應用大規(guī)模并行基因組測序技術檢測孕婦外周血漿中的游離dna

胎兒染色體非整體疾病包括21-三體綜合征（唐綜合征）、18-三體綜合征（德華綜合征）、13-三體綜合征（帕特綜合征）等。唐氏綜合征又稱先天愚型或21-三體綜合征,是新生兒常見的染色體病,發(fā)生率約為1/800,占小兒三體型染色體病的70%~80%,發(fā)生率隨著母親年齡的增高而上升。傳統(tǒng)的產(chǎn)前診斷方法是通過獲取胎兒的絨毛、羊水、臍血或者胎兒的組織來進行診斷,這些侵襲性的產(chǎn)前診斷技術對胎兒和孕婦有一定的風險,可以導致宮內(nèi)感染、流產(chǎn)等不良后果,難以被廣大孕婦和家庭所接受,所以無創(chuàng)產(chǎn)前診斷成為一個長期追求目標。1997年Lo等研究報道了孕婦的血液循環(huán)中有cff-DNA的存在,后來有研究也報道發(fā)現(xiàn)孕婦血漿中存在胎兒核糖核酸(RNA),這些重大發(fā)現(xiàn)為無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷提供了新的可能。近年來無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷也取得了巨大的發(fā)展,胎兒游離細胞已經(jīng)成功地應用于非侵入性產(chǎn)前診斷胎兒性別和Rh血型鑒定,這些研究的基礎都是對母體血漿中胎兒特定DNA序列的測定。但是在孕婦外周血中母源性游離DNA占絕對優(yōu)勢,胎兒游離DNA只占孕婦血漿總DNA約3%~5%,所以傳統(tǒng)的DNA提取技術及PCR等方法難以對胎兒唐氏綜合征進行準確的判斷。本研究成功地解決了21-三體、18-三體胎兒母體外周血中DNA小增量的問題,這種方法可以快速、簡便、安全地診斷胎兒染色體非整倍體,具有較高的臨床應用價值。1材料和方法1.1唐氏綜合征篩查風險情況選擇2009年1月至2010年7月在深圳市人民醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心就診,高齡妊娠、唐氏綜合征生化篩查高風險和(或)彩超顯示胎兒異常等同意介入產(chǎn)前診斷的孕婦941例,孕齡為8~30周,平均(20.7±3.2)周,孕婦年齡21~45歲,平均(30.8±5.5)歲。獲得每個參與者的知情同意后抽取外周靜脈血5mL。1.2實驗方法1.2.1血清學離心在孕婦進行羊水穿刺或臍血穿刺前抽取受試者外周靜脈血5mL,EDTA抗凝,在4℃下1600g離心10min,取上清懸浮液分裝到無菌離心管中,初步分離的血漿在4℃下再次離心,16000g離心10min,以去除殘留的細胞。這2次離心步驟是在采血后的4h內(nèi)進行。血漿存放-80℃冰箱進一步凍存,而且只能在DNA提取前解凍1次。1.2.2dna的提取使用TIANampMicrokit試劑盒(天根生化科技有限公司)從樣本血漿中提取DNA,嚴格按照說明書操作。提取過程中應設置陰性對照和重復對照。提取后的DNA在-80℃條件下保存。1.2.3pcr產(chǎn)物的純化及測序提取的血漿DNA,應用T4DNA聚合酶(T4DNAPolymerase)、克列諾片段(KlenowFragment)和T4多聚核苷酸激酶(T4PNK)對片段末端進行修復。在3′端加堿基“A”使得DNA片段與5′端帶有“T”堿基的特殊接頭連接。通過PCR技術擴增兩端帶有接頭的DNA片段并對PCR產(chǎn)物進行純化。使用Agilent2100Bioanalyzer檢測文庫大小及產(chǎn)量,并使用Q-PCR檢測文庫產(chǎn)量。定量好的文庫通過與flowcell上的接頭進行雜交,在Illuminaclusterstation通過橋式PCR進行擴增長成cluster,cluster長好后在IlluminaGenomeAnalyzer上進行測序。