非生物脅迫與蛋白質(zhì)相互作用

體是一個復(fù)雜的體。生物分子如蛋白質(zhì)、DNA、RNA、脂類、多糖等常常同類分子間或(和)不同分子間形成結(jié)構(gòu)復(fù)合體,執(zhí)行特定的生物功能。蛋白質(zhì)間的相互作用及其構(gòu)建的作用網(wǎng)絡(luò),在很多生命過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。研究蛋白質(zhì)之間的相互作用對于深入了解細(xì)胞功能的分子機(jī)制具有重要的意義。而蛋白質(zhì)相互作用的研究可以分為實驗性的方法技術(shù)和生物信息學(xué)的分析預(yù)測以及專業(yè)蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建等。本文綜述了常用的蛋白質(zhì)相互作用實驗性技術(shù)的理論基礎(chǔ)、最新進(jìn)展及其優(yōu)缺點,并繪制了多種技術(shù)的作用原理示意圖。1靈敏度和特異性不同蛋白質(zhì)相互作用分析技術(shù)具有各自的優(yōu)點和缺點,特別是在靈敏度和特異性方面。較高的靈敏度意味著可以檢測到較弱的相互作用,而高特異性則說明初步得到的相互作用結(jié)果是比較可信的。1.1小鼠細(xì)胞和細(xì)胞系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染酵母雙雜交系統(tǒng)(Yeasttwo-hybridsystem,Y2H)由Fields和Song在1989年首次建立使用。它的理論基礎(chǔ)是很多真核生物的轉(zhuǎn)錄因子如酵母Gal4由兩個具有不同功能的結(jié)構(gòu)域組成:轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(Transcriptionalactivationdomain,AD)和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNAbindingdomain,BD)。兩種待檢測蛋白分別和AD、BD融合表達(dá),如果兩者之間存在相互作用,就有可能使AD和BD結(jié)構(gòu)域結(jié)合,行使轉(zhuǎn)錄功能(圖1)。酵母雙雜交系統(tǒng)的主要優(yōu)點是簡便、易用、費用低廉,能檢測到瞬時或較弱的蛋白質(zhì)相互作用;但酵母雙雜交系統(tǒng)也有一些缺點,比如較高的假陽性,不能真實反映蛋白質(zhì)在自身細(xì)胞中的相互作用,表達(dá)的融合蛋白最終要運送到酵母細(xì)胞核,而有些蛋白可能具有其他亞細(xì)胞定位信號肽等。為了克服上述缺點,很多改進(jìn)方法和技術(shù)使得雙雜交系統(tǒng)不僅可以運用于酵母細(xì)胞,還可以運用在哺乳動物細(xì)胞和細(xì)菌中。Luo等分別將p53蛋白和GAL4DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、SV40T抗原和VP16轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合,在哺乳動物細(xì)胞中轉(zhuǎn)染共表達(dá),證明了p53和SV40T抗原存在相互作用。這種方法克服了酵母表達(dá)系統(tǒng)的限制,可以在動物細(xì)胞體系中研究蛋白質(zhì)在細(xì)胞核內(nèi)的相互作用。而SplitTEV方法克服了細(xì)胞核的限制,可以研究在各個亞細(xì)胞部位發(fā)生的蛋白質(zhì)相互作用。酵母雙雜交系統(tǒng)仍然是運用比較多的檢測和驗證蛋白質(zhì)相互作用的方法之一。酵母雙雜交系統(tǒng)在很多物種的蛋白質(zhì)互作組(Proteininteractome)得到了廣泛應(yīng)用,如酵母、線蟲、果蠅、人類、水稻。1.2tap標(biāo)記的蛋白文化串聯(lián)親和純化(Tandemaffinitypurification,TAP)是一種常用的純化蛋白復(fù)合體的方法。Rigaut等在1999年首次報道了利用TAP技術(shù)分離純化蛋白復(fù)合物。此后,利用TAP技術(shù)大規(guī)模分析不同物種中蛋白質(zhì)相互作用的報道已有很多[17~19]。傳統(tǒng)的TAP標(biāo)簽蛋白由ProteinA、TEV蛋白酶可剪切序列和鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽(Calmodulin-bindingpeptide,CBP)組成(圖2a)。TAP技術(shù)通過兩步親和純化來減少非特異性蛋白結(jié)合。