結(jié)核分枝桿菌抗原刺激后外周血單個(gè)核細(xì)胞干擾素釋放反應(yīng)

結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)（tst）是診斷核電站桿菌感染的方法之一，已經(jīng)過(guò)去了一個(gè)世紀(jì)。重要的缺點(diǎn)是無(wú)法識(shí)別節(jié)點(diǎn)性結(jié)構(gòu)性感染和卡介苗（bcg）的免疫接種。近年來(lái),一種新的體外γ干擾素(IFN-γ)釋放反應(yīng)對(duì)于結(jié)核性感染和結(jié)核病的診斷價(jià)值引起了研究者的廣泛關(guān)注。采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)或酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(ELISPOT)法定量檢出受檢者全血或外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)對(duì)結(jié)核分枝桿菌特異或非特異抗原體外IFN-γ釋放反應(yīng)。以結(jié)核分枝桿菌純蛋白衍生物(PPD)為抗原的QuantiFERON-TB試劑盒已在很多國(guó)家開始應(yīng)用,但不能區(qū)別結(jié)核分枝桿菌潛伏感染者和BCG接種者與非結(jié)核分枝桿菌感染者。比較基因組學(xué)研究發(fā)現(xiàn),有別于BCG和大多數(shù)環(huán)境分枝桿菌,結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌毒株基因組內(nèi)存在RD1區(qū)。少數(shù)分枝桿菌如堪薩斯分枝桿菌、恥垢分枝桿菌等存在不完整RD1區(qū)。結(jié)核分枝桿菌RD1區(qū)編碼一種非常重要的小分子量可溶性早期分泌抗原靶6000蛋白(ESAT6)。ESAT6是一重要的T淋巴細(xì)胞抗原,為結(jié)核性感染的動(dòng)物和人免疫活性T淋巴細(xì)胞識(shí)別并產(chǎn)生高水平的IFN-γ。體外IFN-γ釋放及其臨床意義的研究由此逐漸展開。38000抗原是一種磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,屬膜結(jié)合脂蛋白,一般認(rèn)為38000抗原存在體液免疫和細(xì)胞免疫決定簇,受到研究者普遍關(guān)注。Daniel等認(rèn)為38000抗原僅存在于結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌中,成為當(dāng)前結(jié)核病血清學(xué)抗體檢測(cè)中采用最為廣泛的抗原。何秀云等研究也證實(shí)38000可誘發(fā)豚鼠遲發(fā)超敏反應(yīng)。我國(guó)目前將體外IFN-γ用于結(jié)核性感染和結(jié)核病診斷的研究尚少見。我們擬通過(guò)本研究評(píng)價(jià)ESAT6、38000抗原在體外PBMC培養(yǎng)系統(tǒng)中IFN-γ釋放反應(yīng)對(duì)結(jié)核性感染和結(jié)核病的輔助診斷意義。對(duì)象和方法一、研究主題1.影像學(xué)及抗結(jié)核藥物療效選取北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所結(jié)核科結(jié)核病患者57例,均依據(jù)臨床表現(xiàn)、細(xì)菌學(xué)、影像學(xué)或抗結(jié)核藥物療效明確診斷,其中男41例、女16例,年齡(43±16)歲,其中肺結(jié)核30例(17例痰集菌涂片陽(yáng)性),肺外結(jié)核11例(痰集菌涂片均為陰性),肺內(nèi)合并肺外結(jié)核16例(痰集菌涂片均為陰性)。2.行政、后勤人員選取北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所工作人員27例,男9例、女18例,年齡(41±8)歲,均經(jīng)體檢證實(shí)為健康者。依照接觸排菌結(jié)核病患者密切程度分為4級(jí):1級(jí)為密切接觸者11例,在結(jié)核科病房、門診、放射科、細(xì)菌免疫室工作2年以上者,其中有卡痕者6例;2級(jí)為中等程度密切接觸者6例,在排菌結(jié)核病病房工作2年以下或未直接接觸結(jié)核病患者的行政、后勤人員工作滿5年者,其中有卡痕者2例;3級(jí)為7例未直接接觸結(jié)核病患者的行政、后勤人員工作不足5年者,其中有卡痕者2例;4級(jí)為3例來(lái)自邊遠(yuǎn)地區(qū)的新加入本所工作不滿1個(gè)月者,均無(wú)密切接觸史,有卡痕者1例。3.研究對(duì)象的一般資料選取北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所腫瘤科根據(jù)細(xì)胞學(xué)或病理組織學(xué)明確診斷的肺癌患者29例,男22例、女7例,年齡(55±13)歲,均尚未進(jìn)行抗腫瘤治療。以上所有研究對(duì)象均無(wú)艾滋病病毒(HIV)感染、妊娠、使用免疫抑制劑或增強(qiáng)劑、嚴(yán)重肝腎功能衰竭史。