1.3新生兒患唐氏綜合征、18-三體的覆蓋深度本研究使用IlluminaHiSeq2000高通量測序儀檢測,將孕婦血中所有游離DNA,不論其來源全部進行測序,獲得分布在每條染色體上的真實的核酸片段數(shù)量,根據(jù)生物信息學分析,計算出每條染色體對應的覆蓋深度值,并轉(zhuǎn)化為衡量風險的風險指數(shù),確定胎兒患唐氏綜合征、18-三體的風險率。測試樣本中染色體NDNA所占總DNA比例可以表示為:覆蓋深度Cov-chrN。通過華大基因自主研發(fā)的GC關聯(lián)T檢驗方法檢測測試樣本中覆蓋深度CovchrN與標準參照樣的覆蓋深度Cov-chrN是否有顯著性差異來判斷胎兒是否為唐氏綜合征或18-三體綜合征,統(tǒng)計檢驗的值為T值,T值的計算:與孕整倍體胎兒母體血漿中chr21或chr18的關聯(lián)T均值和標準差相比較,孕21-三體胎兒的孕婦血漿中chr21的T值較高,孕18-三體胎兒的孕婦血漿中chr18的T值增高。1.4診斷方法1.4.1基因組的制備及測序由深圳華大基因研究院、深圳華大臨床檢驗中心進行DNA提取、文庫制備以及并行基因組測序。測試樣本的chr21的T值≥3即判定胎兒為唐氏綜合征高風險,測試樣本的chr18的T值≥3即判定胎兒為18-三體綜合征高風險。1.4.2胎兒染色體的核型診斷方法941例孕婦均采集羊水或者臍血,由深圳市人民醫(yī)院臨床醫(yī)學研究中心細胞遺傳室經(jīng)細胞培養(yǎng),進行G顯帶染色體核型分析。2結(jié)果2.1唐氏綜合征風險程度t值結(jié)果見圖1。941例樣本根據(jù)實驗方法處理進行測序后,計算T值范圍是-3.8300~11.7297,平均T值為(0.0080±1.6231)。其中27例樣本chr21的T值≥3判定胎兒為唐氏綜合征高風險,914例樣本chr21T值<3判定胎兒為非唐氏綜合征;14例chr18的T值≥3,判定胎兒為18-三體綜合征高風險,927例樣本chr18的T值<3判定胎兒為非18-三體綜合征。2.2唐氏綜合征非唐氏綜合征941例孕婦羊水或者臍帶血染色體核型分析,其中唐氏綜合征25例,非唐氏綜合征916例;18-三體綜合征15例,非18-三體綜合征926例。2.3大規(guī)模聯(lián)合重組的結(jié)果與染色體核分析的結(jié)果進行了比較2.3.1置信區(qū)間25例唐氏綜合征高風險的樣本T值范圍為3.3927~11.7927,平均T值為(6.8717±2.3776),95%置信區(qū)間為(6.1813,7.5621);916例非唐氏綜合征的孕婦T值范圍為-3.8300~8.2814,平均T值為(-0.1814±1.1111),95%置信區(qū)間為(-0.2543,-0.1086),唐氏綜合征高風險T值和非唐氏綜合征95%置信區(qū)間T值無重疊。進行兩樣本均數(shù)比較t檢驗(t=-29.69,P<0.01),兩組總體均數(shù)的差別有統(tǒng)計學意義。2.3.2無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測結(jié)果由表1可見,大規(guī)模并行基因組測序結(jié)果和染色體核型分析結(jié)果比較,唐氏綜合征胎兒的檢出率為100%(25/25),漏診率為0,誤診率為0.22%(2/941),陽性預測值92.59%(25/27),陰性預測值100%(914/914)。941例樣本中,檢出18-三體高風險14例,18-三體低風險927例。通過公式計算,與臨床金標準方法——染色體核型分析相比(941例樣本中有15例為18-三體綜合征),統(tǒng)計分析顯示無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測18-三體胎兒的檢出率為93.33%(14/15),漏診率為6.67%(1/15)、誤診率為0。