn)入細(xì)口試劑瓶，然后加入46ml三蒸水，輕輕振蕩使所有組分充分溶解。將瓶塞蓋上并用牛皮紙、棉線包扎，然后放入滅菌鍋121°C高壓滅菌備用。取1管B液(0.6ml)，全部加入C液(46ml)中，混勻后，再用1ml移液器加入3.3mlA液，混勻冰浴即可使用。劃線得到單菌落,37C培養(yǎng)箱培養(yǎng)約17小時，挑取2-4個形態(tài)飽滿的單菌落接種于裝有100mlSOB培養(yǎng)基的三角瓶,37C劇烈振蕩(300rpms)培養(yǎng)3-4小時，將培養(yǎng)溫度調(diào)至18C劇烈振蕩(3280rpms)培養(yǎng)，其余與普通感受態(tài)差不多，每管加入4mlTB緩沖液，輕輕振蕩，使菌體重新懸浮，加入280mlDMSO(可用國產(chǎn)分析純)，混勻后分裝入1.5mlEP管，冰上靜置15分鐘。用紗布將所有裝有感受態(tài)的EP管包好，用棉線系好后放入液氮中速凍，在液氮中靜置12小時以上。取出感受態(tài)放入-70'C超低溫冰箱備用。效率非常高，一般可到10*8，好時可到10*9，特別適宜于大片段與文庫構(gòu)建及珍貴材料的連接轉(zhuǎn)化。潔凈是最重要的。無菌都無所謂，在操作臺上可正常操作。離心力要注意不要超過2500g,建議1500-2000g5min。涂板要注意，不要覺得不勻而多次反復(fù)，輕輕在平板上帶一下感覺板上大部分地方走過即可，特別在冰箱中保存過或在溫箱中溫浴2小時以上的板。涂完后建議空氣晾干(20-30分鐘)這樣會減少衛(wèi)星菌落出現(xiàn)。預(yù)冷是必要的。整個過程的低溫也并非特別重要，只要注意就行了，我在去殘液時經(jīng)常在室溫倒置1min，對感受態(tài)效率提高有幫助，第一次多加一點緩沖液，我經(jīng)常加至20ml，效果不錯。關(guān)于大腸桿菌的感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化的方法很多，最復(fù)雜的莫過于電轉(zhuǎn)化，而最簡單的則是將LB平板上的菌落直接挑入裝有緩沖液的EP管冰箱即開始轉(zhuǎn)化。對于做克隆工作的人而言，高而穩(wěn)定的感受態(tài)可減輕不少麻煩。方法二液氮或低溫冰箱中取出的大腸桿菌*￡"0皿DH5,JM109,HB101等，在LB平板上劃線,37度過夜至長出單菌落.挑直徑1-3毫米的單菌落*可多個，接種到250毫升/3升錐形瓶或80毫升/1升錐形瓶的SOB培養(yǎng)基.培養(yǎng)基量不可再多,會影響效率.在18度150-250RPM培養(yǎng)19-50小時*沒有冷卻搖床的可在室溫，但不可高于37度.4.OD600約0.4-0.8時停止培養(yǎng)，放在冰水中冷卻10分鐘4度，300RPM離心15分鐘，回收菌體去掉上清后，用1/3體積的冰冷TB溶液懸浮，在冷10分鐘再次離心回收菌體用1/12.5體積的TB懸浮，添加最終濃度為7%的DMSO,再冷卻10分鐘9.0.1-1毫升分裝，直接在液氮中凍上.10.在液氮或-80度保存.方法三將置于液氮保存的大腸桿菌劃線在LB平板上，37°C培養(yǎng)活化。挑取經(jīng)活化的大腸桿菌單菌落于SOC液體培養(yǎng)基，18C，200-250rpm培養(yǎng)。當(dāng)OD600=0.5-0.8時，用預(yù)冷的40mL離心管于4C，8000rpm離心10min，收集菌體。用預(yù)冷的TBBuffer重懸菌體，4°C,8000rpm離心10min，收集菌體。重復(fù)第4步操作。用8mL預(yù)冷的TBBuffer重懸菌體，緩慢加入DMSO至終濃度7%。冰浴10min后，分裝保存于液氮中。本法效率極高，建議大家采納方法四單菌落 2mlLB37度120RPM過夜 1%轉(zhuǎn)接 37度200RPM2小時(OD到0.4~0.5)2ml,冰浴15min,4度，6000RPM5min,棄上清，懸浮于1ml0.1MCaCl2中，冰浴20min4度，6000RPM10min,重懸浮于200ul0.1MCaCl2中，冰浴30min建議用TSS法，簡單方便，比氯化鈣法的轉(zhuǎn)化效率高.