神經(jīng)干細(xì)胞與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-3基因修飾雪旺細(xì)胞聯(lián)合對(duì)脊髓損傷大鼠的運(yùn)動(dòng)及神經(jīng)傳導(dǎo)功能修復(fù)的作用

急性脊柱損傷可導(dǎo)致截癱或四肢麻痹，通常發(fā)生在交通事故、體育損傷和傷傷事故后。目前，臨床治療方法尚不有效。脊髓損傷的主要問題是上、下行傳導(dǎo)神經(jīng)纖維束的斷裂，導(dǎo)致神經(jīng)傳導(dǎo)功能的喪失，最終導(dǎo)致?lián)p傷平面以下軀體感覺與運(yùn)動(dòng)功能障礙。隨著神經(jīng)學(xué)科的發(fā)展和對(duì)脊髓創(chuàng)傷機(jī)制研究的不斷深入，近年來人們進(jìn)行了大量有關(guān)促進(jìn)脊髓損傷后再生修復(fù)的探索。本研究室曾發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞（neuralstemcells,NSCs）或雪旺細(xì)胞(Schwanncells,SCs)移植對(duì)脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能的修復(fù)均有一定的作用。移植的NSCs能在損傷脊髓內(nèi)分化為神經(jīng)元，將替代因損傷而死亡的宿主神經(jīng)元，而SCs能分泌多種的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)類物質(zhì),NSCs和SCs移植均被認(rèn)為在脊髓損傷的治療中具有較好的前景。我們還利用基因重組腺病毒表達(dá)載體的方法獲得神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-3(neurotropin-3,NT-3）基因修飾的SCs，與未修飾SCs相比，NT-3基因修飾SCs不僅具有其固有的作用還能過量分泌NT-3，而NT-3被認(rèn)為在脊髓損傷修復(fù)中具有重要的作用。本研究將NSCs與NT-3修飾SCs聯(lián)合移植到大鼠全橫斷脊髓損傷處，探討其對(duì)受損傷脊髓的神經(jīng)傳導(dǎo)和后肢運(yùn)動(dòng)功能修復(fù)的作用，以期為臨床治療脊髓損傷提供新的治療策略。1材料和方法1.1懸浮液培養(yǎng)組采用dmem/fps選用出生1d—2d的SD新生鼠，在無菌條件下取出海馬及側(cè)腦室下區(qū)，剪碎后用0.25%胰蛋白酶消化并制成1×104/ml單細(xì)胞懸液，用含bFGF20ng/ml,B2720μl/ml的DMEM/F12無血清培養(yǎng)液進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。每2d進(jìn)行半量更換培養(yǎng)液，每次換液的同時(shí)更換培養(yǎng)瓶。7d—9d后將神經(jīng)干細(xì)胞球機(jī)械分離并進(jìn)行傳代，第2代培養(yǎng)7d—8d后，取少量神經(jīng)干細(xì)胞球用核熒光Hoechst33342(10μg/ml,DMEM/F12配制)標(biāo)記2h。1.2阿糖胞苷的培養(yǎng)、分離和傳代SD新生鼠消毒后取臂叢神經(jīng)和坐骨神經(jīng)，剝?nèi)ド窠?jīng)外膜，剪碎。用膠原酶和胰蛋白酶消化及200目濾器過濾后用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液制成1×104/ml細(xì)胞懸液，移入經(jīng)多聚賴氨酸鋪板的培養(yǎng)瓶，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。20min后將未貼壁的細(xì)胞移入另1培養(yǎng)瓶，再過20min重復(fù)1次。培養(yǎng)24h后在培養(yǎng)液中加入終濃度為10-5mol/L的阿糖胞苷作用12h，細(xì)胞每2—3d更換培養(yǎng)液。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至90%以上時(shí)用酶消化法進(jìn)行細(xì)胞傳代。將第二代SCs的原培養(yǎng)液吸去，用無血清1640培養(yǎng)液洗2次后，加入NT-3基因腺病毒載體（AdvNT-R），培養(yǎng)3h后吸去病毒液，加含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48h。