陽性預測值100%(14/14),陰性預測值99.89%(926/927)。2.4不同體胎兒檢出率結(jié)果見表3。941例孕婦樣本中最小孕周為8周,最大孕周為30周,結(jié)果分析提示21-三體胎兒檢出率為100%。表3中10例孕婦分別在不同孕周抽取外周靜脈血行大規(guī)模并行基因組檢測,經(jīng)配對t檢驗,得出t=-0.96,P=0.362,結(jié)果顯示同一孕婦不同孕周的兩次T值差異無統(tǒng)計學意義。3討論3.1分離后,胎兒游離dna的變化1997年Lo等在孕婦外周血中發(fā)現(xiàn)胎兒細胞和胎兒DNA的存在,為無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷開辟了新的途徑。孕婦外周血中的游離胎兒DNA之所以可以運用于無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷,是因為他們具備以下的幾個特點:孕婦血中胎兒游離DNA極為豐富,是孕婦血中胎兒細胞的970倍,母體外周血中游離胎兒DNA保留了父母的多態(tài)性位點信息,且生產(chǎn)以后會被迅速清除,平均半衰期為16.3min,大部分孕婦產(chǎn)后2h即檢測不到胎兒游離DNA的存在,使得本次妊娠的胎兒游離DNA水平不會受上次妊娠的影響。最近的研究發(fā)現(xiàn)了母體血漿中胎兒DNA和母體DNA之間的本質(zhì)差異,胎兒DNA分子一般短于母體DNA分子,并且有不同的甲基化模式,根據(jù)上述胎兒游離DNA的特點,研究者們一直致力于母體血漿中胎兒游離DNA在無創(chuàng)產(chǎn)前診斷中的應用,主要的方法基于多態(tài)位點差異的單點PCR、甲基化特異PCR、數(shù)字PCR等,目前這些技術已經(jīng)成功應用于胎兒性別及性連鎖疾病、RHD血型等疾病的檢測,但是這些技術大多數(shù)都是依賴于單核苷酸多態(tài)性,因此只能對于少數(shù)人群進行檢測,不能廣泛應用于臨床檢測。3.2抗混血染性基因檢測本研究采取大規(guī)模并行基因組測序法,其基本的理論依據(jù)為:以唐氏綜合征為例說明,孕婦外周血中存在胎兒游離DNA,孕21-三體胎兒的孕婦外周血中的21號染色體的游離DNA比例比孕正常胎兒孕婦的高。本研究檢測方法是將孕婦外周血漿中的所有的DNA片段,不論其來源全部進行高通量測序,并對測序結(jié)果進行生物信息分析,計算出胎兒患唐氏綜合征的風險率(chr21T值≥3,判定胎兒為唐氏綜合征)。2008年Fan等利用鳥槍法測序技術成功檢測出12例三體綜合征胎兒,其中包括9例21-三體,2例18-三體和1例13-三體。2008年Chiu等利用大規(guī)模并行基因測序技術檢測了28例孕婦外周血標本,其中14例唐氏綜合征胎兒和14例正常胎兒均被準確檢測。2010年Lo等研究表明對母親外周血中的胎兒游離DNA進行全基因測序是診斷胎兒染色體疾病的一種非侵入性的診斷。2011年Lun等報道運用大規(guī)模并行基因組測序法成功檢測出1例易位型21-三體。2011年Chiu等應用大規(guī)模并行基因組測序技術檢測753例唐氏篩查高風險的孕婦外周血,其中86例胎兒為唐氏綜合征高風險,與染色體核型進行比較分析,發(fā)現(xiàn)唐氏綜合征胎兒的檢出率為100%。本研究對941例孕婦外周血進行大規(guī)模并行基因組測序檢測,檢出27例胎兒唐氏綜合征高風險,914例胎兒唐氏綜合征低風險,唐氏綜合癥胎兒的檢出率為100%,漏診率為0,誤診率為0.22%(2/941)。大規(guī)模并行基因組測序技術不僅可以用于胎兒21-三體的檢出,同樣也適用于其他染色體非整倍體的檢出,如:18-三體、13-三體以及性染色體的異常等。