葛根素對糖尿病大鼠腎小球基質(zhì)金屬蛋白酶10、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑1表達(dá)的影響

糖尿病屬于中醫(yī)口渴范疇，葛根是治療糖尿病的傳統(tǒng)中醫(yī)藥。葛根素是葛根的一個重要成分,具有降血糖、改善微循環(huán)及凝血纖溶系統(tǒng)活性、調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞舒縮功能的作用。糖尿病腎病(diabeticnephropathy,DN)是糖尿病常見的微血管并發(fā)癥,本實驗試用葛根素對糖尿病大鼠模型進(jìn)行干預(yù),研究葛根素對DN的發(fā)生、發(fā)展的影響,為擴(kuò)大該藥的臨床應(yīng)用范圍提供理論依據(jù),并通過觀察用藥組腎組織基質(zhì)金屬蛋白酶10(MMP-10)、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑1(TIMP-1)、Ⅳ型膠原、層黏連蛋白(LN)表達(dá)的變化探討其對DN可能的作用機(jī)制。1材料表面1.1動物Wistar雄性大鼠,由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。1.2藥代動力學(xué)藥物原位雜交和免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司,其中試劑包括:MMP-10、TIMP-1探針(美國Sigma公司)、兔抗MMP-10、TIMP-1、LN多克隆抗體,鼠抗Ⅳ型膠原單克隆抗體(SantaCruz公司),鏈脲佐菌素(Sigma公司),麥普寧注射用葛根素(山東瑞陽制藥有限公司,主要成分為葛根素,純度98%,100mg/支,國藥準(zhǔn)字X20010181)。2方法2.1糖尿病模型的建立按Anderson等建立的方法,選取體重150~180gWistar雄性大鼠30只,戊巴比妥鈉ip麻醉(40mg/kg)后行右腎切除術(shù),2周后切口完全愈合。將大鼠隨機(jī)分為5組:右腎切除對照組,糖尿病模型組,葛根素低、中、高劑量組,每組6只。除右腎切除對照組ip等體積枸櫞酸緩沖液外,其余各組大鼠按65mg/kgip鏈脲佐菌素(溶于0.1mol/L枸櫞酸緩沖液pH4.5),48h后尾尖取血測定血糖,取尿液測定尿糖,血糖≥16.7mol/L,尿糖+++~++++者確定為糖尿病模型。實驗期間動物自由進(jìn)食飲水,不使用胰島素及其他降糖藥物,模型成立3d后,葛根素各組每日分別ip麥普寧注射用葛根素40,80,160mg/kg,對照組及糖尿病模型組ip等量生理鹽水。2.2血糖、血責(zé)任、尿素氮檢測糖尿病模型建成后16周時分別用代謝鼠籠收集24h尿液,用于尿蛋白(Upro)、尿肌酐(Ucr)測定;用10%水合氯醛ip麻醉,腹主動脈取血,分離血清測定血糖(Glu)、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN);切除左腎,去掉被膜,濾紙吸干血跡后稱質(zhì)量,部分置于4%多聚甲醛固定留做光鏡、原位雜交、免疫組化檢測,部分置于70%乙醇固定后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測。2.3正常光度檢查腎組織經(jīng)4%多聚甲醛固定后,常規(guī)脫水、包埋,切片厚2μm,分別行HE和PAS染色。2.4肌肉注射和氨甲基清除率ccrGlu,Scr,Upro,Ucr,BUN均用日立7170全自動生化分析儀測定,并根據(jù)Ucr,Scr計算肌酐清除率(Ccr)。2.5雜交前切片的制備組織切片常規(guī)脫蠟水化,經(jīng)3%H2O2、胃蛋白酶(1μg/mL)消化及預(yù)雜交液處理后滴加含MMP-10或TIMP-1探針的雜交液42℃雜交過夜,經(jīng)梯度SSC37℃嚴(yán)格沖洗,地高辛抗體孵育和DAB顯色,雜交前切片用預(yù)雜交液代替探針雜交液做陰性對照。