首先,TAP標(biāo)記的蛋白復(fù)合物通過第一個標(biāo)簽ProteinA特異性結(jié)合到IgG瓊脂珠,經(jīng)過清洗后,用TEV蛋白酶孵育IgG瓊脂珠以釋放結(jié)合的蛋白復(fù)合物,隨后復(fù)合物通過第二個標(biāo)簽CBP結(jié)合到鈣調(diào)蛋白瓊脂珠(Calmodulinbeads),再次清洗后,洗脫鈣調(diào)蛋白瓊脂珠結(jié)合的蛋白混合物(圖2c)。分離純化的蛋白通過串聯(lián)質(zhì)譜、免疫雜交等方法進(jìn)行鑒定分析。與其他方法相比,TAP具有如下優(yōu)點:首先,TAP能減少非特異性蛋白結(jié)合;其次,TAP能保留蛋白復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)的修飾和結(jié)合狀態(tài)。而TAP的缺點是需要較多的樣本材料來提取蛋白,價格比較昂貴,不能高效檢測到瞬時或較弱的蛋白質(zhì)相互作用。泛素化是常見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾,對于調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的豐度和功能具有重要作用。泛素化往往會在強(qiáng)變性條件下丟失,因此不能用常規(guī)方法分離純化來鑒定泛素化蛋白。Tagwerker等于2006年報道了一種新型的TAP標(biāo)簽HB,HB標(biāo)簽蛋白主要由RGSH6、6×His和BIO3個標(biāo)簽蛋白組成,能兼容強(qiáng)變性條件如8M尿素、6M氯化胍,分別使用Ni2+-Sepharose和streptavidin-agarose兩步純化HB融合蛋白;而使用HB標(biāo)記泛素后,成功從酵母中鑒定出258個泛素化標(biāo)記蛋白。另外,低分子量標(biāo)簽蛋白如SH-TAP、Flag-HA等空間結(jié)構(gòu)很小,可以盡量減少標(biāo)簽蛋白對蛋白質(zhì)互相作用可能存在的干擾。為了適應(yīng)不同的實驗需要,研究人員開發(fā)了不同的TAP標(biāo)簽。表1列舉了常用的TAP標(biāo)簽并簡單評價了其優(yōu)點。1.3gfp抑制劑的性質(zhì)免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)利用抗體和抗原之間特異性的識別和結(jié)合,通過一步親和純化,分離出抗原蛋白和含有抗原蛋白的復(fù)合物(圖2,b和d)。商業(yè)化的通用標(biāo)簽蛋白(如Flag、HA、c-myc、ProteinA、GFP、6×His等)的單克隆抗體減少了制備步驟,縮短了實驗周期。而將抗體直接或間接連接到親和樹脂、瓊脂珠、磁珠等固相支持物上能進(jìn)一步減少孵育時間,提高結(jié)合和析出效率。和常用的Co-IP標(biāo)簽蛋白相比,GFP蛋白相對分子量較大(27kDa),常用于和目的蛋白融合以觀察目的蛋白在細(xì)胞和組織器官中的表達(dá)分布或亞細(xì)胞定位等[33~35],很少作為Co-IP的標(biāo)簽蛋白。最近,Rothbauer等將小分子量的13kDa駱駝GFP結(jié)合多肽(GFP-bindingpeptide,GBP)共價交聯(lián)到N-羥基琥珀酰亞胺-瓊脂糖(N-hydroxysuccinimide-sepharose),并將其命名為GFP-nano-trap;利用GFP-nano-trap能特異性分離GFP融合蛋白及其復(fù)合物。隨后這種方法在擬南芥、哺乳動物細(xì)胞系、線蟲、果蠅等都有成功報道。很多實驗室通常積累了大量的GFP融合蛋白的轉(zhuǎn)基因材料,因此這一新型高效小抗體將會大大促進(jìn)包括蛋白質(zhì)相互作用在內(nèi)的一系列研究。Co-IP與TAP相比,同樣可以保留蛋白質(zhì)的修飾和結(jié)合狀態(tài),同時所需的樣本量較少,實驗成本較低,減少了純化步驟,能檢測到瞬時和較弱的蛋白相互作用,但Co-IP特異性較低,洗脫混合物中往往含有較多的非特異結(jié)合蛋白。因此,Co-IP檢測到的潛在相互作用蛋白需要通過BiFC、FRET等其他方法進(jìn)一步驗證。1.4gst和谷胱甘肽融合表達(dá)GSTPull-down是一種常用的研究蛋白質(zhì)在生物體外相互作用的實驗技術(shù)。GSTPull-down和免疫共沉淀基本原理相似:首先誘餌蛋白(Baitprotein)和GST蛋白(Glutathione-S-transferase)在細(xì)菌、動物細(xì)胞等體系中融合表達(dá),利用GST和谷胱甘肽親和樹脂之間的高親和性,將誘餌蛋白固化在樹脂上,而固化的誘餌蛋白可以捕獲細(xì)胞裂解物中的互作靶蛋白。