2011年Chen等應用此方法對329例孕婦外周血DNA進行基因測序,檢測出25例13-三體和34例18-三體,最后得出13-三體和18-三體的檢出率分別是100%和91.9%。本研究941例樣本中,檢出18-三體高風險病例14例,18-三體低風險病例927例。與臨床金標準方法———染色體核型分析法相比(941例樣本中有15例為18-三體綜合征),統(tǒng)計分析顯示無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測18-三體的檢出率為93.33%、漏診率為6.67%、誤診率為0。本實驗中誤診的2例唐氏綜合征病例和漏診的1例18-三體綜合征均在實驗初期出現(xiàn),通過不斷改進生物信息學分析方法,提高了檢測精度,使臨床實驗階段的高通量基因測序結(jié)果更為準確。2例非唐氏綜合征樣本誤診為21-三體,其中1例染色體核型為47,XYY,1例染色體核型分析正常;1例18-三體綜合征漏診。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)除各種情況下引起的標本污染或者方法不當可以引起誤診外,母體血漿中胎兒DNA的量也是一個影響因素。母體血漿中胎兒DNA的量可能和胎盤的屏障有很大的關系,胎兒游離DNA主要來源于胎盤組織,少量來源于胎兒與母體的交換,如果胎盤屏障致使母體血漿中的胎兒DNA的量受到影響,如胎盤鈣化、胎盤發(fā)育不良、胎盤破損等,對檢測結(jié)果會產(chǎn)生影響,因此尚需繼續(xù)觀察并注意個體差異。另外一個原因可能由于XYY的Y染色體上有一小段21號染色體的易位,可引起測序結(jié)果出現(xiàn)假陽性。2011年Papageorgiou等提出利用胎兒特異甲基化DNA比例無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷唐氏綜合征,檢測孕婦外周血中孕正常胎兒和孕21-三體胎兒的差異甲基化區(qū)域DNA含量的比例,然后進一步進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,這種方法解決了本研究的局限性。通用的產(chǎn)前篩查方法是檢測與染色體非整倍體異常相關的因素,而不是直接檢測胎兒的實際染色體劑量,所以目前的唐氏綜合征篩查方案有5%的假陽性率,這些高風險的孕婦需要進行進一步侵入性產(chǎn)前診斷。如果將大規(guī)模并行基因組測序應用于臨床篩查,因其具有高度準確性,僅有1%的高危孕婦需要進行侵入性產(chǎn)前診斷,將大大地降低進行侵入性產(chǎn)前診斷的孕婦數(shù)量,降低孕婦的心理壓力。利用大規(guī)模并行基因組測序方法可以重新建立新的胎兒染色體非整倍體的產(chǎn)前篩查和無創(chuàng)產(chǎn)前診斷模式:(1)對于高齡妊娠、唐氏綜合征生化免疫篩查高風險等有產(chǎn)前診斷指征而又高度恐懼介入產(chǎn)前診斷手術的孕婦,可建議其在12~22周行大規(guī)模并行基因組測序檢測,若檢測結(jié)果為染色體非整倍體高風險,就必須再次書面建議孕婦行介入產(chǎn)前診斷;(2)在嚴格掌握適應證的前提下,孕婦可直接選擇大規(guī)模并行基因組測序檢測胎兒染色體非整倍體風險,對于染色體非整倍體高風險孕婦須書面建議介入產(chǎn)前診斷。本研究中,有1例孕婦唐氏綜合征篩查2次均為高風險,孕婦及家屬拒絕進行介入性產(chǎn)前診斷,經(jīng)過孕婦及家屬知情同意選擇做了本實驗。根據(jù)大規(guī)模并行基因組測序技術結(jié)果診斷胎兒為唐氏綜合征高風險,遂再次動員孕婦進行介入產(chǎn)前診斷,經(jīng)臍血細胞染色體核型證實胎兒為21-三體,予以選擇性流產(chǎn)