兩種抗生素對aamareneci01細(xì)胞生長、形態(tài)及毒素含量的影響

亞歷山大藻是一種廣泛分布的有毒甲藻。它是一種嚴(yán)重分布的有毒甲藻。據(jù)報道,亞歷山大藻中的很多種類能產(chǎn)生一種神經(jīng)類毒素———麻痹性貝毒(paralyticshellfishpoisoning,PSP)。目前對亞歷山大藻的產(chǎn)毒生理已有了較多的研究,但對PSP的來源還存在爭議,主要圍繞在有毒藻與細(xì)菌之間的關(guān)系展開的。藻-菌之間既存在營養(yǎng)依賴關(guān)系,又存在拮抗關(guān)系。早在20世紀(jì)80年代初期,Silva就提出甲藻內(nèi)共生細(xì)菌產(chǎn)毒的假說,認(rèn)為海洋細(xì)菌在有毒藻產(chǎn)毒過程中起著重要的作用。Kodama等1990年首次從有毒藻中分離出能獨(dú)立產(chǎn)PSP的maraxella細(xì)菌,但是產(chǎn)毒量低。此后,許多學(xué)者相繼從產(chǎn)毒亞歷山大藻中分離到能獨(dú)立產(chǎn)PSP的細(xì)菌但它們的產(chǎn)毒能力較低,且毒素組成與有毒藻也不盡相同。除自主產(chǎn)毒外,海洋共生細(xì)菌也可以影響有毒藻的產(chǎn)毒能力。因此一些學(xué)者試圖獲得無菌藻來探討PSP的來源。Doucette等采用溶菌酶和十二烷基硫酸鈉(SDS)作為除菌劑獲得無菌亞歷山大藻(A.lusitanicum),結(jié)果發(fā)現(xiàn),除菌后藻類產(chǎn)PSP的能力下降了大約50%,而加入產(chǎn)毒細(xì)菌(P.stutzeri)后藻的產(chǎn)毒能力基本恢復(fù)。而多數(shù)研究采用抗生素來作為除菌劑,Bates等研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)抗生素處理得到的幾株可產(chǎn)記憶缺失性貝毒(ASP)中軟骨藻酸(Domoicacid)的無菌尖刺擬菱形藻(Pseudo-nitzschiapungens),同自然帶菌藻相比,藻細(xì)胞生長正常,但產(chǎn)毒能力卻下降8~10倍。Uribe等2003年用青霉素和慶大霉素處理過的無菌鏈狀亞歷山大藻,產(chǎn)毒能力僅為帶菌藻的1/5,毒素分析后發(fā)現(xiàn)STX和GTX1,4均減少,但NeoSTX未減少。然而,抗生素對藻產(chǎn)毒的影響不盡一致,另有研究表明經(jīng)過抗生素處理的無菌藻株仍可以生產(chǎn)PSP毒素,且產(chǎn)量較含菌藻高。此外,有研究表明營養(yǎng)鹽也會影響藻產(chǎn)毒,盡管麻痹性貝毒分子中并不含有磷元素,但培養(yǎng)液中的磷限制卻顯著促進(jìn)毒素的合成。PSP究竟是由甲藻本身產(chǎn)生還是由甲藻內(nèi)的共生細(xì)菌產(chǎn)生有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。為了研究PSP來源,很多學(xué)者使用混合抗生素來試圖獲得無菌藻以排除藻共生細(xì)菌的干擾,但由于每種抗生素殺菌作用機(jī)理的不同和在某種程度上存在特異的藻-菌相互作用關(guān)系,使得結(jié)果分析存在一定困難。