蛋白質(zhì)組學(xué)的概念、內(nèi)容與研究

“泛在一起”一詞由澳大利亞科學(xué)家wlkin于1994年提出。它指的是由一個(gè)群、一個(gè)或兩個(gè)細(xì)胞和一個(gè)組織表示的所有泛在上面。從這個(gè)定義看,蛋白質(zhì)組內(nèi)蛋白質(zhì)的數(shù)目應(yīng)該等于基因組內(nèi)編碼蛋白的基因的數(shù)目(準(zhǔn)確的說(shuō)是ORF的數(shù)目),但在生物體內(nèi)這樣的蛋白質(zhì)組是不存在的。從基因表達(dá)的角度看,蛋白質(zhì)組中蛋白質(zhì)的數(shù)目總是少于基因組中開(kāi)放閱讀框(ORF)的數(shù)目,但從蛋白質(zhì)修飾的角度看,蛋白質(zhì)的數(shù)目又遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于這個(gè)數(shù)字?；蚪M基本上是固定不變的,然而蛋白質(zhì)組是動(dòng)態(tài)的,具有時(shí)空性和可調(diào)節(jié)性,能反映出特定基因的表達(dá)時(shí)間、表達(dá)量,以及蛋白翻譯后的加工修飾和亞細(xì)胞分布等。與過(guò)去將大量時(shí)間花在某個(gè)特定的蛋白質(zhì)上不同,蛋白質(zhì)組學(xué)(Proteomics)是在蛋白質(zhì)水平上定量、動(dòng)態(tài)、整體性地研究生物體。同基因組學(xué)一樣,蛋白質(zhì)組學(xué)不是一個(gè)封閉的、概念化的、穩(wěn)定的知識(shí)體系,而是一個(gè)領(lǐng)域。它旨在闡明生物體全部蛋白質(zhì)的表達(dá)模式及功能模式,其內(nèi)容包括蛋白質(zhì)的定性鑒定、定量檢測(cè)、細(xì)胞內(nèi)定位、相互作用研究等,最終揭示蛋白質(zhì)功能,是基因組DNA序列與基因功能之間的橋梁。1蛋白質(zhì)組學(xué)和質(zhì)譜組學(xué)總體上看,蛋白質(zhì)組研究可分為兩個(gè)方面。一個(gè)是對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)模式(或蛋白質(zhì)組組成)的研究,另一方面是對(duì)蛋白質(zhì)組功能模式(目前主要集中在蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)系)的研究。對(duì)蛋白質(zhì)組組成的分析鑒定是蛋白質(zhì)組學(xué)中的與基因組學(xué)相對(duì)應(yīng)的主要內(nèi)容。它要求對(duì)蛋白質(zhì)組進(jìn)行表征,即實(shí)現(xiàn)所有蛋白質(zhì)的分離、鑒定及其圖譜化。雙向凝膠電泳(2-DE)和質(zhì)譜(Massspectrometry)技術(shù)是當(dāng)前分離鑒定蛋白質(zhì)的兩大支柱技術(shù)。通過(guò)分析一個(gè)蛋白質(zhì)是否跟功能已知的蛋白質(zhì)相互作用可得到揭示其功能的線索。利用大規(guī)模酵母雙雜交系統(tǒng),建立相互作用關(guān)系的網(wǎng)絡(luò)圖,是目前蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。1.1蛋白質(zhì)分析1.1.1凝膠電泳法分離低刑罰執(zhí)行蛋白目前雙向凝膠電泳一般只能分辨到1000~3000個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)(Spot),而一個(gè)細(xì)胞系可以表達(dá)上萬(wàn)個(gè)基因,加上蛋白質(zhì)加工修飾的多樣性,一個(gè)樣品中的蛋白種類可達(dá)106種。因此,對(duì)于一些低拷貝蛋白,通常先將蛋白粗提液通過(guò)親和柱純化,再由一維或二維電泳分離。單向電泳的優(yōu)點(diǎn)在于幾乎所有蛋白質(zhì)均溶于SDS,分子量在10000~300000范圍內(nèi)均能有效分離,極酸、極堿蛋白極易檢出。雙向凝膠電泳(2-dimentionalgelelectrophoresis)原理簡(jiǎn)明,第一向進(jìn)行等電聚焦,蛋白質(zhì)沿pH梯度分離,至各自的等電點(diǎn);隨后,在沿垂直的方向進(jìn)行分子量的分離。