13-1i抗vegfmcab的制備及免疫活性研究

腫瘤血管生長與腫瘤提供血液和氧氣。這是腫瘤生長、浸潤和轉(zhuǎn)移的重要組成部分。血管內(nèi)皮生長因子/血管通透性因子(Vascularendothelialgrowthfactor/vascularpermeabilityfactor,VEGF/VPF)是血管生成過程中的中心環(huán)節(jié)。VEGF以旁分泌方式作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞,促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷徙,誘導(dǎo)新生血管的形成。以抗血管生成進(jìn)行實(shí)體瘤的診斷與治療是一種腫瘤診治新思路。應(yīng)用抗VEGFMcAb針對瘤體內(nèi)VEGF誘導(dǎo)的血管生成進(jìn)行腫瘤免疫治療,國內(nèi)外多有報(bào)道。但以放射性核素標(biāo)記抗VEGFMcAb作為顯像劑進(jìn)行腫瘤放射免疫顯像診斷的相關(guān)研究尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用核醫(yī)學(xué)技術(shù),在體外合成131I-抗-VEGFMcAb(sc-7269)并鑒定其免疫學(xué)活性,探討將其應(yīng)用于放射免疫顯像(Radioimmunoimaging,RII)的可行性。1材料和方法1.1材料表面1.1.1細(xì)胞T24細(xì)胞為浸潤性人膀胱癌細(xì)胞系,胞漿內(nèi)高水平表達(dá)VEGF。人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞。1.1.2不含氟酸鈉nf鼠抗人、鼠VEGFMcAb(sc-7269):SantaCruz公司;Na131I:中國原子能研究院(無還原劑、無載體);Iodogen(四氯二苯基甘脲):美國Sigma公司;SephadexG-50:瑞士Pharmacia公司。1.1.3主要設(shè)備CO2培養(yǎng)箱:美國Shel、Lab公司生產(chǎn);FH463A自動(dòng)定標(biāo)器:北京核儀器廠;RM905放射性活度計(jì):中國計(jì)量科學(xué)研究所。1.2方法1.2.1產(chǎn)第1i-sc-72691.2.1.膜法分離標(biāo)記物的制備采用Iodogen法標(biāo)記sc-7269:將100μgIodogen溶解于100μl氯仿溶液中制成Iodogen溶液;取15μlIodogen溶液置于乙烯子彈頭離心管中,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后在試管底部內(nèi)壁形成一層均勻的氯甘脲膜;在涂有Iodogen15.0μg的試管中依次加入0.5mol/L、pH7.6的磷酸鹽緩沖液100μl,sc-726935.0μg,Na131I92.5MBq,充分混勻后在室溫下反應(yīng)15min,其間溫和地震蕩數(shù)次,加入1%KI50.0μl終止反應(yīng)。反應(yīng)液滴加于預(yù)先經(jīng)PBS(10mmol/L、pH7.4)平衡、2%牛血清白蛋白液淋洗飽和的SephadexG-50層析柱上,用10mmol/L、pH7.4的PBS洗脫層析柱,通過自動(dòng)部分收集器收集洗脫液,流速每管1.0ml/3min,共收集60管,每管取10.0μl,在FH463A自動(dòng)定標(biāo)器上分別進(jìn)行放射性測量(cpm值),以試管編號為橫坐標(biāo),對應(yīng)各管的cpm值為縱坐標(biāo),繪制洗脫曲線。標(biāo)記產(chǎn)物的標(biāo)記率、放射濃度按下列公式計(jì)算:標(biāo)記物的紙層析:取分離純化后標(biāo)記產(chǎn)物(131I-sc-7269)5.0μl,在層析濾紙距一端0.5cm處中央點(diǎn)樣(新華3#濾紙,長20cm,寬3.0cm),點(diǎn)樣時(shí)要求點(diǎn)樣范圍直徑不能超過0.5cm,用正丁醇∶醋酸∶水=4∶1∶5的展開劑進(jìn)行上行層析15.0cm左右,層析時(shí)間約為3h,層析完畢后將層析濾紙于室溫下晾干,自原點(diǎn)起將層析濾紙剪成長各0.5cm的30張紙片。將紙片按順序分別置于FH463A自動(dòng)定標(biāo)器上測放射性計(jì)數(shù),繪制紙片編號—計(jì)數(shù)曲線。1.2.1.標(biāo)記產(chǎn)物的放射性測定標(biāo)記產(chǎn)物131I-sc-7269放射化學(xué)純度的測定:三氯醋酸法從蛋白峰(標(biāo)記產(chǎn)物131I-sc-7269)收集液中,取10.0μl標(biāo)記產(chǎn)物于試管內(nèi),加入100μl2%牛血清白蛋白液充分混勻,加入15%三氯醋酸液三滴混勻,立即測總放射性(A),離心1500r/min×5min后棄上清液,測沉淀放射性(B),按下列公式計(jì)算標(biāo)記產(chǎn)物的放射化學(xué)純度及游離碘率:131I-sc-7269比活度的測定:蛋白峰收集液應(yīng)用RM905放射性活度計(jì)測量標(biāo)記產(chǎn)物的活度,根據(jù)投入的抗體的總化學(xué)量計(jì)算比活度或按下列公式計(jì)算:蛋白峰收集液過濾除菌后用于下一步實(shí)驗(yàn)。