而本論文研究兩種常用抗生素(氨芐青霉素(Ampicillin,Amp)和新霉素(Neomycin,Nm))分別對亞歷山大藻A.tamarenseCI01的生長和產(chǎn)毒的影響,同時更側(cè)重于高濃度的抗生素對甲藻的影響,旨在為有毒藻產(chǎn)毒機(jī)理、藻-菌相互作用等方面的研究工作提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1生物保種中心研究用的藻種塔瑪亞歷山大藻A.tamarenseCI01由廈門大學(xué)近海海洋環(huán)境科學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室海洋微型生物保種中心(CCMBA)提供。A.tamarenseCI01的保存采用K-medium培養(yǎng)基。保種條件:溫度20℃,鹽度值33,光照強(qiáng)度4000lx和光暗周期14h:10h,保種用海水取自廈門港。1.2堿、腈、乙腈、超純水的制備研究所用抗生素和毒素分析采用的離子對試劑庚基磺酸鈉均購自Sigma公司,磷酸四丁基銨購自Fluka公司,乙腈為Merck公司生產(chǎn)的色譜純試劑,其它試劑均為分析純試劑。實(shí)驗(yàn)中的水為經(jīng)Millipore超純水系統(tǒng)生產(chǎn)的超純水。標(biāo)準(zhǔn)毒素C1,2購自加拿大國立研究院(NationalResearchCouncil)海洋生物研究所。1.3方法1.3.1體外細(xì)胞計數(shù)培養(yǎng)藻種初始細(xì)胞密度大約在2000cells/mL,按設(shè)定的濃度梯度分別加入不同種類和不同濃度的抗生素,培養(yǎng)10d。每天定時取1mL的樣品用于細(xì)胞計數(shù)。同時取10mL的藻液9000×g離心10min,收集后加入0.5mL50mmol/L的醋酸溶液進(jìn)行懸浮,各兩個平行樣。所收集的樣品保存在-20℃冰箱中,用于毒素提取和分析。1.3.2浮游植物群落穩(wěn)定性測定取1mL的藻液,加0.02mL的Lugol’s固定液固定,取0.1mL混合液鋪在浮游植物記數(shù)框上,在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行計數(shù)。計數(shù)結(jié)果取平均值。1.3.3藻細(xì)胞的毒素分析A.tamarenseCI01主要生產(chǎn)C1、C2、GTX2和GTX3毒素,其中以C1和C2為主,約占細(xì)胞總毒素的95%,而且C2是細(xì)胞中最主要的PSP毒素。因此本實(shí)驗(yàn)用C2含量變化來反映總毒素的變化趨勢。取上述保存在-20℃的藻細(xì)胞懸浮液,采用超聲破碎儀(Model450Branson公司,美國)破碎細(xì)胞,功率20W,破碎時間2s,間隙3s,冰浴冷卻。顯微鏡下檢查藻細(xì)胞破碎情況,直至樣品中的細(xì)胞完全破碎為止。然后12000×g離心30min,取上清液進(jìn)行毒素分析(Angillen1100高效液相色譜)。PSP的分析采用Oshimaetal.(1989)建立的,后經(jīng)Andersonetal(1996)修改的高效液相色譜柱后衍生法。C類毒素分析用洗脫液為2mmol/L的磷酸四丁基銨溶液(pH6.0),氧化劑均為含有7mmol/L高碘酸的50mmol/L磷酸氫二鉀緩沖液(pH9.0)。酸化劑是0.5mol/L的乙酸溶液。洗脫液流速為0.8mL/min,氧化劑和酸化劑的流速為0.4mL/min。柱溫是室溫,衍生反應(yīng)溫度是80℃。1.3.4陳海水淡化2216E固體培養(yǎng)基:15g瓊脂,蛋白胨5g,酵母膏1g,磷酸高鐵0.1g,陳海水1000mL,pH7.6。