生物工程中游技術(shù)綜合實(shí)驗(yàn)杜鵑花的組織培養(yǎng)——探究并比較不同部位誘導(dǎo)愈傷組織的生長(zhǎng)情況學(xué)院：生命科學(xué)學(xué)院專業(yè)：生物工程摘要：實(shí)驗(yàn)選取杜鵑花的莖尖、莖段、葉片為外植體,;利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，探究杜鵑花不同部位誘導(dǎo)愈傷組織的生長(zhǎng)情況，并比較不同的植物生長(zhǎng)素對(duì)杜鵑花愈傷組織誘導(dǎo)分化影響的差異。關(guān)鍵詞:杜鵑組織培養(yǎng)愈傷組織1前言杜鵑花，杜鵑花科，杜鵑花屬，為十大名花之一，又稱“花中西施”，別名為：映山紅、山石榴、山鵑等，屬于常葉或落葉灌木。杜鵑花主要分布在歐洲、亞洲和北美洲，但以亞洲最多，杜鵑花喜冷涼、濕潤、通風(fēng)良好的環(huán)境。杜鵑花的作用很多，其除了可作觀賞用外，還有一定的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，如有的葉花可入藥或提取芳香油，有的花可食用，高山杜鵑花根系發(fā)達(dá)，是很好的水土保持植物。除此之外，杜鵑花還具有多種有用功能，如降壓、利尿、陣痛、鎮(zhèn)咳，其還具有抗菌、抗炎作用，還對(duì)心血管系統(tǒng)、痔瘡有影響。在2004年閆鳳霞等探究杜鵑花的組培繁殖時(shí)發(fā)現(xiàn)，在相同培養(yǎng)基下，莖尖、嫩葉誘導(dǎo)形成不定芽產(chǎn)生再生植株的效果較好；在2003年王荃的杜鵑花組織培養(yǎng)技術(shù)研究中發(fā)現(xiàn)，愈傷組織的最適外植體是嫩葉，并研究了杜鵑花在不同培養(yǎng)基條件下的生長(zhǎng)情況。通過研究者對(duì)杜鵑花組織培養(yǎng)的研究，杜鵑花已克服地域限制，進(jìn)入快速繁殖的階段。杜鵑花通常采用扦插、嫁接繁殖，但名貴品種難以生根，同樣受季節(jié)、母株材料等限制，不宜進(jìn)行大量的商業(yè)化生產(chǎn)。隨著組培技術(shù)的發(fā)展，杜鵑花的試管繁殖已成為可能，木本植物培養(yǎng)基(WPM)和新的改良MS培養(yǎng)基的研制，對(duì)培養(yǎng)杜鵑花科植物非常有效，國內(nèi)國外對(duì)杜鵑花的組織培養(yǎng)進(jìn)行了研究，取得了一定進(jìn)展。杜鵑花的組織培養(yǎng)一般取莖尖或帶有側(cè)芽的嫩莖作為外植體，這樣可直接得到大量的叢生芽，進(jìn)而得到小植株。國內(nèi)外通過對(duì)杜鵑花組織培養(yǎng)近幾十年的研究，已經(jīng)初步建立了一套杜鵑組織培養(yǎng)的快繁體系，但是杜鵑花種和品種間的差別、叢生芽和不定芽分化率低、優(yōu)良品種生根困難、完整植株的移栽體系等問題，仍是杜鵑花組織培養(yǎng)中急需解決的問題。2材料和方法2.1材料2.11外植體杜鵑花的莖尖、莖段、嫩葉2.1.2培養(yǎng)基配方一：MS+6-BA3+NAA0.05+3%蔗糖+8g瓊脂（1L，pH=5.8）配方二：MS+6-BA1.5+NAA0.05+3%蔗糖+8g瓊脂（1L，pH=5.8）2.1.3試劑蔗糖、瓊脂、培養(yǎng)基母液（大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)附加物）2.1.4儀器設(shè)備高壓滅菌鍋、分析天平、果醬瓶、燒杯、量筒、培養(yǎng)皿、滅菌的濾紙、稱量紙、玻璃棒、電爐、石棉網(wǎng)、移液瓶，剪刀，鑷子，解剖刀、酒精燈、記號(hào)筆、標(biāo)簽紙、藥匙等。2.2方法2.2.1配制培養(yǎng)基計(jì)算：計(jì)算500mL培養(yǎng)基所需MS母液的吸取體積配制500mL培養(yǎng)基的母液用量移液與溶化：取50mL小燒杯一只，用移液管按照上表分別吸取各母液裝入該燒杯中。取100mL燒杯，先用量筒量取100mL蒸餾水倒入燒杯中，用記號(hào)筆畫好液位線，再將一半蒸餾水倒出。將剩下的蒸餾水全都倒入電爐中，待水沸騰后，再把稱量好的瓊脂、蔗糖、酵母提取物、活性炭依次加入，充分溶解后，再加入母液混合液，用蒸餾水沖洗盛過母液的燒杯三次，一并倒入電爐中。