化學品中華蜜蜂急性經(jīng)口毒性試驗2023-03-17發(fā)布I本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別專利的責任。本文件由全國危險化學品管理標準化技術(shù)委員會(SAC/TC251)提出并歸口。本文件起草單位：中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心、北京科潤天朗環(huán)境技術(shù)有限公司、中檢科健(天津)檢驗檢測有限責任公司、中國檢驗檢疫科學研究院、廈門尹巢科技有限公司、廣東銘凱科技有限公司、浙江輝日環(huán)境檢測有限公司、金久科技有限公司。1化學品中華蜜蜂急性經(jīng)口毒性試驗1范圍本文件規(guī)定了使用小燒杯法和飼喂管法測定化學品對中華蜜蜂急性經(jīng)口毒性的試驗原理、試驗方法、結(jié)果計算與表示、質(zhì)量保證與質(zhì)量控制和試驗報告。本文件適用于使用小燒杯法和飼喂管法測定化學品對中華蜜蜂的急性經(jīng)口毒性。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB5749生活飲用水衛(wèi)生標準3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。急性毒性acutetoxicity生物體短時間(1d～4d)內(nèi)一次或多次暴露于某種化學物質(zhì)而產(chǎn)生的明顯不良反應。注：在本試驗中，急性經(jīng)口毒性用半數(shù)致死濃度(LCso)來表示，即在特定時間內(nèi)(最高96h)導致50%數(shù)量的受試蜜蜂死亡的物質(zhì)濃度。4試驗原理用受試物與蜂蜜水混合成不同濃度的溶液飼喂中華蜜蜂，生物學背景見附錄A。以48h為一個試驗周期，在24h、48h時記錄蜜蜂的死亡數(shù)，并計算各組死亡率，分別確定50%試驗蜜蜂死亡時的受試物濃度，用24h-LC?或48h-LCs?表示。若研究時間延長，則繼續(xù)記錄72h、96h蜜蜂的死亡數(shù)。5試驗方法5.1儀器設(shè)備5mL小燒杯、溫度控制及連續(xù)測溫設(shè)備、加濕器及溫濕度儀、飼喂管、精密天平(至少精確到5.2試驗容器試驗容器可為長、寬、高分別為10cm、10cm和10cm,以網(wǎng)紗襯里的蜂籠；或恒溫恒濕培養(yǎng)箱，以保證試驗溫度和濕度穩(wěn)定。當受試物具有揮發(fā)性時，實驗室應裝有通風裝置；當受試物不具有揮發(fā)性時，試驗容器底部、頂部應敞開。試驗前對容器進行清洗，干燥后備用。將試驗容器在試驗區(qū)域隨機放2置。使用分組設(shè)計可以控制實驗室中的系統(tǒng)影響，每個區(qū)域每個處理組應隨機設(shè)計。試驗過程中，容器應避免不必要的干擾，如搬動或移動容器、人員頻繁走動。5.3受試蜜蜂中華蜜蜂(ApisceranaceranaFabricius)成年工蜂，試驗應選擇同一批體長和年齡相似的成年工蜂。人工飼養(yǎng)的成年工蜂在試驗前需要轉(zhuǎn)入到試驗用蜂籠進行為期一周的馴化，在馴化期間飼喂試驗用蜂蜜水或蔗糖水，沒有出現(xiàn)明顯死亡狀況則可以選取身體健康、大小一致的工蜂進行試驗。受試中華蜜蜂的馴養(yǎng)方法按照附錄B進行。5.4試驗用水試驗用水使用飲用水(需除氯)或純凈水應符合GB5749的要求。除氯后的試驗用水中氯化物含量應小于或等于250mg/L。試驗用水的pH應為6.5～8.5。5.5試驗條件試驗在23℃~27℃、相對濕度為50%～70%的黑暗環(huán)境中進行；試驗開始2h前停止喂食，試驗過程中用小燒杯法或飼喂管法進行喂食；對照組中試驗蜜蜂的存活率應大于90%。5.6受試樣品制備將已知量的受試物溶于一定體積去離子水或蒸餾水中。如果受試物為水溶性，則可直接溶于喂飼的蔗糖溶液中。貯備液應當天配制。對于化學性質(zhì)較穩(wěn)定的物質(zhì)，可配制供2d以上使用的溶液，配好后低溫保存。對于水溶解度低的物質(zhì)，可使用超聲波分散混勻，也可加入對蜜蜂低毒的有機溶劑、乳化劑或分散劑助溶(如二甲基亞砜、二甲基甲酰胺、丙酮等),配制試驗物質(zhì)儲備液應使用分析純試劑。