健康對(duì)照組及肺癌組均無(wú)陳舊性結(jié)核病病灶。二、方法1.血液樣本的收集所有患者均于入院后72h內(nèi)、腫瘤患者于化療前采肝素抗凝靜脈血5ml,健康對(duì)照組統(tǒng)一采血。2.病例對(duì)照和健康對(duì)照組采血后所有受檢者前臂皮內(nèi)注射標(biāo)準(zhǔn)PPDRT23制劑(北京高科生命科學(xué)技術(shù)公司)0.1ml(20個(gè)國(guó)際結(jié)素單位/ml)。健康對(duì)照組由北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所流行病研究室工作人員操作,結(jié)核組和腫瘤組由有經(jīng)驗(yàn)的護(hù)士操作。72h查驗(yàn)反應(yīng)結(jié)果,記錄硬結(jié)平均直徑。3.pha抑制pbmc產(chǎn)生ifn-者pbmc采用非特異性刺激原植物血凝素(PHA,美國(guó)Promega公司)作為陽(yáng)性對(duì)照,PHA不能刺激PBMC產(chǎn)生IFN-γ者除外。PPD抗原、ESAT6抗原由中國(guó)藥品生物制品檢定所王國(guó)治教授惠贈(zèng),38000抗原由北京第三○九醫(yī)院莊玉輝教授惠贈(zèng)。4.規(guī)劃對(duì)模型材料的制備采血后6h內(nèi)常規(guī)分離PBMC,用含10%胎牛血清和10%自體血漿的1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞數(shù)為每孔1×105,共5孔,根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果依次加入抗原,其終濃度為PHA10μg/ml、PPD20μg/ml、ESAT633μg/ml和38000抗原20μg/ml,第5孔為無(wú)抗原空白對(duì)照。各孔終體積為300μl。培養(yǎng)板置于5%CO2、相對(duì)濕度為95%的CO2溫箱內(nèi)37℃培養(yǎng)。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)并參考文獻(xiàn)確定培養(yǎng)時(shí)間為5d,收集培養(yǎng)上清液于-20℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?.空白對(duì)照孔的檢測(cè)采用法國(guó)Diclone公司商用IFN-γ檢測(cè)試劑盒,嚴(yán)格按照要求操作。該試劑盒IFN-γ檢測(cè)上限為400pg/ml,下限為5pg/ml。測(cè)量前需稀釋各抗原刺激培養(yǎng)上清液至適當(dāng)稀釋度:PHA和PPD培養(yǎng)上清液作100倍稀釋,ESAT6和38000抗原培養(yǎng)上清液作10～50倍稀釋?？瞻讓?duì)照孔檢測(cè)上清原液。鑒于ELISA檢測(cè)的批間差異較大,本研究采用同一批號(hào)試劑盒集中操作。為消除培養(yǎng)基內(nèi)含有10%自體血漿所致個(gè)體誤差,抗原刺激PBMC的IFN-γ釋放水平表達(dá)為:抗原IFN-γ釋放=抗原刺激孔IFN-γ檢測(cè)量-空白對(duì)照孔IFN-γ檢測(cè)量。6.tst與bcg接種史研究所有數(shù)據(jù)輸入計(jì)算機(jī),用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。健康對(duì)照組用Logistic回歸對(duì)TST與BCG接種史,排菌結(jié)核病患者接觸程度作逐步回歸分析。健康對(duì)照組不同抗原刺激后的IFN-γ釋放水平與密切接觸程度、BCG接種史作單因素方差分析和t檢驗(yàn)。不同抗原刺激后IFN-γ釋放水平的比較及健康對(duì)照組、結(jié)核組、肺癌組間IFN-γ釋放水平的比較作單因素方差分析。結(jié)果一、密切接觸程度與ppd皮試的相關(guān)性由于目前沒有診斷健康人結(jié)核性感染的金標(biāo)準(zhǔn),而根據(jù)常識(shí),與排菌結(jié)核病患者接觸越密切,被感染的機(jī)會(huì)越大,也就是成為感染者的可能性就越大,故本研究嘗試以接觸密切程度作為判斷健康人結(jié)核感染狀態(tài)的一個(gè)指標(biāo)。采用Logistic逐步回歸法分析健康對(duì)照組PPD皮試(TST)結(jié)果與密切接觸程度、BCG接種史的相關(guān)性。硬結(jié)平均直徑≥6mm取值為1,平均直徑<6mm取值為0。結(jié)果顯示:TST反應(yīng)與BCG接種史和密切接觸程度具有相關(guān)性(表1)。因此,PPD皮試顯然不能鑒別健康者的結(jié)核性感染狀態(tài)。將健康對(duì)照組3種抗原刺激后的IFN-γ釋放水平與BCG接種史、排菌患者密切接觸程度作單因素方差分析和t檢驗(yàn),結(jié)果見表2。采用吸光度(A)指數(shù)(AI=抗原孔A值/空白孔A值)進(jìn)一步分析,見表2。以上結(jié)果表明:僅ESAT6刺激PBMC后的IFN-γ釋放反應(yīng)可區(qū)別不同結(jié)核菌接觸密切程度,而不受BCG接種史的影響。即可以鑒別健康者的結(jié)核性感染狀態(tài),而不受BCG接種史的影響。