加熱至沸騰后。將溶液倒入100mL燒杯中，沖洗電爐3次，加蒸餾水定容至設(shè)定的液位線。調(diào)節(jié)PH：用酸度計(jì)測(cè)定PH，用1mol/LHCl或1mol/LNaOH溶液將培養(yǎng)基PH調(diào)節(jié)至.4分裝：將溶化的培養(yǎng)基趁熱分裝于果醬瓶中，每瓶30mL，隨即封口。每種培養(yǎng)基裝3瓶果醬瓶。用記號(hào)筆注明培養(yǎng)基代號(hào)、日期、第幾組。2.2.2培養(yǎng)基及實(shí)驗(yàn)用具滅菌將分裝好的培養(yǎng)基及其他用報(bào)紙包好的實(shí)驗(yàn)用具（剪刀、鑷子、解剖刀、裝有濾紙的培養(yǎng)皿）及3瓶蒸餾水，置于121℃高壓滅菌鍋中滅菌。時(shí)間為15～20min。2.2.3外植體的選擇選取莖尖、莖段和嫩葉作為外植體。2.2.4外植體表面消毒將杜鵑花的莖尖、莖段和嫩葉用洗衣粉清洗干凈，在清水下沖洗15min，然后在無菌條件下用75%酒精消毒15-30s，無菌水沖洗一次，再用0.1%HgCl2消毒5-8min，無菌水沖洗三次。2.2.5接種在酒精燈上方，打開培養(yǎng)瓶口，把鑷子和瓶口在火焰上灼燒一會(huì)，待鑷子稍冷卻后，夾取消毒后的外植體放入瓶中，使其與培養(yǎng)基充分接觸，培養(yǎng)瓶口還要在酒精燈上灼燒一下，然后迅速蓋上瓶蓋。2.2.6培養(yǎng)與觀察把接種完畢的培養(yǎng)瓶放在25℃的培養(yǎng)箱，光照培養(yǎng)。每周一次生長(zhǎng)情況和污染情況記錄,并對(duì)比：A、對(duì)比不同配方同種部位的生長(zhǎng)情況B、對(duì)比不同部位同種配方的生長(zhǎng)情況3結(jié)果與分析3.1杜鵑花不同部位培養(yǎng)的污染情況3月27日在無菌實(shí)驗(yàn)室對(duì)杜鵑花不同部位進(jìn)行接種培養(yǎng)，本次實(shí)驗(yàn)有兩種培養(yǎng)配方，每種配方接種不同部位的外植體6-7瓶，每瓶接種2-3個(gè)外植體。其中污染率（%）=（污染的材料數(shù)/總接種材料數(shù)）×100誘導(dǎo)率（%）=（形成愈傷組織的材料數(shù)/總接種材料數(shù)）×100分析：從表一中可知，莖段的污染率較高，其次是嫩葉，莖尖的污染率相對(duì)前面兩種外植體較低，從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)知，污染的主要微生物是細(xì)菌，主要原因是在接種時(shí)操作技術(shù)不規(guī)范造成的污染，原因可能是：①接種過程中，沒有及時(shí)對(duì)接種工具進(jìn)行滅菌，應(yīng)該每使用一段時(shí)間后沾乙醇灼燒一下滅菌；②接種時(shí)在講話、打噴嚏也會(huì)造成材料及培養(yǎng)基的污染；③在接種時(shí)，手臂從培養(yǎng)基、無菌材料、無菌濾紙的上方經(jīng)過，造成了污染；④在打開瓶蓋時(shí)，沒有灼燒一下瓶口，或者接種結(jié)束后沒有灼燒瓶口再蓋瓶蓋，使瓶口上沾有微生物；⑤在接種時(shí)遠(yuǎn)離酒精燈火焰，使得空氣中的微生物進(jìn)入瓶中或者污染外植體。部分外植體被真菌污染是因?yàn)椴牧媳旧硎菐Ь?，在接種之前沒有對(duì)外植體清毒徹底。有些外植體是后期污染的，原因是手接觸的瓶口，使得手中的微生物通過瓶口進(jìn)入瓶中，造成材料或者培養(yǎng)基的污染。3.2杜鵑花不同部位在不同培養(yǎng)基下誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)情況時(shí)間實(shí)驗(yàn)材料培養(yǎng)基配方接種數(shù)愈傷組織數(shù)愈傷組織誘導(dǎo)率實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象第二周嫩葉配方Ⅰ180010個(gè)發(fā)生褐變，其他無明顯變化配方Ⅱ12004個(gè)發(fā)生褐變，其他無明顯變化莖段配方Ⅰ18004個(gè)已長(zhǎng)出嫩