80年代固相化pH梯度(ImmobilizedpHgradients,IPG)的發(fā)明和完善,解決了pH梯度不穩(wěn)的問(wèn)題,使2-DE的重復(fù)性和上樣量大為改善。1.1.2離子化方法質(zhì)譜(MassSpectrometry)的基本原理是樣品分子離子化后,根據(jù)不同離子間的質(zhì)荷比(m/z)的差異來(lái)分離并確定分子量。在離子化方法上,多采用電噴霧離子化(Electrosprayionization,ESI)和基質(zhì)輔助的激光解吸離子化(Matrix-assistedlaserdesorptionionization,MALDI)的“軟電離”方法。即樣品分子電離時(shí),保留整個(gè)分子的完整性,不會(huì)形成碎片離子。(1)精氨酸/精氨酸鹽類用特定蛋白酶(最常用胰酶)將分離蛋白在膠上或膜上于精氨酸或賴氨酸的C末端處斷裂,通過(guò)MALDI-MS或ESI-MS來(lái)得到精確的肽分子量。(2)不同碎片離子系列對(duì)肽段氨基酸序列的鑒定為進(jìn)一步鑒定蛋白質(zhì),可將液相中的肽段經(jīng)電噴霧電離后,進(jìn)入串聯(lián)質(zhì)譜(Tandem-MS),肽鏈中的肽鍵斷裂,形成N-端碎片離子系列(B系列)和C-端碎片離子系列(Y系列)。綜合分析這些碎片離子系列,可得出肽段的氨基酸序列。這樣,聯(lián)合肽片段的分子量和肽段序列信息將足以鑒定一個(gè)蛋白質(zhì)。當(dāng)然,盡管肽質(zhì)指紋譜(PeptideMassFingerprint)已成為蛋白質(zhì)鑒定的支柱技術(shù),N-末端Edman降解、氨基酸組分分析仍然是目前鑒定蛋白質(zhì)的常用手段。1.1.3蛋白質(zhì)磷酸化的變化磷酸化、糖基化及其他修飾方式是蛋白質(zhì)執(zhí)行生理功能所必需的,它們的變化往往與疾病的發(fā)生有關(guān)。目前,對(duì)蛋白質(zhì)磷酸化的研究已取得初步進(jìn)展。由于許多受體介導(dǎo)的信號(hào)通路都發(fā)生酪氨酸磷酸化過(guò)程,因此,翻譯后修飾的鑒定將對(duì)信號(hào)通路的闡明有著重大意義。1.2不同物質(zhì)組的差異1.2.1蛋白凝膠的差異表達(dá)通過(guò)比較病理-正常狀態(tài)的2-DE圖譜,可發(fā)現(xiàn)特定的蛋白質(zhì)表達(dá)差異,作為診斷標(biāo)記或治療靶目標(biāo)。當(dāng)前2-DE比較圖譜面臨的挑戰(zhàn)有:(1)疏水膜蛋白和大分子蛋白不易進(jìn)入凝膠的第二向。(2)只能顯示出表達(dá)量最豐富的蛋白。(3)有時(shí)一個(gè)蛋白點(diǎn)(Spot)實(shí)際包含不止一種蛋白。(4)重復(fù)性仍然不理想。(5)因蛋白多樣性的存在,很難確定一張“正?！睜顟B(tài)的圖譜作為“病理”狀態(tài)的對(duì)照。某些情況下,在mRNA(cDNA)水平上檢測(cè)基因表達(dá),發(fā)現(xiàn)大量的差異表達(dá)基因顯得更方便快捷有效。但當(dāng)mRNA豐度與蛋白質(zhì)含量不成正相關(guān)或牽涉到蛋白質(zhì)修飾等問(wèn)題時(shí),2-DE無(wú)疑是首選方案。1.2.2elisa酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)將“誘餌”蛋白(通常是抗體)固定在經(jīng)特殊處理的表面上,檢測(cè)樣品“獵物”。只有那些與特定抗體特異結(jié)合的蛋白留在了芯片上。蛋白質(zhì)芯片技術(shù)實(shí)際上是ELISA酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)的一個(gè)大規(guī)模應(yīng)用。它的獨(dú)特之處在于,選擇合適的單克隆抗體,可以將不同翻譯后修飾的蛋白質(zhì)區(qū)分開(kāi)來(lái)。而且,多樣的單克隆抗體可以通過(guò)重組其編碼DNA無(wú)限獲得。許多人認(rèn)為找到一種新的大規(guī)模制備高質(zhì)量抗體的方法可能對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)產(chǎn)生第二次革命。