四逆散對抑郁癥模型大鼠腦-垂體-腎上腺軸及海馬腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的影響

抑郁是一種情緒障礙疾病，主要與患者的心理素質(zhì)和社會因素密切相關(guān)。近年來,隨著生活節(jié)奏的加快,人們生活、工作、學(xué)習(xí)等壓力明顯增大,發(fā)病率呈現(xiàn)逐漸增高的趨勢,WHO預(yù)測到2020年抑郁癥將成為僅次于缺血性心臟病而位居第二的致殘疾?。?］。抑郁癥屬于中醫(yī)“郁證”范疇。中醫(yī)理論認(rèn)為抑郁癥的發(fā)生主要與機(jī)體情志不暢,氣機(jī)紊亂,心、肝、脾三臟功能失調(diào)等有關(guān)［2］,但是它的具體病理機(jī)制目前尚不完全明確。近年來,大量的研究表明抑郁癥的發(fā)病率和下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA)失調(diào)之間存在著一定的關(guān)系,并發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素循環(huán)和糖皮質(zhì)激素受體對HPA軸功能具有負(fù)反饋作用［3］。有研究表明［4］,HPA軸亢進(jìn)的抑郁癥患者,腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)及其受體型酪氨酸蛋白激酶B(TrKB)在海馬中具有較高的表達(dá)。同時,重癥抑郁癥患者死后海馬BDNF的表達(dá)和海馬TrKB的表達(dá)顯著降低。因此,HPA軸和海馬BDNF,TrKB的表達(dá)在抑郁癥的發(fā)病中扮演了重要的角色。在治療抑郁癥的過程中,它們可以作為藥物療效的重要檢測指標(biāo)。四逆散由柴胡、芍藥、枳實和炙甘草組成,具有透邪解郁、疏肝理脾的功效,是中醫(yī)臨床上調(diào)治情志活動的經(jīng)典名方。本實驗利用慢性應(yīng)激制造大鼠肝郁氣滯型抑郁模型,通過檢測血漿中皮質(zhì)醇(CORT)、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)的含量、下丘腦促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)的含量、BDNF和TrKB的表達(dá)來探討四逆散治療抑郁癥的主要作用機(jī)制。1藥物的制備1.1動物清潔級健康SD雄性大鼠50只,質(zhì)量180~200g,由山東中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供,批號為SCXK(魯)20090001。1.2藥物四逆散由柴胡、枳實、芍藥、炙甘草組成,比例為1∶1∶1∶1,購于山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,并經(jīng)張學(xué)順教授鑒定。取四逆散各180(共30副)g,加10倍量的水浸泡1h后煎煮,沸騰后文火煎40min,過濾;第2次加8倍量的水煎煮,水沸后用文火煎40min,過濾,合并濾液,常壓濃縮至含原生藥材0.5,1.0g·mL－1煎出物,冷卻后密封,4℃保存?zhèn)溆?。鹽酸文拉法辛膠囊(蘇州第四制藥廠有限公司,批號20120206)。1.3試劑ACTH放射免疫分析試劑盒(北京福瑞生物工程公司,批號20121103),CORT放射免疫分析試劑盒(北京福瑞生物工程公司,批號20121105),CRH放射免疫分析試劑盒(北京福瑞生物工程公司,批號20121107),兔抗BDNF,兔抗TrKB,SAB免疫組化試劑盒,DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程公司)。1.4儀器TC-512型切片機(jī)(德國Lezi公司),DT5-3型低速自動平衡離心機(jī)(北京時代北利離心機(jī)有限公司),電子秤(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司),DW-86L628型海爾超低溫保存箱(-80℃,青島海爾特種電器有限公司),BCD-186K型4℃冰箱(海信北京電器有限公司)。2模型大鼠海馬ca2區(qū)和dg區(qū)表達(dá)免疫2.1分組對SD雄性大鼠進(jìn)行標(biāo)記,稱重,隨機(jī)分為正常組、模型組、鹽酸文法拉辛組、四逆散低劑量組和四逆散高劑量組。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始造模。2.2造模在造模的21d之內(nèi),正常組不接受任何刺激;其余各組輪流接受7種不同的刺激,分別為24h禁食,24h禁水,4℃冷水游泳,45℃熱刺激,夾尾1min,高速水平震蕩30min,電擊足底(電壓50mV,每隔30s刺激1次,每次持續(xù)10s,共15次)。每天1種刺激,相同的刺激不連續(xù)出現(xiàn)。造模的同時,對各組大鼠進(jìn)行灌胃處理,正常組(0.9%生理鹽水10mL·kg－1)、模型組(0.9%生理鹽水10mL·kg－1)、鹽酸文拉法辛組(12.5mg·kg－1)、四逆散低劑量組(5g·kg－1)、四逆散高劑量組(10g·kg－1)。各組每天灌胃1次,連續(xù)21d。2.3體重測量每周測量1次體重。2.4取血漿及其處理從大鼠股動脈取血2mL,置于帶有標(biāo)號的肝素抗凝管中,37℃溫浴2h后進(jìn)行離心(3000r·min－1,20min),取上清液(血漿),-80℃冰凍保存,采用放射免疫分析法(RIA)測定ACTH和CORT含量。2.5取下丘腦和海馬及其處理從大鼠股動脈取完血后,對大鼠進(jìn)行開顱取腦,取出下丘腦和海馬,放入-80℃保存箱中。