取加入抗生素后第1﹑3﹑5﹑7﹑9天的藻液,稀釋到適當(dāng)濃度(涂布藻液的最佳稀釋倍數(shù)由預(yù)試驗(yàn)確定),0.1mL涂布2216E瓊脂,每種涂布3個平板,密封平板,25℃,14h:10h弱光照射恒溫培養(yǎng),觀察菌落數(shù)。1.3.5磷酸測定采用鉬藍(lán)分光光度法測定海水中的可溶性磷酸鹽。2結(jié)果與討論2.1繼續(xù)培養(yǎng)反應(yīng)時間對藻細(xì)胞生長的影響由圖1可以看出,當(dāng)Nm濃度低于1000μg/mL時對藻細(xì)胞的生長沒有影響,甚至還有促進(jìn)作用。同時發(fā)現(xiàn)經(jīng)Nm處理的藻細(xì)胞有成鏈現(xiàn)象,以兩個細(xì)胞形成的鏈居多,也有三、四個細(xì)胞鏈,張冬寶等也報道了這一現(xiàn)象。隨著Nm濃度的進(jìn)一步增加(>1000μg/mL),與空白對照組相比處理組藻密度的增長速度受到抑制,當(dāng)處理組濃度增加到Nm2000μg/mL時藻密度經(jīng)過8d的培養(yǎng)后沒有增加。圖2表明Amp促進(jìn)了藻細(xì)胞的生長,盡管在高濃度(2000μg/mL)組的培養(yǎng)前期細(xì)胞密度增長速度受到輕微影響。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)低濃度Amp處理藻細(xì)胞有變小現(xiàn)象,當(dāng)濃度較高時由于細(xì)胞膜與液胞膜的半透性,引起藻細(xì)胞壁內(nèi)外滲透壓不一樣,細(xì)胞液脫水而導(dǎo)致其發(fā)生質(zhì)壁分離現(xiàn)象(如圖3c),濃度增加到Amp2000μg/mL時,部分藻細(xì)胞壁脫落形成原生質(zhì)體(如圖3d)。根據(jù)上述研究結(jié)果,加入2000μg/mLAmp后,雖然A.tamarenseCI01藻細(xì)胞與空白對照組相比出現(xiàn)嚴(yán)重的質(zhì)壁分離現(xiàn)象,但還是能促進(jìn)藻的生長。同時1500μg/mLNm是實(shí)驗(yàn)中不使藻致死的最大濃度,因此選定1500μg/mLNm和2000μg/mLAmp作為進(jìn)一步研究的濃度來研究藻體內(nèi)毒素是否受到影響,同時監(jiān)測藻液中細(xì)菌密度變化和磷酸鹽濃度變化。2.2抗生素的影響從圖4能更明顯的看出加入2000μg/mLAmp和1500μg/mLNm后的藻細(xì)胞經(jīng)過長短不一的潛伏期后才進(jìn)入指數(shù)生長期,2000μg/mLAmp雖然導(dǎo)致一些藻細(xì)胞發(fā)生了質(zhì)壁分離現(xiàn)象,但并沒有影響到藻細(xì)胞的最高密度。藻液中細(xì)菌密度變化(圖5):空白對照組藻液中的細(xì)菌密度在培養(yǎng)初期由于新鮮培養(yǎng)基提供足夠的營養(yǎng)迅速增加;當(dāng)藻處于指數(shù)生長期時由于藻分裂生長快和細(xì)菌競爭營養(yǎng)導(dǎo)致細(xì)菌密度下降;而當(dāng)藻處于平穩(wěn)期時,一些藻細(xì)胞死亡又給細(xì)菌帶來了營養(yǎng),細(xì)菌開始大量繁殖。而抗生素處理組的藻液中由于抗生素殺菌作用細(xì)菌數(shù)量較少(在圖中幾乎和X軸平行)。由于Nm和Amp的殺菌機(jī)理不同,Nm是由新霉素鏈霉菌(Streptomycesfradiae)產(chǎn)生的氨基糖苷類抗生素,主要與細(xì)菌核糖體30s亞基結(jié)合,抑制細(xì)菌合成蛋白質(zhì)。對G+和G-均有抑制作用。