1.2.3樣品的質(zhì)譜分析質(zhì)譜法與同位素標(biāo)記方法相結(jié)合可以跳過(guò)電泳分離蛋白質(zhì)這一步驟而直接定量分析蛋白質(zhì)表達(dá)水平的差異。將具有不同質(zhì)量的同位素親和標(biāo)簽(Isotope-codedaffinitytags,ICATs)標(biāo)記處不同狀態(tài)下的細(xì)胞中的蛋白質(zhì),利用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù),能非常準(zhǔn)確的比較出兩份樣品蛋白質(zhì)表達(dá)水平的不同。這項(xiàng)研究目前還處于初級(jí)探索階段,但無(wú)疑具有巨大應(yīng)用價(jià)值。1.3蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用1.3.1酵母蛋白質(zhì)間的相互作用的鑒定—酵母雙雜交系統(tǒng):酵母雙雜交系統(tǒng)是研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的有力工具。它的建立得力于對(duì)真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過(guò)程的認(rèn)識(shí)。細(xì)胞起始基因轉(zhuǎn)錄需要有反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與。DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DB)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(AD)是轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮功能所必需的。將“誘餌”與Gal4(酵母半乳糖代謝調(diào)控系統(tǒng)中的一種反式作用因子)的DB結(jié)構(gòu)域融合,“獵物”與Gal4的AD結(jié)構(gòu)域的酸性區(qū)域融合,通過(guò)對(duì)報(bào)道基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè),可判別作為“誘餌”和“獵物”的兩個(gè)蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用。在研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能特點(diǎn)、作用方式過(guò)程中,有時(shí)還要通過(guò)突變、加抑制劑等手段破壞蛋白質(zhì)間的相互作用。針對(duì)實(shí)際工作中的這種需要,人們進(jìn)一步發(fā)展出了逆雙雜交系統(tǒng)。對(duì)酵母的蛋白質(zhì)間的相互作用分析主要有兩種策略。一是陣列篩選法(Arrayscreening)。將表達(dá)不同“獵物”蛋白的酵母單克隆分別加在微滴定板上,與帶有不同的“誘餌”蛋白的酵母株一一接合形成二倍體細(xì)胞?！矮C物”蛋白與“誘餌”蛋白的相互作用通過(guò)報(bào)道基因的表達(dá)而被鑒定。另一種方法是文庫(kù)篩選法(Libraryscreening)。該方法與前一種方法的區(qū)別是將表達(dá)“獵物”蛋白的酵母細(xì)胞混在一起構(gòu)成文庫(kù),再將這個(gè)文庫(kù)分別與表達(dá)不同“誘餌”蛋白質(zhì)的酵母細(xì)胞接合,再進(jìn)一步篩選陽(yáng)性克隆,即“誘餌”與“獵物”發(fā)生相互作用的克隆。相比之下,陣列篩選法更為有效,而文庫(kù)篩選法的長(zhǎng)處是通量大。1.3.2噬菌體過(guò)柱的性質(zhì)將編碼噬菌體的外殼蛋白基因上連上一個(gè)單克隆抗體的基因序列。當(dāng)噬菌體生長(zhǎng)時(shí),表面就會(huì)表達(dá)出相應(yīng)的單抗。將噬菌體過(guò)柱,由于柱上含目的蛋白,會(huì)特異性結(jié)合相應(yīng)抗體。