別的菌可能不一定適用。方法五E.coli感受態(tài)細(xì)胞制備方法：單菌落平板至2mlLB,37C250r/m,1ml轉(zhuǎn)至50mlLB,37oC250r/m至A600=0.2-0.4離心后用10毫升TSS重懸后，分裝-70oC保存。盡量冰上操作.轉(zhuǎn)化：加質(zhì)粒(<5ul/100ulcell)后冰上30分鐘，42C90秒，冰上2分鐘，加LB至1ml,37C1小時后鋪抗生素平板。TSS：7.0mlpH6.1LB2.0ml50%PEG60000.5MLdmso0.2MLMg2+(0.1ml1mol/lMgCl2and0.1ml1mol/lMgSO4)0.3mlddH2O枯草芽抱桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化以枯草芽抱桿菌168(Bacillussubtilis168)為例枯草桿菌化學(xué)感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化方法準(zhǔn)備新鮮的168單克隆平板，取一滿環(huán)枯草芽抱桿菌甘油菌劃LB平板，37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h；轉(zhuǎn)化前一天晚間挑單菌落至3mlLB培養(yǎng)基中，37OC，250r/min培養(yǎng)過夜；第二天上午取160以l培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至8mlSPI培養(yǎng)基中，37OC，250r/min培養(yǎng)至對數(shù)生長末期(168約4-5h)；取0.2ml生長至對數(shù)期末的培養(yǎng)液至2mlSPII培養(yǎng)基中，37°C，100r/min培養(yǎng)90分鐘；在上述SPII培養(yǎng)基的菌體中加入20pl10mmol/LEGTA，再于37°C，100r/min培養(yǎng)10分鐘；將上述處理后的菌液分裝成0.5ml每管，各加入5plDNACDNA量不能過高，不超過5pg)，再于37°C，250r/min培養(yǎng)90分鐘，取菌液涂布篩選平板。相關(guān)試劑配方如下：SP鹽：0.2%(NH4)2SO4,1.4%K2HPO4,0.6%KH2PO4,0.02%MgSO4?7H2O,0.1%檸檬酸鈉;CAYE(100x)：2%Casaminoacid,10%酵母膏。SPI培養(yǎng)基：SP鹽溶液加入1%體積濃度為50%葡萄糖溶液，1%體積100XCAYE溶液；SPII培養(yǎng)基：SPI培養(yǎng)基加入1%體積50mmol/LCaCl2溶液，1%體積250mmol/LMgCl2溶液。入試劑SP—ASaltsSolution：(500mlSolution)TOC\o"1-5"\h\z0.4% (NH4)2SO4 2g2.8% K2HPO4-3H2O 14g1.2%KH2PO4 6g0.2% TrisodiumCitrateDihydrate 1g121°C滅菌20minSP—BSaltsSolution：(500mlSolution)0.04%MgSO4?7H2O 0.2g121C滅菌20min100XCAYESolution：(100mlSolution)2% Casaminoacid 2g10% YeastExtract 10g121C滅菌20minSPIMedium：(20mL)