和Co-IP相比,GSTPull-down的融合誘餌蛋白往往是在外源系統(tǒng)中表達(dá),可能會缺少某些翻譯后修飾,并且和靶蛋白的結(jié)合發(fā)生在體外環(huán)境,不能精確反映內(nèi)體的相互作用;但GSTPull-down外源表達(dá)系統(tǒng)簡單易用、蛋白表達(dá)周期短,且GST融合蛋白和谷胱甘肽有很高的親和性,易分離出大量融合蛋白進(jìn)行批量實驗。1.5檢測蛋白質(zhì)的相互作用雙分子熒光互補(bǔ)(Bimolecularfluorescencecomplementation,BiFC)是一種檢測活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù),在很多物種中得到了應(yīng)用。雙分子熒光互補(bǔ)原理是將熒光蛋白分成兩個無獨立功能的片段,分別與bait蛋白和prey蛋白融合表達(dá),如果bait融合蛋白和prey融合蛋白存在相互結(jié)合作用,而這種結(jié)合促使熒光蛋白的兩個片段相互作用發(fā)出熒光(圖3)。Ghosh等通過將細(xì)菌兩個反向平行的亮氨酸拉鏈分別融合到GFP的無功能的兩個片段發(fā)現(xiàn)了BiFC現(xiàn)象。Hu等在哺乳動物系統(tǒng)系中利用EYFP證實BiFC能應(yīng)用于蛋白質(zhì)相互作用的研究。隨后很多研究人員開發(fā)了不同的熒光報告系統(tǒng),如N-terminalGFP-S65T+C-terminalCFP、mRFP1-Q66T、mCherry等。不同熒光蛋白的結(jié)合使用可以同時觀察多組蛋白組內(nèi)的相互作用。而BiFC-FRET將BiFC和FRET檢測技術(shù)結(jié)合,能檢測在兩蛋白相互作用的基礎(chǔ)上與第3個蛋白質(zhì)的相互作用。BiFC和其他分子互補(bǔ)技術(shù)相比,具有明顯的優(yōu)勢,即能簡單方便地通過觀察熒光鑒定蛋白質(zhì)相互作用,不依賴外源的熒光素或顯色劑等,能檢測到瞬時或者較弱的相互作用,并且可以檢測到相互作用的位點[44~46]。但BiFC也有一些缺陷,比如融合蛋白的相互結(jié)合和熒光發(fā)生有一定時間延遲,一些融合蛋白的結(jié)合是不可逆的,不能實時反應(yīng)蛋白質(zhì)的結(jié)合和分離情況。而這些缺點是未來BiFC技術(shù)改進(jìn)的方向。1.6作用作用研究熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)是一種檢測分子間距離的高效方法,由F?rster在1948年首先發(fā)現(xiàn),現(xiàn)已成為一種檢測細(xì)胞中分子內(nèi)或分子間相互作用的有效手段。FRET在蛋白質(zhì)相互作用研究的基本原理是分別將bait蛋白、prey蛋白與相應(yīng)的供體熒光基團(tuán)(如ECFP)和受體熒光基團(tuán)(如EYFP)融合,當(dāng)bait蛋白和prey蛋白相互結(jié)合作用時,供體基團(tuán)和受體基團(tuán)兩者之間的距離很近(約10nm),供體基團(tuán)的發(fā)射光激發(fā)受體基團(tuán)發(fā)射熒光(圖4)。常用的供體熒光蛋白和受體熒光蛋白對有BFP-GFP、BFP-EGFP、CFP-YFP等。FRET與其蛋白質(zhì)互作技術(shù)相比,其優(yōu)點如下:能比較可靠地反映蛋白質(zhì)相互作用時的距離;能檢測到瞬時、較弱的蛋白質(zhì)相互作用;能同時檢測到兩蛋白的細(xì)胞分布和作用位點。而缺點是供體蛋白的激發(fā)光譜和受體蛋白的光譜可能存在重疊,影響實驗結(jié)果;供體蛋白和受體蛋白的空間結(jié)構(gòu)較大,限制了兩者之間的距離,導(dǎo)致FRET發(fā)生效率低(約40%),且易出現(xiàn)假陰性;供體蛋白和受體蛋白的熒光亮度可能差異較大,易導(dǎo)致較高的背景信號。1.7檢測感器的組成與原理表面等離子共振分析是一種新型的生物分析技術(shù),不需要對樣品進(jìn)行標(biāo)記,通過傳感器實時檢測生物分子如蛋白質(zhì)、寡核苷酸、類脂等。此技術(shù)的核心SPR生物傳感器由3部分組成:SPR光學(xué)監(jiān)測系統(tǒng)、微射流卡盤、傳感器芯片。其工作原理是首先將蛋白質(zhì)(配體)固定在芯片表面,通過微射流卡盤將蛋白質(zhì)溶液輸送到芯片表面,實時監(jiān)測溶液與傳感器芯片表面的配體蛋白結(jié)合和分離的全過程,最后通過配套軟件處理監(jiān)測到的信號,得出最終的實驗結(jié)果。而表面等離子共振分析和質(zhì)譜分析聯(lián)用可以鑒定出和配體蛋白結(jié)合的蛋白質(zhì)序列。主要優(yōu)點有:不需要標(biāo)記樣品、實時高效等;而缺點是需要分離純化配體并根據(jù)其性質(zhì)優(yōu)化與芯