1.3動(dòng)物中心提供SD雌性成年大鼠50只（200—220g），由中山大學(xué)北校區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為5組：正常對(duì)照組（A組）、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組（B組）、NSCs單獨(dú)移植組（C組）、NSCs與未基因修飾SCs聯(lián)合移植組(D組)、NSCs與NT-3基因修飾SCs聯(lián)合移植組(E組)。1.4大鼠骨髓中nms和nt-3基因修飾scs的檢測(cè)未基因修飾SCs、NT-3基因修飾SCs及經(jīng)核熒光標(biāo)記的NSCs用胰蛋白酶消化后，均制備成8×106個(gè)細(xì)胞/μl的細(xì)胞懸液備用。B—E組實(shí)驗(yàn)大鼠經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉（25—30mg/kg）麻醉后，在脊髓T9和T10節(jié)段之間做全橫斷，并切除其后約2mm脊髓組織。在損傷腔內(nèi)植入大小約為2mm×2mm×2mm的I型膠原，B組在膠原上吸附DMEM/F12培養(yǎng)液5μl,C組吸NSCs懸液5μl,D組吸附NSCs及未基因修飾SCs懸液各5μl,E組吸附NSCs及NT-3基因修飾SCs懸液各5μl。手術(shù)后腹腔注射青霉素（50000IU/（kg·d），連續(xù)3d）,人工排尿。1.5運(yùn)行評(píng)分和確定大鼠在術(shù)后60d進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)，檢測(cè)方法分（Basso-Beattle-Bresnahan,BBB評(píng)分法)評(píng)分和爬網(wǎng)格測(cè)驗(yàn)。BBB評(píng)分時(shí)將大鼠置于開闊平地，任其爬行，5min內(nèi)觀察后肢的運(yùn)動(dòng)情況，然后參照Basso等提出的BBB法對(duì)各實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后肢的運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評(píng)分。爬網(wǎng)格測(cè)驗(yàn)則參照Ramon-Cueto等的方法制作大鼠爬網(wǎng)格支架，經(jīng)多次反復(fù)訓(xùn)練，術(shù)后60d將大鼠放在45°斜坡的網(wǎng)格上，觀察其爬網(wǎng)格時(shí)后肢運(yùn)動(dòng)情況。1.6皮質(zhì)運(yùn)動(dòng)檢測(cè)術(shù)后67d，將大鼠麻醉后固定于立體定位儀，暴露雙側(cè)坐骨神經(jīng)和大腦體感運(yùn)動(dòng)區(qū)皮質(zhì)。在一側(cè)坐骨神經(jīng)主干上鉤一對(duì)鉤狀鉑金絲電極，另一支末端為球形的銀電極輕觸于坐骨神經(jīng)相對(duì)側(cè)的體感運(yùn)動(dòng)區(qū)皮質(zhì)表面，在電極周圍滴少許液體石蠟。將電極連接在Biolap智能型生物信號(hào)顯示與處理系統(tǒng)。用粗電壓、單刺激、波寬1ms、強(qiáng)度1mV，先后檢測(cè)并記錄皮質(zhì)運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位（corticalmotorevokedpotentialCMEP）和皮質(zhì)體感誘發(fā)電位（corticalsomatosensoryevokedpotential,CSEP）。最后利用該信號(hào)顯示和處理系統(tǒng)分別測(cè)量CMEP和CSEP的潛伏期（latency）和峰峰值（amplitude）。1.7統(tǒng)計(jì)分析用SPSS10.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。2結(jié)果2.1nscs聯(lián)合移植大鼠術(shù)后1d下肢運(yùn)動(dòng)情況經(jīng)脊髓全橫斷手術(shù)后，大鼠雙后肢隨即完全癱瘓，按BBB法進(jìn)行評(píng)分,均為0分。實(shí)驗(yàn)對(duì)照組大鼠在存活期內(nèi)雙后肢運(yùn)動(dòng)功能無明顯變化，僅個(gè)別動(dòng)物可出現(xiàn)1個(gè)或2個(gè)關(guān)節(jié)的輕微運(yùn)動(dòng)。爬網(wǎng)格測(cè)驗(yàn)中只能靠前肢拖動(dòng)身體，后肢偶爾運(yùn)動(dòng)則極易踩空落入網(wǎng)格空洞（圖1）。各細(xì)胞移植組大鼠則一般在術(shù)后20d左右陸續(xù)出現(xiàn)一定的后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。