9.8mLSP—ASaltsSolution9.8mLSP—ASaltsSolution9.8mL SP—BSaltsSolution200µL(1%V)Glucose(50%w/v,115°C滅菌20min)200µL(1%V)100XCAYESPIIMedium：(6mL)5.88mLSPIMedium60µL(1%V)50mMCaCl260µL(1%V)250mMMgCl2100XEGTASolution：10mmol/LEGTA溶液，溶解時需加少量NaOH至pH8.0注意:注意儀器用品的干凈和無菌；8mlSPI培養(yǎng)基要放于50ml離心管中培養(yǎng)，以保證菌體的生長狀態(tài)，不要使用玻璃試管；注意測定OD值，一定要等菌體生長至對數(shù)期后期；保證菌體的濃度，可以提高轉(zhuǎn)化率。感受態(tài)制備關(guān)鍵點甘油的質(zhì)量，水的質(zhì)量，最好是miniQ的，如果要求完美，洗瓶不要有洗滌劑殘留，先將瓶裝滿miniQ水高壓，再棄去，再配置10%甘油。收菌以半對數(shù)期合適，一般OD0.5收菌，過則不佳，直接取-80度菌種搖，次日轉(zhuǎn)種，從盤上菌落搖的要差，33-34C搖菌結(jié)果更理想。在以冰冷10%甘油等量，半量，1/4量洗滌時一定低溫，重懸時應(yīng)輕震蕩，棄洗滌液應(yīng)倒干靜，那怕?lián)p掉部分細(xì)菌。最后大概500ml能做3-4ml感受態(tài)，液氮中凍10min轉(zhuǎn)-80度冰箱，快一點，免的EP管爆了，也可不冷凍，直接用來轉(zhuǎn)化。感受態(tài)應(yīng)以標(biāo)準(zhǔn)濃度質(zhì)粒電轉(zhuǎn)記算效率，一般大于109/mg，操做以1ng/ul質(zhì)粒1ul加40ul感受態(tài)置0.1杯，電轉(zhuǎn)后以最快的速度加入1mlSOC復(fù)活，100-150轉(zhuǎn)搖1hl，取1/1000鋪盤應(yīng)大于1000個菌生長。這樣用于建庫工作才行。電轉(zhuǎn)時質(zhì)粒或連接物盡可能少，以減少離子，實際上離子高，電流直接通過，沒有場強(qiáng)，質(zhì)粒是進(jìn)不去的。注：任和有關(guān)東西都要干凈，保證沒有離子，從接觸甘油開始就保持恒溫，0°C，電擊后復(fù)活要快。關(guān)于載體連接的討論相信凡是做過分子生物學(xué)的人應(yīng)該都對載體構(gòu)建有所了解，而載體構(gòu)建中基因片段同載體的連接是一個關(guān)鍵所在，現(xiàn)就同載體連接相關(guān)內(nèi)容討論如下：連接的反應(yīng)溫度：DNA連接酶的最適反應(yīng)溫度為37C，但在此溫度下，分子布朗運動速度過快，連接后末端的氫鍵結(jié)合變的很不穩(wěn)定，致使剛連接后的片段又大量的解離，所以連接反應(yīng)不能在過高的溫度中進(jìn)行；但是，隨著溫度的降低，連接酶的活性降低，故為保證連接的效率，采取折衷方法是16C過夜，這樣能夠保證獲得最佳的連接效果。當(dāng)然，也不是所有的連接反應(yīng)都是在16C下最好，也可以采用12C過夜，或者37C下反應(yīng)30min然后4C過夜等等，這需要根據(jù)實際情況調(diào)整；限制性內(nèi)切酶在反應(yīng)中是不需要外部提供能量的，但是T4DNA連接酶需要在外部提供能量的情況下才能完成連接反應(yīng)，因此，能量ATP的充分供給將是連接反應(yīng)成敗的另一關(guān)鍵因素。對于商業(yè)化的DNA連接酶來說，一般ATP都是在提供緩沖buffer中的，而ATP是不穩(wěn)定的，隨著時間的延長，ATP會大量的消耗，為了解決能量即ATP的問題，建議對于難以連接的片段，不妨采用下面的方法試試：先以正常的體系連接（10pl體系中含川l酶、1pbuffer、片段、載體）（16C）連接4-6h，然后在該體系中再加入川lbuffer以提供充足的ATP，而此時可以不用考慮反應(yīng)體系中鹽離子濃度等，因為此時能量是更為重要的問題。當(dāng)然，連接反應(yīng)還有其他許多因素，比如載體和片段的比例、片段末端形態(tài)等等這些都在此暫不討論，只提供以上兩點供參考。