1.2.2細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞的提取以臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞作為對照進(jìn)行131I-sc-7269的免疫活性鑒定。常規(guī)培養(yǎng)的T24細(xì)胞、臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞,用DMEM完全培養(yǎng)液制備細(xì)胞懸液,調(diào)至細(xì)胞濃度1×106/ml,兩種細(xì)胞各分裝入6孔培養(yǎng)板中的3孔(每孔1×106/ml)。每組細(xì)胞中分別加入131I-sc-7269(105cpm),搖勻后常規(guī)培養(yǎng),每2h振蕩一次,12h后將每孔的上清液移入試管,0.25%胰蛋白酶消化T24細(xì)胞與臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞,將細(xì)胞移入裝有相應(yīng)上清液的試管,在FH463A自動(dòng)定標(biāo)器上測定每管的總放射性。1000r/min離心5min,去上清液,沉淀用PBS洗滌3次,最后測沉淀放射性。按下式計(jì)算131I-sc-7269與細(xì)胞結(jié)合率:2結(jié)果2.1標(biāo)記結(jié)果及放化純度Iodogen法碘化標(biāo)記McAb(sc-7269),經(jīng)SephadexG-50柱層析分離純化,131I-sc-7269蛋白峰出現(xiàn)在第4管,游離碘峰出現(xiàn)在第10～14管。131I分兩次用Iodogen法標(biāo)記總量為35.0μg的sc-7269。標(biāo)記產(chǎn)物采用新華濾紙行紙層析,根據(jù)公式計(jì)算其標(biāo)記率為27.46%,比活度為1.02MBq/μg。三氯醋酸法測定平均放化純度為96.20%。兩次標(biāo)記的蛋白峰收集液共2.0ml,其平均放射濃度為18.30MBq/ml。2.2皮膚因子檢測經(jīng)體外結(jié)合分析,131I-sc-7269與T24細(xì)胞結(jié)合率達(dá)59.12%,而與對照細(xì)胞人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合率僅為7.16%(P<0.001)。標(biāo)記物在4℃保存7d后與T24和人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞體外結(jié)合率分別為56.31%、7.42%,與標(biāo)記后即時(shí)比較二者差異無顯著性(P>0.05)。說明:①本實(shí)驗(yàn)標(biāo)記的131I-sc-7269保持有良好的免疫結(jié)合活性;②131I-sc-7269于4℃保存具有較好的穩(wěn)定性;③131I-sc-7269與T24細(xì)胞呈特異性結(jié)合。3碘化標(biāo)記的鑒定蛋白質(zhì)多肽的碘化標(biāo)記可分為直接法和間接法,在實(shí)際工作中多采用前者:以NaI形式提供的I-在氧化劑的作用下被氧化形成中間活性形式,然后再標(biāo)記到蛋白質(zhì)多肽分子的酪氨酸殘基的苯環(huán)上(酚羥基的部位)。鼠抗人、鼠VEGFMcAb(sc-7269)系免疫球蛋白IgG2α,本實(shí)驗(yàn)采用1,3,4,6-四氯3α,6α-二苯苷脲即Iodogen法對其進(jìn)行碘化標(biāo)記。Iodogen氧化131I使sc-7269分子發(fā)生碘化反應(yīng),碘化反應(yīng)以后用SephadexG-50分離純化,除去游離碘與其它放射性雜質(zhì),收集標(biāo)記產(chǎn)物蛋白峰洗脫液。碘標(biāo)記率為27.46%,G-50分離純化后標(biāo)記產(chǎn)物的放化純度>95%。標(biāo)記產(chǎn)物的比活度為1.02MBq/μg。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致?？贵w的同位素標(biāo)記技術(shù)中最重要的是要保持標(biāo)記復(fù)合物的生物、免疫學(xué)活性,否則即使標(biāo)記工作做得再好也無法將標(biāo)記抗體應(yīng)用于下一步的實(shí)驗(yàn)或臨床領(lǐng)域。在蛋白質(zhì)、多肽的幾種碘化標(biāo)記法中Iodogen法的標(biāo)記反應(yīng)比較溫和。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明抗-VEGFMcAb(sc-7269)經(jīng)碘化標(biāo)記以后基本保持了原有的免疫學(xué)活性,131I-sc-7269與人膀胱癌T24細(xì)胞結(jié)合率明顯高于人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(59.12%vs7.16%,P<0.001)。標(biāo)記產(chǎn)物在4℃保存1周后其免疫學(xué)活性無明顯改變,其與T24細(xì)胞結(jié)合率為56.31%,與標(biāo)記后即時(shí)比較差異無顯著性(P>0.05)?？傊?McAb(sc-7269)在Iodogen法碘化標(biāo)記后能較好地保留其免疫學(xué)活性。VEGF在新生血管的形成過程發(fā)揮著舉足