二、肺癌組活性檢測(cè)由表3可見,3種抗原刺激PBMC釋放IFN-γ活性均顯示結(jié)核組最高,健康對(duì)照組次之,肺癌組最低。PPD皮試結(jié)果顯示健康組最高、結(jié)核組次之、腫瘤組最低,但組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。三、38受試者操作特性曲線由表3可見,PPD、ESAT6和38000抗原刺激后PBMCIFN-γ釋放反應(yīng)中僅38000抗原刺激中發(fā)現(xiàn)結(jié)核組和健康對(duì)照組之間IFN-γ釋放水平存在顯著差異。為此,我們繪制了所有113例樣本的受試者操作特性(receiveroperatingcharacteristic,ROC)曲線(圖1)。通過(guò)ROC曲線獲得最佳域值為1000pg/ml,以此為判斷,對(duì)結(jié)核病診斷的敏感性為64.9%(37/57),特異性為89.3%(50/56),準(zhǔn)確性為77.0%(87/113),陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為86.0%(37/43),陰性預(yù)測(cè)值為71.0%(50/70)。討論一、esat6抗體原實(shí)驗(yàn)和bcg接種的鑒別鑒于我國(guó)在新生兒中實(shí)施普遍接種卡介苗政策,干擾了PPD皮試方法進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌感染的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果的評(píng)價(jià)。研究發(fā)現(xiàn)ESAT6抗原為結(jié)核分枝桿菌特異性抗原,可區(qū)分BCG接種和結(jié)核分枝桿菌感染兩種免疫狀態(tài),并可鑒別結(jié)核分枝桿菌與牛分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌感染。本研究結(jié)果表明,與皮試結(jié)果一樣,PPD抗原體外刺激的IFN-γ釋放反應(yīng)同時(shí)受接觸程度和BCG接種的影響,而ESAT6抗原體外刺激PBMC釋放IFN-γ反應(yīng)可不受BCG接種的影響。因此,其鑒別結(jié)核性感染和BCG接種的能力優(yōu)于PPD抗原的皮試和IFN-γ釋放反應(yīng),可能發(fā)展成有助于評(píng)估結(jié)核分枝桿菌感染率和結(jié)核病控制措施效果的方法。國(guó)外研究者也得出相似的結(jié)論。另外ESAT6抗原刺激PBMC釋放的IFN-γ在結(jié)核組與健康對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但均顯著高于肺癌組。這種差異主要是由于健康對(duì)照組多為排菌結(jié)核患者接觸者,而肺癌組多無(wú)明確的接觸史。這也進(jìn)一步證實(shí)ESAT6抗原的體外IFN-γ釋放反應(yīng)對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染的診斷價(jià)值。由于本研究?jī)H以肺癌作為疾病對(duì)照,該結(jié)論尚需通過(guò)擴(kuò)大病種范圍進(jìn)一步證實(shí)。另外,IFN-γ檢測(cè)操作復(fù)雜,費(fèi)用昂貴,還需要繼續(xù)進(jìn)行臨床轉(zhuǎn)化研究。二、肺癌組和肺癌組間比較本研究結(jié)果顯示,TST結(jié)果硬結(jié)平均直徑在結(jié)核組、健康對(duì)照組及肺癌組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由于本研究所選樣本均為結(jié)核病醫(yī)院相關(guān)人員,因此大多數(shù)有被結(jié)核分枝桿菌感染的可能。這一結(jié)果的得出也就提示TST不能鑒別結(jié)核分枝桿菌感染與結(jié)核病。三、esat6抗原刺激pbmc釋放的ifn-差異雖然國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)與排菌患者密切接觸的健康人的PBMC經(jīng)ESAT6抗原刺激后分泌IFN-γ的細(xì)胞數(shù)明顯高于免疫功能顯著抑制的結(jié)核病患者。但本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),結(jié)核病患者和與之密切接觸的健康者之間,ESAT6抗原刺激后PBMC釋放的IFN-γ差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此,ESAT6抗原的IFN-γ釋放反應(yīng)無(wú)法鑒別診斷結(jié)核分枝桿菌感染和結(jié)核病免疫狀態(tài)。這種現(xiàn)象可以解釋為ESAT6抗原是結(jié)核分枝桿菌重要的T淋巴細(xì)胞活化抗原,很容易被處于結(jié)核性感染和臨床結(jié)核病發(fā)病的不同活化狀態(tài)的T淋巴細(xì)胞所識(shí)別,并快速產(chǎn)生高水平的IFN-γ。四、38臨床診斷指標(biāo)在PPD、ESAT6和38000三種抗原之間,僅38000抗原的PBMC釋放IFN-γ水平在結(jié)核組和非結(jié)