個人見解，僅供參考！請廣大螺友斧正，并歡迎大家提出意見和見解！聯(lián)系方式：Email:lofeel@126.comhelixnet@126.comQQ:546738635Helixnet官方2群：40598077Helixnet官方3群：17011788Lofeel2008.3.25大腸桿菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化方法來源：小木蟲論壇2006-11-2123:33:00訪問量：8229評論（0）分享這都是我?guī)啄陙斫?jīng)驗總結(jié)啊，覺得有用一定要頂大腸桿菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞制備第一天：將適合菌株（如XL1-Blue,DH5a）置于LB或其他營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基上，在37°C下過夜培養(yǎng)高溫滅菌大的離心瓶（250-500ml）以備第二天搖瓶用準(zhǔn)備幾瓶滅菌水（總量約1.5升），保存于冷凍室中以備第二天重懸浮細(xì)胞用第二天：轉(zhuǎn)移0.2-1ml過夜培養(yǎng)物至裝有500mlLB（或其他營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基）的1-2升擋板2恐？37°C下劇烈振蕩培養(yǎng)2-6小時定時監(jiān)控O.D.600值（培養(yǎng)1小時后每半小時測定一次）當(dāng)O.D.600值達(dá)到0.5-1.0時，從搖床中取出搖瓶，置于冰上冷卻至少15分鐘（需要的話這種方式可以存放培養(yǎng)液數(shù)小時）細(xì)胞在4°C5000g下離心15分鐘，棄上清液（如需要，沉淀可在4°C的10%甘油中保存一兩天）用滅菌的冰水重懸浮細(xì)胞。先用渦旋儀或吸液管重懸浮細(xì)胞于少量體積中（幾毫升），然后加水稀釋至離心管的2/3體積。照上面步驟重復(fù)離心，小心棄去上清液照上面步驟用滅菌的冰水重懸浮細(xì)胞離心，棄上清液用20ml滅菌的、冰冷后的10%甘油重懸浮細(xì)胞14.照上面步驟離心，小心棄去上清液（沉淀可能會很松散）用10%甘油重懸浮細(xì)胞至最終體積為2-3ml將細(xì)胞按1505等份裝入微量離心管，于-80°C保存轉(zhuǎn)化方法：在冰上解凍電感受態(tài)細(xì)胞添加1-10』DNA，冰上培育約5分鐘添加1-3』DNA，冰上培育約5分鐘轉(zhuǎn)移DNA/細(xì)胞混合物至冷卻后的2mm電穿孔容器（無泡）中加載P1000，準(zhǔn)備好300|jlLB或2xYT對電穿孔容器進(jìn)行脈沖（200歐姆，25”d,2.5千伏）（檢查時間常數(shù)，應(yīng)該在3以上）立即添加300pl的LB或2xYT至電穿孔容器中37°C下培養(yǎng)細(xì)胞40分鐘至1小時以復(fù)原轉(zhuǎn)移細(xì)胞至適當(dāng)?shù)倪x擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)方法一［試劑準(zhǔn)備］A液：1M,MnCl2：B液：1M,HEPES,pH=6.2-6.8，用無菌水配，配后不需滅菌；C液稱取CaCl20.10g，KCl1.18g，全部轉(zhuǎn)入細(xì)口試劑瓶，然后加入46ml三蒸水，輕輕振蕩使所有組分充分溶解。將瓶塞蓋上并用牛皮紙、棉線包扎，然后放入滅菌鍋121°C高壓滅菌備用。［操作方法］取1管B液(0.6ml)，全部加入C液(46ml)中，混勻后，再用1ml移液器加入3.3mlA液，混勻冰浴即可使用。劃線得到單菌落，37C培養(yǎng)箱培養(yǎng)約17小時，挑取2-4個形態(tài)飽滿的單菌落接種于裝有100mlSOB培養(yǎng)基的三角瓶，37