至術(shù)后60d,NSCs單獨(dú)移植組（C組）的大鼠后肢一般可進(jìn)行2個(gè)或3個(gè)關(guān)節(jié)聯(lián)合運(yùn)動(dòng)，在爬網(wǎng)格測(cè)驗(yàn)中后肢雖然也有踩空但可經(jīng)常蹬踩網(wǎng)格，協(xié)助前肢向上爬（圖2）。NSCs與未基因修飾SCs聯(lián)合移植組(D組)大鼠的后肢運(yùn)動(dòng)好于C組，在爬網(wǎng)格測(cè)驗(yàn)中后肢踩空情況減少。NSCs與NT-3基因修飾SCs聯(lián)合組(E組)大鼠的后肢運(yùn)動(dòng)情況與其余各組相比均有較顯著改善，10只大鼠中有5只可常見后肢支撐體重的情況，另有3只大鼠可在空地爬行及爬網(wǎng)格時(shí)后肢進(jìn)行連續(xù)彈跳（圖3）。根據(jù)在連續(xù)5min空地爬行過程中大鼠后肢運(yùn)動(dòng)情況，對(duì)各組大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行BBB評(píng)分的結(jié)果見表1。2.2實(shí)驗(yàn)組大鼠在骨靜電反應(yīng)中的弱電位變化正常對(duì)照組大鼠的CMEP和CSEP的主反應(yīng)均是呈先正后負(fù)的PN型波，后放是一組弱電位變化，其中后放電位的波形不穩(wěn)定。脊髓全橫斷經(jīng)各種處理并存活60d后，各組大鼠均能檢測(cè)到主反應(yīng)，其中實(shí)驗(yàn)對(duì)照組的波形低鈍，潛伏期延長(zhǎng)，峰峰值減小。各細(xì)胞移植組的波形較明顯，潛伏期和峰峰值有不同程度的恢復(fù)（圖4—5，表2—3）。3小鼠骨髓損傷后功能恢復(fù)BBB評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)被廣泛運(yùn)用于大鼠后肢運(yùn)動(dòng)的檢測(cè)與評(píng)價(jià)，它將大鼠后肢運(yùn)動(dòng)分為22個(gè)等級(jí)。后肢全癱為0分，完全正常為21分，而2種狀態(tài)之間根據(jù)功能分別定為1—20分。爬網(wǎng)格測(cè)驗(yàn)也是目前常用于大鼠脊髓功能的一種行為學(xué)評(píng)價(jià)方法，通過觀察大鼠在爬網(wǎng)格時(shí)后肢能否蹬踩網(wǎng)格等一系列行為學(xué)指標(biāo)可以判斷后肢能否運(yùn)動(dòng)及能否感覺到網(wǎng)格的位置等。結(jié)果顯示脊髓全橫斷后大鼠后肢功能完全喪失，在未移植細(xì)胞的情況下存活60d，后肢功能幾乎沒有恢復(fù)。移植NSCs后無論從爬網(wǎng)格測(cè)驗(yàn)定性或BBB評(píng)分定量檢測(cè)均表明大鼠后肢功能有了一定的恢復(fù)。NSCs與未基因修飾SCs聯(lián)合移植時(shí)功能恢復(fù)得到加強(qiáng)，當(dāng)NSCs與NT-3基因修飾SCs聯(lián)合移植時(shí)恢復(fù)更為明顯。所以從行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果來看，NSCs與NT-3基因修飾SCs聯(lián)合移植具有較好的促進(jìn)脊髓損傷后功能修復(fù)的作用。誘發(fā)電位（evokedpotential,EP）被認(rèn)為是衡量脊髓損傷后功能恢復(fù)的重要客觀指標(biāo)，人們常用CMEP和CSEP來分別評(píng)價(jià)脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)傳導(dǎo)路和感覺傳導(dǎo)路的損傷或修復(fù)情況。誘發(fā)電位的主要檢測(cè)指標(biāo)為潛伏期和峰峰值。潛伏期能反映神經(jīng)通路的傳導(dǎo)速度，而峰峰值則可反映電位的強(qiáng)度，即參與神經(jīng)通路的神經(jīng)纖維的多少及興奮程度。本研究結(jié)果顯示，脊髓全橫斷60d后實(shí)驗(yàn)對(duì)照組的波形低鈍，潛伏期延長(zhǎng)，峰峰值減小。各細(xì)胞移植組的波形較明顯，潛伏期和峰峰值有不同程度的恢復(fù)，提示損傷脊髓具備了一定的神經(jīng)傳導(dǎo)功能。這些結(jié)果能較好地與行為學(xué)檢測(cè)的情況相吻合。NSCs與NT-3基因修飾SCs聯(lián)合移植促進(jìn)脊髓損傷后功能修復(fù)的機(jī)制我們分析主要有以下幾個(gè)方面：(1)NSCs在損傷脊髓內(nèi)分化為神經(jīng)元替代死亡的宿主神經(jīng)元，并可能與損傷處兩端的神經(jīng)突起形成突觸聯(lián)系，以橋接的方式促