日后用10%甲醛固定,石蠟包埋,Leitz石蠟切片機(jī)切片。2.6免疫組化法常規(guī)脫蠟至水,3%過氧化氫孵育10min,以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性,蒸餾水沖洗,5min×3次。微波熱修復(fù),PBS沖洗3min×3次。滴加BSA封閉液封閉,室溫孵育30min。滴加一抗,BDNF一抗稀釋為1∶100,TrKB稀釋為1∶200,4℃過夜。PBS沖洗,3min×3次。滴加二抗生物素化羊抗兔IgG,37℃孵育30min。PBS沖洗3min×3次。DAB顯色劑顯色,室溫下20min,蒸餾水中止反應(yīng)。脫水,透明、封片。用10×40倍光學(xué)顯微鏡下觀察所有標(biāo)本,在10×10方格參照體積內(nèi)計數(shù)陽性染色細(xì)胞截面與方格橫線的變點數(shù),各切片海馬CA2區(qū)和DG區(qū)陽性細(xì)胞面密度值［5］。2.7統(tǒng)計學(xué)處理實驗結(jié)果均采用x珋±s表示,用SPSS17.0軟件中的方差分析(ANOVA)進(jìn)行檢驗,P<0.05表示差異有顯著性。3逆散對海馬bcnf陽性神經(jīng)元面密度值的影響3.1大鼠血漿CORT,ACTH及下丘腦CRH含量變化模型組大鼠血漿中皮質(zhì)醇CORT,ACTH和CRH明顯高于正常組(P<0.01)。經(jīng)治療后,鹽酸文法拉辛組和四逆散高、低劑量組大鼠血漿中的CORT,ACTH及下丘腦CRH含量明顯低于模型組(P<0.05),同時也與正常組有顯著性差異(P<0.05),見表1。3.2大鼠海馬BDNF陽性神經(jīng)元面密度值的變化與正常組相比,模型組大鼠海馬BDNF陽性神經(jīng)元面密度值比較低(P<0.01);四逆散低劑量組海馬BDNF陽性神經(jīng)元面密度值高于模型組(P<0.05),低于正常組(P<0.05),均有統(tǒng)計學(xué)意義;鹽酸文法拉辛組和四逆散高劑量組海馬BDNF陽性神經(jīng)元面密度值明顯高于模型組(P<0.01),見表2。3.3大鼠海馬TrKB陽性神經(jīng)元面密度值的變化模型組海馬TrKB陽性神經(jīng)元面密度值均小于正常組,有顯著性差異(P<0.01);四逆散低劑量組的海馬TrKB陽性神經(jīng)元面密度值高于模型組(P<0.05),低于正常組(P<0.05);鹽酸文法拉辛組和四逆散高劑量組海馬TrKB陽性神經(jīng)元面密度值明顯高于模型組,有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表3。4抗抑郁藥對海馬的影響目前有關(guān)抑郁癥的動物模型主要分為兩類:一類屬于藥物誘發(fā)的模型,包括育亨賓增強(qiáng)、5-HTP誘發(fā)抑郁行為、利血平拮抗等;另一類為改變環(huán)境條件誘發(fā)的抑郁模型,如束縛、嗅球切除、行為絕望等。慢性應(yīng)激抑郁模型是將幾種不同的應(yīng)激因子(如禁食、禁水、電擊、強(qiáng)迫游泳等)在實驗全程中的應(yīng)用,順序隨機(jī),是動物不能預(yù)料刺激的發(fā)生,是目前國內(nèi)外文獻(xiàn)中廣泛使用的模型,本實驗采用了此種造模方法,具有一定的科學(xué)性與可靠性［6］。抑郁癥的病因十分復(fù)雜,其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。有研究表明,應(yīng)激刺激可以使下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸(HPA軸)功能亢進(jìn),從而促進(jìn)CRH,ACTH和CORT的分泌,致使下丘腦和血漿中的CRH,ACTH,CORT含量增加,這也與本實驗結(jié)果一致。若機(jī)體長期處于應(yīng)激狀態(tài),HPA軸功能持續(xù)亢進(jìn),將嚴(yán)重影響人體的身心健康,使機(jī)體出現(xiàn)抑郁癥狀［7］。海馬是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中CORT含量最多的部位,血漿中含有過量的CORT,過高水平的CORT能自由通過血腦屏障,海馬受過量的CORT影響,導(dǎo)致海馬神經(jīng)元萎縮死亡。研究發(fā)現(xiàn)TrKB是BDNF高親和力受體［8］。當(dāng)BDNF與TrKB結(jié)合啟動細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,從而產(chǎn)生相應(yīng)分子對神經(jīng)元的保護(hù)及促進(jìn)再生作用［10］。BDNF只有通過與TrKB的特異結(jié)合,才能啟動一系列底物磷酸化,從而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。BDNF及其受體TrKB廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng),尤以大腦皮質(zhì)及海馬區(qū)域含量最高,在周圍系統(tǒng),如心、肺、骨骼肌也有低水平表達(dá),對神經(jīng)元的生存、生長、分化維持神經(jīng)元功能和再生修復(fù)等多方面具有重要影響［11］。有實驗研究表明［12］,抑郁癥動物BDNF及其TrKB的表達(dá)水平明顯降低,用抗抑郁藥治療后可以上調(diào)抑郁動物的BDNF和TrKB的低表達(dá)水平。本實驗結(jié)果顯示,抑郁模型大鼠海馬內(nèi)的BDNF和TrKB的陽性神經(jīng)元數(shù)量下降,從神經(jīng)生化方面佐證了抑郁癥模型的復(fù)制成功。四逆散可以降低血漿CORT,ACTH和下丘腦CRH的含量,使HPA軸的功能趨于正