葉，但4個(gè)莖段發(fā)生褐變配方Ⅱ14007個(gè)發(fā)生褐變，5個(gè)長(zhǎng)出嫩葉莖尖配方Ⅰ14005個(gè)發(fā)生褐變，其他無明顯變化配方Ⅱ15003個(gè)發(fā)生褐變，其他無明顯變化第四周嫩葉配方Ⅰ180011個(gè)發(fā)生褐變，5個(gè)嫩葉凸起配方Ⅱ1218%8個(gè)發(fā)生褐變，一個(gè)嫩葉長(zhǎng)出淺綠色愈傷組織莖段配方Ⅰ18008個(gè)莖段發(fā)生褐變，3個(gè)長(zhǎng)出嫩葉配方Ⅱ14006個(gè)莖段發(fā)生褐變，4個(gè)長(zhǎng)出嫩葉莖尖配方Ⅰ14214%5個(gè)發(fā)生褐變，2個(gè)長(zhǎng)出淺黃色愈傷組織，7個(gè)長(zhǎng)出嫩葉配方Ⅱ15004個(gè)發(fā)生褐變，5個(gè)長(zhǎng)出嫩葉第六周嫩葉配方Ⅰ1816%12個(gè)發(fā)生褐變，1個(gè)長(zhǎng)出淺綠色的愈傷組織配方Ⅱ12217%8個(gè)發(fā)生褐變，2個(gè)嫩葉長(zhǎng)出淺綠色愈傷組織莖段配方Ⅰ1800部分莖段褐變死亡，部分被污染配方Ⅱ1400部分莖段褐變死亡，部分被污染莖尖配方Ⅰ14214%5個(gè)發(fā)生褐變，2個(gè)長(zhǎng)出淺黃色愈傷組織，5個(gè)長(zhǎng)出嫩葉配方Ⅱ153204個(gè)發(fā)生褐變，5個(gè)長(zhǎng)出嫩葉,3個(gè)長(zhǎng)出松散，呈淺黃色的愈傷組織，第八周嫩葉配方Ⅰ18211%12個(gè)發(fā)生褐變，1個(gè)長(zhǎng)出淺綠色的愈傷組織，5個(gè)凸起配方Ⅱ12217%8個(gè)發(fā)生褐變，2個(gè)嫩葉長(zhǎng)出淺綠色愈傷組織莖段配方Ⅰ1800部分莖段褐變死亡，部分被污染配方Ⅱ1400部分莖段褐變死亡，部分被污染莖尖配方Ⅰ14321%5個(gè)發(fā)生褐變，3個(gè)長(zhǎng)出淺黃色愈傷組織，7個(gè)長(zhǎng)出嫩葉配方Ⅱ15640%,5個(gè)發(fā)生褐變，5個(gè)長(zhǎng)出嫩葉，6個(gè)長(zhǎng)出淺黃色愈傷組織，且松散實(shí)驗(yàn)原始圖片如下：圖2配方二莖尖前期的生長(zhǎng)情況圖1配方一莖尖前期的生長(zhǎng)情況圖2配方二莖尖前期的生長(zhǎng)情況圖1配方一莖尖前期的生長(zhǎng)情況圖3配方二嫩葉前期的生長(zhǎng)情況

圖3配方二嫩葉前期的生長(zhǎng)情況圖4配方一莖尖誘導(dǎo)愈傷組織的生長(zhǎng)情況圖4配方一莖尖誘導(dǎo)愈傷組織的生長(zhǎng)情況圖6配方二莖尖誘導(dǎo)愈傷組織的生長(zhǎng)情況圖圖6配方二莖尖誘導(dǎo)愈傷組織的生長(zhǎng)情況圖5配方一莖尖誘導(dǎo)愈傷組織的生長(zhǎng)情況圖7配方二莖尖誘導(dǎo)愈傷組織的生長(zhǎng)情況圖8配方一莖尖誘導(dǎo)愈傷組織的生長(zhǎng)情況圖7配方二莖尖誘導(dǎo)愈傷組織的生長(zhǎng)情況圖8配方一莖尖誘導(dǎo)愈傷組織的生長(zhǎng)情況分析：從表二中可以看出，兩種配方的愈傷組織誘導(dǎo)率很低，并且大部分外植體都褐變死亡了；原因可能是：在切割時(shí)，增大了其的傷口面積，并使傷口在空氣中暴露時(shí)間過長(zhǎng)，或者培養(yǎng)的溫度、pH造成了褐變。從圖1和圖2中看到，莖尖在培養(yǎng)的過程中長(zhǎng)出了嫩葉，但是隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，部分嫩葉發(fā)生了枯萎現(xiàn)象，原因可能是所設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基配方不適合嫩葉的生長(zhǎng)情況；圖3是嫩葉誘導(dǎo)愈傷組織的前期現(xiàn)象，嫩葉凸起，但是在接種一開始的第一個(gè)星期，嫩葉大部分發(fā)生了褐變，原因是嫩葉剛開始不適應(yīng)在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，但經(jīng)過兩個(gè)星期的適應(yīng)后，沒有完全發(fā)生褐變的嫩葉返青，凸起，長(zhǎng)出愈傷組織。