所有受試物測試濃度組中助溶劑的用量應該相同，且其濃度一般不超過1%。貯備液的配制推薦使用機械方式(例如攪拌或超聲),使受試物在稀釋水中進行簡單的混合或攪動。通過稀釋儲備液來配制所選定濃度的試驗溶液。5.7試驗步驟正式試驗前先進行預試驗，以確定試驗中的濃度范圍。配制一系列濃度，該系列濃度一般以10為等比做間距，例如：0.1mg/L、1mg/L、10mg/L、100mg/L、1000mg/L,也可根據(jù)需要以其他公比進行配制。設(shè)空白對照組，對照組至少設(shè)置3個重復，如果使用助溶劑還應增加溶劑對照組。試驗可在長、寬、高均為10cm的網(wǎng)紗襯里的木質(zhì)蜂籠中進行。用質(zhì)量濃度為0.5g/mL的蜂蜜水與藥劑母液混合，按等比序列配制成不同濃度的藥液。取10mL配制好的藥液移至放有脫脂棉的5mL小燒杯內(nèi)，再將小燒杯倒扣于蜂籠頂部供蜜蜂取食。每個蜂籠放20只成年工蜂。每個處理組(包括空白對照組)設(shè)置3個重復。試驗開始后每隔24h檢查、記錄各組蜜蜂中毒和死亡情況。試驗在網(wǎng)紗襯里的木質(zhì)蜂籠中進行?；\頂部安裝一個飼喂管，供試蜜蜂可將喙伸入管內(nèi)吸取藥液。3藥液配制同小燒杯法，將10mL配好的藥液放入飼喂管中供蜜蜂取食。每4h記錄一次藥液消耗量。每只籠中一次性移入20只成年工蜂。每處理(包括空白對照)設(shè)置3個重復。在小燒杯法與飼喂管法結(jié)果不一致的情況下，以飼喂管法為仲裁法。在預試驗中，根據(jù)蜜蜂最低全致死濃度與最高全存活濃度之間，以幾何級數(shù)做間距，公比不超過2.2,至少選擇5個濃度為正式試驗的濃度，使死亡率分布在0%～100%。其濃度范圍在3個依次的幾何系列濃度中最好能夠測得20%～80%的死亡率以估算LC5值。每個濃度組至少設(shè)置3個重復，供試蜂數(shù)量至少為20只，測試持續(xù)時間為48h。試驗初始的4h,觀察蜜蜂死亡數(shù)，從結(jié)果中減去。每隔24h對蜜蜂進行觀察。如果試驗蜂蜷縮于蜂籠底部不動，可視為已死亡。同時，記錄內(nèi)容還應包括各種觀察到的異常行為(如蜜蜂在籠底部亂轉(zhuǎn)，擠成一堆等)。記錄24h、48h的蜜蜂死亡數(shù)，對試驗數(shù)據(jù)進行數(shù)理統(tǒng)計，求出LC值及95%置信限。如研究時間延長，可記錄直至96h?；瘜W品濃度、重復次數(shù)、死亡率和癥狀樣本數(shù)據(jù)記錄見附錄C。5.7.3.3飼喂管法應每天補充添加藥物的蜜水，以保證蜜蜂隨時取食。在預計一種受試物為低毒等情況下，應進行限度試驗，以確定LCs?是否大于限度值。在本文件規(guī)定的試驗條件下，若受試物的最大水溶解度大于2000mg/L時，則以2000mg/L為限度試驗濃度進行試驗。若受試物的最大水溶解度無法達到2000mg/L,則以受試物在介質(zhì)中的最大水溶解度(或者是形成穩(wěn)定分散溶液的最大濃度)為限度試驗濃度進行測定。取20只中華蜜蜂成年工蜂進行試驗，試驗時間為48h,試驗結(jié)束時若無受試蜂死亡，則不再進行下一步試驗。限度試驗中若有死亡發(fā)生，應進行完整試驗。如果觀察到致死效應，則應進行記錄。試驗結(jié)果以48h-LC?大于該物質(zhì)的最大水溶解度或大于2000mg/L表示。6結(jié)果計算與表示中華蜜蜂急性經(jīng)口毒性半數(shù)致死劑量LC?值的計算可采用寇氏法、直線內(nèi)插法或概率單位圖解法估算，也可應用有關(guān)毒性數(shù)據(jù)計算軟件進行分析和計算。7質(zhì)量保證與質(zhì)量控制7.1正式試驗至少設(shè)3組重復試驗。試驗結(jié)束時，對照組死亡率不應超過10%。如果在第一個24h之后死亡率持續(xù)增加了10%以上，則需要延長實驗，最長至96h。7.2試驗期間，試驗環(huán)境溫度恒定控制在23℃~27℃,相對濕度控制在50%～70%,且在黑暗環(huán)境下。7.3試驗開始前，檢測配制的受試物實際濃度，應不低于理論濃度的80%。