Amp作用機(jī)理是破壞細(xì)菌細(xì)胞壁四肽側(cè)鏈和五肽橋的結(jié)合而阻礙細(xì)胞壁合成而發(fā)揮殺菌作用,對G+有效,對G-作用不大。在實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)同濃度下Amp沒有Nm的殺菌作用效果好。從圖6和圖7中可以看出,加入抗生素后,從整體趨勢看無論是單位水體藻毒素含量還是藻細(xì)胞毒素含量都要低于空白對照組,空白對照組在培養(yǎng)的第9天細(xì)胞中C2含量達(dá)到41.93fmol/cell,而經(jīng)1500μg/mLNm處理9天的A.tamarenseCI01的細(xì)胞中C2含量為22.93fmol/cell,經(jīng)2000μg/mLAmp處理9天后的細(xì)胞C2含量則為29.69fmol/cell,僅為對照組細(xì)胞毒素含量的40%~50%。該結(jié)果表明,Nm和Amp能抑制A.tamarenseCI01細(xì)胞中毒素的合成,且Nm抑制作用更顯著。結(jié)合抗生素的殺菌作用(圖5)和抗生素對藻產(chǎn)毒的影響(圖6和圖7),可以看出藻細(xì)胞毒素含量和細(xì)菌存在一定的關(guān)系。抗生素加入后,藻培養(yǎng)液中細(xì)菌數(shù)量急劇下降同時藻產(chǎn)毒能力也降低了。Doucette等研究發(fā)現(xiàn)了某些細(xì)菌可以促進(jìn)藻產(chǎn)毒,產(chǎn)毒細(xì)菌(P.stutzeri)加入到無菌亞歷山大藻(A.lusitanicum)后結(jié)果發(fā)現(xiàn),藻的產(chǎn)毒能力基本恢復(fù)。筆者認(rèn)為:抗生素的加入有可能殺死了促進(jìn)藻產(chǎn)毒的細(xì)菌,或者殺死了能產(chǎn)毒的細(xì)菌從而導(dǎo)致藻產(chǎn)毒能力下降。同時海洋中也存在能削弱藻產(chǎn)毒細(xì)菌,由于每種抗生素和細(xì)菌特效性,以及在某種程度上存在的特異的藻-菌相互作用關(guān)系,因此有些學(xué)者研究經(jīng)抗生素處理的無菌藻株仍可以生產(chǎn)PSP毒素,且產(chǎn)量較含菌藻高。由于并不是所有的藻內(nèi)共生菌均能在2216E營養(yǎng)瓊脂平板上生長,本研究在抗生素除菌檢驗(yàn)環(huán)節(jié)中分離出幾株藻際共生細(xì)菌,但并沒有在其內(nèi)檢測出PSP毒素,可是不能說明藻液中不存在能產(chǎn)毒的細(xì)菌,特定抗生素脅迫下的特定菌株和有毒藻產(chǎn)毒之間的關(guān)系還有待于進(jìn)一步深入研究。本研究同時檢測了藻液中磷酸鹽的變化(圖8),經(jīng)1500μg/mLNm處理的A.tamarenseCI01在加入Nm的第2天后培養(yǎng)液中的磷酸鹽含量有明顯升高,而經(jīng)2000μg/mLAmp處理過的藻液中磷酸鹽含量和空白對照組相比并沒有多大變化。導(dǎo)致這一現(xiàn)象的具體原因還不是很清楚,Nm對藻的脅迫作用使藻細(xì)胞生理發(fā)生變化,可能影響了細(xì)胞內(nèi)磷酸鹽代謝途徑,從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)磷酸鹽的釋放。由于Nm和Amp殺菌機(jī)理不同,Amp處理過的藻液中磷酸鹽含量和空白對照組相比并沒有多大變化。但是Amp處理過的藻液藻細(xì)胞會發(fā)生質(zhì)壁分離現(xiàn)象,甚至細(xì)胞壁脫落形成原生質(zhì)體,表明藻細(xì)胞生理也發(fā)生了變化。藻細(xì)胞生