同酵母雙雜交系統(tǒng)相比,噬菌體展示技術(shù)同樣具有簡(jiǎn)便、高通量的優(yōu)點(diǎn),不同的是,反應(yīng)在溶液中進(jìn)行,而不是在酵母細(xì)胞核中。另外,由于有些蛋白質(zhì)本身有激活轉(zhuǎn)錄活性,不經(jīng)過(guò)雙雜交相互作用就能激活報(bào)道基因的表達(dá),因此酵母雙雜交系統(tǒng)不適用。而噬菌體展示能很好的解決這個(gè)問(wèn)題。1.3.3等離子體共振spr法目前,表面等離子體共振(SurfacePlasmonResonance)技術(shù)已成為當(dāng)今研究蛋白質(zhì)之間相互作用的一種新的手段。典型的代表是瑞典的BIACORE的單元蛋白質(zhì)芯片。表面等離子體共振SPR技術(shù)通常是將“誘餌”蛋白作為配基,固化在幾十納米厚的金屬(金、銀等)膜表面,加入含“獵物”蛋白的溶液。若“誘餌”蛋白與“獵物”蛋白之間存在相互作用,則會(huì)特異性結(jié)合形成蛋白質(zhì)復(fù)合物。兩者的結(jié)合將使金屬膜與溶液界面的折射率上升,從而導(dǎo)致共振角度改變。由此,可以檢測(cè)出蛋白-蛋白之間的相互作用。SPR技術(shù)的特點(diǎn)是不需標(biāo)記物或染料,測(cè)定快速、安全。除應(yīng)用于蛋白-蛋白外,還可靈敏檢測(cè)蛋白-核酸及其它生物大分子之間的相互作用。SPRDNA生物傳感器可用于基因突變的檢測(cè)、PCR產(chǎn)物的測(cè)定以及病毒和其他微生物的檢測(cè)等方面的研究。2蛋白質(zhì)組學(xué)研究檢測(cè)方面的發(fā)展隨著大量DNA序列數(shù)據(jù)的不斷涌現(xiàn),人們意識(shí)到僅僅靠基因組的序列來(lái)試圖闡明生命現(xiàn)象是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。一個(gè)細(xì)胞通常依賴許多代謝調(diào)節(jié)途徑,而其主要執(zhí)行者是蛋白質(zhì)?；蚺c蛋白質(zhì)之間并不存在嚴(yán)格的一一對(duì)應(yīng)的線形關(guān)系?；蚪M中開(kāi)放閱讀框的存在并不意味著功能基因的存在。生物信息學(xué)準(zhǔn)確預(yù)測(cè)基因及推測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的成功率仍然不高。另外,mRNA水平與蛋白質(zhì)含量不一定呈正相關(guān),蛋白質(zhì)的修飾加工、細(xì)胞定位,都只能在蛋白質(zhì)水平上研究。因此,注解基因組的最好方法就是從蛋白質(zhì)水平出發(fā)。蛋白質(zhì)組學(xué)研究的一大特色是,從一開(kāi)始就呈現(xiàn)出基礎(chǔ)研究與實(shí)際應(yīng)用并駕齊驅(qū)的趨勢(shì)。許多實(shí)驗(yàn)室、公司和藥廠很早就開(kāi)始進(jìn)行與應(yīng)用有關(guān)的蛋白質(zhì)組研究。目前,蛋白質(zhì)組技術(shù)已用于肝癌、膀胱癌、前列腺癌等研究中。美國(guó)國(guó)立腫瘤研究所(NationalCancerInstitute)最近還建立了人類腫瘤基因索引(HumanTumorGeneIndex)。另外,生物信息學(xué)的迅猛發(fā)展使得依據(jù)基因組序列分析預(yù)測(cè)病原微生物中的疫苗候選基因成為可能。如今,許多制藥公司利用蛋白質(zhì)組技術(shù)快速鑒定這些基因表達(dá)產(chǎn)物,來(lái)輔助基因組學(xué)篩選疫苗。蛋白質(zhì)芯片技術(shù)提高了蛋白質(zhì)鑒定的速度與重復(fù)性。目前已用于某些疾病的蛋白質(zhì)分子標(biāo)記的檢測(cè),如阿爾茨海默氏病(進(jìn)行性老年性癡呆)和子宮癌。我國(guó)關(guān)于蛋白質(zhì)組研究的國(guó)家自然科學(xué)基金重大項(xiàng)目從1999年起開(kāi)始啟動(dòng)。隨著對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)研究的不斷深入,將為我國(guó)重大疾病機(jī)理闡明、基因功能研究、分子診斷和新藥開(kāi)發(fā)提供重要的理論基礎(chǔ),把學(xué)科建設(shè)的基礎(chǔ)性研究與滿