8試驗報告試驗結(jié)果報告應包括以下內(nèi)容：4——受試物物理性質(zhì)和相關(guān)物理化學性質(zhì)；——化學標識數(shù)據(jù)，包括受試物的純度及定量分析方法；——中華蜜蜂大致年齡(周)、采集方法、采集日期、健康狀況、是否處理等信息；——蜂蜜水來源及配置方法；——貯備液的制備方法，如果受試物難溶于水，則記錄配制貯備液和試驗液的方法，所用助溶劑物質(zhì)的濃度；——溫度、濕度條件，保證試驗全過程黑暗；——選擇試驗方法的原因和詳細過程；——試驗設(shè)計(如試驗容器數(shù)量、試驗濃度、重復);——試驗理論濃度、實測濃度平均值和試驗容器間標準差，以及分析試驗方法；——所用化學分析法的方法步驟以及試驗結(jié)果；——如果進行了限度試驗，報告結(jié)果；——在每次建議的觀察時間，記錄各濃度下的累積死亡數(shù)及對照組結(jié)果；——試液濃度及每一推薦觀察時間的LCs?值(置信度95%);——試驗過程中死亡率為0的最大試驗濃度(LC),試驗過程中死亡率為100%的最小試驗濃度(LC?oo); 蜂所有異常反應的發(fā)生率，以及所有因受試物而引起的反應。5(資料性)中華蜜蜂生物學背景資料科。又稱中華蜂、中蜂、土蜂，是東方蜜蜂的一個亞種，是中國獨有的蜜蜂當家品種，是以雜木樹為主的森林群落及傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)的主要傳粉昆蟲，有利用零星蜜源植物、采集力強、利用率較高、采蜜期長及適應性、抗螨抗病能力強等優(yōu)點。中華蜜蜂工蜂腹部顏色因地區(qū)不同而有差異，有的較黃，有的偏黑；吻長平均5mm。蜂王有兩種體色：一種是腹節(jié)有明顯的褐黃環(huán)，整個腹部呈暗褐色；另一種是腹節(jié)無明顯褐黃環(huán)，整個腹部呈黑色。雄蜂一般為黑色。南方蜂種一般比北方的小，工蜂體長約10mm～13mm,雄蜂體長約11mm～13.5mm,蜂王體長約13mm～16mm。成年工蜂體長約10mm±2mm。6(資料性)受試中華蜜蜂的馴養(yǎng)方法春夏季節(jié)將中華蜜蜂蜂箱置于實驗室外搭建的遮雨棚內(nèi)，定期查看蜜蜂釀蜜情況，酌情給予一定的蔗糖水或蜂蜜水防止食物短缺。中華蜜蜂飛行敏捷，嗅覺靈敏，出巢早、歸巢遲，每日外出采集的時間比意大利蜂多2h～3h,善于利用零星蜜源。造脾能力強，喜歡新脾，愛啃舊脾；抗蜂螨和美洲幼蟲腐臭病能力強，但容易感染中蜂囊狀幼蟲病，易受蠟螟危害；喜歡遷飛，在缺蜜或受病敵害威脅時特別容易棄巢遷居；易發(fā)生自然分蜂和盜蜂；不采樹膠，分泌蜂王漿的能力較差；蜂王日產(chǎn)卵量比西方蜜蜂少，群勢小。冬季天冷后，于蜂箱內(nèi)添加隔溫板，往蜂排上添加一定量蜂蜜水以備蜂群過冬，并于蜂箱上添加稻草。如果溫度仍然較低，可以將蜂箱轉(zhuǎn)移到溫室內(nèi)。溫室內(nèi)種植草莓等蜜源植物，蜜蜂可以為其授粉，提高產(chǎn)量，豐富的蜜源也有利于蜜蜂生存，為毒理試驗提供活力強的中華蜜蜂。注意定期檢查蜂箱，及時清除闖入蜂箱的外族蜂，以防中華蜜蜂受攻擊。保持蜂箱周圍整潔干燥，防止傳染病發(fā)生。受試蜜蜂的選擇：應在試驗溫度的飼養(yǎng)室飼養(yǎng)一周以上，飼喂與試驗中種類相同的足量蜂蜜水。訓化期間，記錄死亡率并按照以下的標準評判。1)7d內(nèi)試驗蜂死亡率大于10%:舍棄整批蜂。2)7d內(nèi)試驗蜂死亡率在5%～10%:再飼養(yǎng)7d;如果接下來的7d內(nèi)試驗蜂死亡率小于5%:接收本批蜂；如果接下來的7d內(nèi)，試驗蜂死亡率超過5%,舍棄整批蜂。3)7d內(nèi)試驗蜂死亡率小于5%:接收本批蜂。保證試驗中使用的蜂沒有明顯疾病，舍棄所有病蜂。試驗期間及試驗前兩周不應對蜂做任何疾病處理。經(jīng)抗生素等化學物質(zhì)處理的蜜蜂，在最后一次處理結(jié)束后的4周內(nèi)不應用本試驗。馴養(yǎng)期間環(huán)境記錄見表B.1,飼養(yǎng)記錄見表B.2。表B.1蜜蜂馴養(yǎng)環(huán)境記錄表時間示值異常情況及處理記錄記錄人日期溫度/℃溫度/%1234567GB/T42475—2023表B.2蜜蜂飼養(yǎng)記錄表批號喂食活動狀況有無蜂王病蟲害地方備注記錄人蜜水