從圖6中可以看出，經(jīng)過了八周的培養(yǎng)時(shí)間，配方二有利于誘導(dǎo)莖尖的愈傷組織，誘導(dǎo)時(shí)間較長(zhǎng)，愈傷組織呈淺黃色，較松散，而配方一誘導(dǎo)出的愈傷組織呈淺綠色；莖段沒有誘導(dǎo)出愈傷組織的原因：一是莖段被微生物污染的數(shù)量較多，二是莖段在培養(yǎng)一段時(shí)間后，長(zhǎng)出了嫩葉，但是所設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基不適合莖段的生長(zhǎng)，使得莖段后期發(fā)生褐變死亡。綜上所述，由于兩種培養(yǎng)基中長(zhǎng)出的愈傷組織較少，無法比較哪種培養(yǎng)基更有利于誘導(dǎo)杜鵑花不同部位的愈傷組織。4總結(jié)本次實(shí)驗(yàn)是以杜鵑花的莖尖、莖段和嫩葉為外植體，探究杜鵑花的不同部位誘導(dǎo)愈傷組織的生長(zhǎng)情況，并觀察和分析不同的生長(zhǎng)素濃度對(duì)杜鵑花愈傷組織誘導(dǎo)分化影響的差異。并在實(shí)驗(yàn)的過程中掌握植物快速繁殖的基本方法和過程和外植體愈傷組織誘導(dǎo)的方法及其培養(yǎng)的操作技術(shù)。經(jīng)過為期十周的實(shí)驗(yàn)，得到的愈傷組織數(shù)較少，原因是污染率較高，且所設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基配方不是最適誘導(dǎo)愈傷組織的配方，大部分的外植體褐變死亡。本次實(shí)驗(yàn)了解了無菌操作在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中起著至關(guān)重要的作用，如果無菌操作技術(shù)不規(guī)范，就會(huì)造成外植體的污染，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能較好的體現(xiàn)出來。并且同組組員之間的團(tuán)結(jié)分工也是很重要的，比如在接種時(shí)每個(gè)組員的分工，不僅節(jié)省了時(shí)間，而且在實(shí)驗(yàn)工作上有了分工，效率也有了明顯的提高，且每個(gè)組員都能自己熟悉操作實(shí)驗(yàn)的各個(gè)步驟，這樣就不會(huì)有人不明白實(shí)驗(yàn)的具體操作技術(shù)。但是本次實(shí)驗(yàn)中還存在這不足的地方：比如對(duì)無菌操作的重要性的意識(shí)不強(qiáng)，有些組在培養(yǎng)一周后，由于沒有嚴(yán)格進(jìn)行無菌操作，導(dǎo)致材料的污染，使得后期的實(shí)驗(yàn)無法進(jìn)行。總體來說，我們組的實(shí)驗(yàn)不算成功了，因?yàn)橛鷤M織的誘導(dǎo)率很低，且較多的外植體因?yàn)楹肿兯劳觥＿€有一個(gè)就是無菌操作技術(shù)不夠規(guī)范，導(dǎo)致外植體的污染率較高，使誘導(dǎo)愈傷組織的材料數(shù)減少。并且無法達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康模礋o法探究杜鵑花不同部位誘導(dǎo)愈傷組織的生長(zhǎng)情況和比較不同的植物生長(zhǎng)素對(duì)杜鵑花愈傷組織誘導(dǎo)分化影響的差異。最后，感謝老師在實(shí)驗(yàn)中提供的實(shí)驗(yàn)材料和儀器，以及在實(shí)驗(yàn)過程中給予我們的幫助和解答我們的疑問，還有感謝同組成員在實(shí)驗(yàn)過程中的幫助，讓我意識(shí)到了組員之間團(tuán)結(jié)的重要性。5參考文獻(xiàn)[1]郭秀蓮,張正銀,王曉東,樊哲仁,白潔,陳放.

杜鵑花組織培養(yǎng)研究概況[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥.2009(09).[2]閆鳳霞,胡金萍,徐立明.

杜鵑花的組培繁殖[J].