2.6免疫藥物的檢測免疫組化染色:切片常規(guī)脫蠟至水,一抗為兔抗鼠MMP-10,TIMP-1,LN多克隆抗體或鼠抗Ⅳ型膠原單克隆抗體(1∶100),二抗為生物素化IgG(1∶100),以PBS代替一抗作為陰性對照,DAB顯色,光鏡觀察陽性信號。2.7流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞中mmp-10和timp-1MMP-10,TIMP-1蛋白表達(dá):標(biāo)本用網(wǎng)搓法制備單細(xì)胞懸液,采用間接免疫熒光標(biāo)記法,在細(xì)胞懸液中分別加入1∶100稀釋的兔抗MMP-10或TIMP-1多克隆抗體,37℃溫浴30min后洗滌,加入1∶50羊抗兔FITC-IgG,溫浴洗滌后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(美國BD公司,FACS420),測量的數(shù)據(jù)輸入計算機(jī),應(yīng)用相應(yīng)的程序進(jìn)行資料處理,測定前以雞紅細(xì)胞作為標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞樣品調(diào)整儀器的RSD值在5%以內(nèi)。2.8實驗結(jié)果的統(tǒng)計原位雜交和免疫組化結(jié)果均應(yīng)用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng),分別測量出每個腎小球中LN,Ⅳ型膠原,MMP-10,TIMP-1mRNA的著色陽性面積、積分吸光度和腎小球面積,以前兩個參數(shù)與腎小球面積比表示該成分的相對含量和表達(dá)強(qiáng)度。每組分析6個標(biāo)本,每個標(biāo)本切片取10個完整的腎小球進(jìn)行分析,取均值代表一只大鼠某種成分在腎小球中的相對含量和表達(dá)強(qiáng)度。流式細(xì)胞術(shù)MMP-10,TIMP-1表達(dá)的定量分析:按照Morkve等的方法,以熒光指數(shù)(FI)表示MMP-10,TIMP-1的相對含量。實驗結(jié)果統(tǒng)計采用F檢驗,應(yīng)用SAS統(tǒng)計軟件完成。FΙ=樣品平均熒光強(qiáng)度-對照樣品平均熒光強(qiáng)度正常組織平均熒光強(qiáng)度-對照樣品平均熒光強(qiáng)度3結(jié)果3.1對大鼠體重、基肥指數(shù)的影響(肥大指數(shù))變化:16周時糖尿病模型組與對照組相比,體重下降而腎質(zhì)量變化不明顯,肥大指數(shù)增加(P<0.01),葛根素各組與糖尿病模型組相比,體重增高,肥大指數(shù)降低,尤以高劑量組明顯(P<0.01),見表1。與糖尿病模型組比較:##P<0.01**P<0.01vscontrolgroup##P<0.01vsdiabeticmodelgroup3.2各組大鼠糖尿病模型16周時糖尿病模型組與對照組相比,Glu,BUN,Ccr,Upro顯著增高(P<0.05,0.01),葛根素各組與糖尿病模型組相比各項指標(biāo)明顯改善(P<0.05,0.01),見表2。3.3一般社會學(xué)的變化糖尿病模型組大鼠較對照組腎小球增大,系膜基質(zhì)增多,葛根素組較糖尿病模型組有不同程度改善。3.4timp-1mrna的相對含量及積分吸光度變化主要表達(dá)在腎小球系膜細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)。糖尿病模型組腎小球內(nèi)MMP-10,TIMP-1mRNA相對含量及積分吸光度均增強(qiáng),與對照組相比差異均有顯著性(P<0.01);葛根素各組MMP-10,TIMP-1mRNA的表達(dá)與糖尿病模型組相比均有不同程度的降低,尤以高劑量組降低明顯(P<0.01,0.05),見表3。3.5timp-1和p-10在糖尿病大鼠糖尿病模型中表達(dá)情況免疫組化染色顯示陽性顆粒主要定位于腎小球和腎小管,對照組腎小球和腎小管MMP-10和TIMP-1有弱表達(dá),糖尿病模型組表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.01)。流式細(xì)胞術(shù)顯示糖尿病模型組MMP-10和TIMP-1相對含量較對照組明顯增強(qiáng),而葛根素各組與糖尿病模型組相比,表達(dá)有不同程度的減弱,見表4。3.6糖尿病模型組腎中型膠原、ln的變化腎小球中表達(dá):Ⅳ型膠原、LN陽性染色在腎小球主要分布于系膜區(qū)、毛細(xì)血管基膜、腎小球囊壁和腎小管基膜、腎間質(zhì)中。與對照組相比,糖尿病模型組腎小球中Ⅳ型膠原、LN明顯增強(qiáng);葛根素各組較糖尿病模型組表達(dá)減弱,見表5。4糖尿病并發(fā)癥之糖質(zhì)蛋白及金屬基質(zhì)降解酶系統(tǒng)timp-10本實驗研究證明糖尿病模型大鼠在注射鏈脲佐菌素16周后BUN,Ccr,Upro及肥大指數(shù)均明顯高與糖尿病模型組比較:#P<0.05##P<0.01**P<0.01vscontrolgroup;#P<0.05##P<0.01vsdiabeticmodelgroup于正常對照組,提示已有DN發(fā)生。葛根素用藥組上述各項指標(biāo)均有不同程度改善,說明葛根素對糖尿病大鼠腎結(jié)構(gòu)和功能具有保護(hù)作用。本實驗驗證,葛根素具有明顯的降血糖作用,血糖水平下降可通過減輕糖尿病時出現(xiàn)的“三高”現(xiàn)象(高灌注壓、高流量和高濾過),從而影響腎病的發(fā)生、發(fā)展。葛根素是否直接作用于糖尿病大鼠的腎臟特別是腎小球血管而影響腎病的發(fā)生、發(fā)展,有待進(jìn)一步研究。DN是糖尿病微血管并發(fā)癥之一,腎小球細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM)沉積是其主要的病理改變,ECM主要由Ⅳ型膠原、LN、Fi-bronection等組成,其生理狀態(tài)下處于快速更新代謝的動態(tài)平衡過程中,該過程的失衡是導(dǎo)致腎小球組織結(jié)構(gòu)破壞乃至腎小球硬化的關(guān)鍵性病理過程?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinase,MMPs)家族是腎臟內(nèi)主要的基質(zhì)降解酶體系,其表達(dá)量與活性的高低直接影響腎小球細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)量和局部沉積。MMP-10屬于MMPs家族,它以酶原的形式釋放,由纖溶酶激活,激活后其降解基質(zhì)的活性還會受到基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑的調(diào)節(jié)。TIMPs與活化的MMPs有高度的親和性。每種TIMP都能在一定程度上結(jié)合和抑制MMPs。MMP-10可以降解基質(zhì)從而引起腫瘤轉(zhuǎn)移和浸潤。Saghizadeh等應(yīng)用RT-PCR等方法研究糖尿病視網(wǎng)膜病變角膜中MMP-10表達(dá),表明糖尿病患者其mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng),而其3種組織抑制劑未見明顯改變。有關(guān)MMP-10在糖尿病腎臟中的表達(dá)及作用,國內(nèi)外尚未見報道。本研究表明:糖尿病腎組織MMP-10,TIMP-1mRNA及蛋白表達(dá)增加。注射用葛根素由野葛根的提取物制成,其主要成分是葡萄糖基異黃酮,是醛糖還原酶的抑制劑,國內(nèi)近來研究表明,黃酮類藥物具有降低糖尿病病人蛋白尿的作用。本實驗葛根素用藥組大鼠在血糖降低、蛋白尿減輕、腎功能改善的同時,腎小球MMP-10和TIMP-1表達(dá)明顯下調(diào),腎小球細(xì)胞外基質(zhì)沉積明顯減輕,提示葛根素有可能通過調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶及其組織抑制劑的表達(dá)影響腎小球細(xì)胞外基質(zhì)的質(zhì)和量,