Shoot

and

root

regeneration

in

natureHow

in

vitro?Direct

and

indirectorganogenesisPlant

embryogenesis：zygoteCell

dedifferentiationDirect

and

indirect

embryogenesis愈傷組織分化與植株再生?

細(xì)胞分化(cell

differentiation):

是指同一來源的細(xì)胞逐漸產(chǎn)生出形態(tài)結(jié)構(gòu)

、功能特征各不相同的細(xì)胞類群的過程，其結(jié)果是在空間上細(xì)胞產(chǎn)生差異，在

時間上同一細(xì)胞與其從前的狀態(tài)有所不同。?

細(xì)胞分化的本質(zhì):

基因組在時間和空間上的選擇性表達(dá)，通過不同基因表達(dá)的

開啟或關(guān)閉，最終產(chǎn)生標(biāo)志性蛋白質(zhì)。一般情況下，細(xì)胞分化過程是不可逆的?

細(xì)胞再分化(cell

redifferentiation

):

已經(jīng)去分化形成的胚性細(xì)胞在某些刺激條

件下，重新啟動開始分化發(fā)育的過程。植物形態(tài)發(fā)生(Plant

morphogenesis):

植物外部形狀和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的起源、發(fā)育和建成的過程?

器官發(fā)生(organogenesis):指培養(yǎng)條件下的組織或細(xì)胞團(tuán)（愈傷組織）分化形成不

定芽/根(adventitious

shoots/roots）等器官的過程

(包括直接和間接器官發(fā)生）間接器官發(fā)生在適合的條件下，愈傷組織細(xì)胞(第一階段：形成愈傷組織)會發(fā)生生理代謝上的改

變，促使細(xì)胞分裂部位和方向改變，首先出現(xiàn)分生細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞分裂逐漸形成分生

細(xì)胞團(tuán)和分生組織(第二階段：形成分生中心)，進(jìn)一步再分化形成維管結(jié)節(jié)直至分

化成芽和根等器官(第三階段：器官原基及器官形成)。?

單極分化：愈傷組織中的分生中心在刺激物質(zhì)的影響下向著一極分化，形成有根

無芽或有芽無根的現(xiàn)象。?

雙極分化：愈傷組織中隨著細(xì)胞分裂出現(xiàn)兩個或兩個以上分生中心，分化成芽和

根，根芽之間并無輸導(dǎo)等組織溝通。?

先芽后根：愈傷組織中產(chǎn)生多個分生細(xì)胞形成分生中心，從中僅分化出芽，待芽

長到一定大小時在其基部可分化出根。?

先根后芽：有些植物外植體脫分化后在愈傷組織上先分化出根，而后在靠近愈傷

組織的根部上再分化出芽。In

vitro

regeneration

of

Ledebouria

revoluta

through

callus

mediated

indirect

shoot-organogenic

pathway.

(A)

Root

explants

derived

callus.

(B)

Leaf

derived

callus.

(C)

Bulb

scale

derived

callus.

(D)

Shoot

induced

from

the

surface

of

the

callus.

(E)

Maturation

of

unipolar

shoots

(or

bulblets).

(F)

Root

induction

of

in

vitro

derived

shoots.

(G)

Tissue

culture

derived

ex

vitro

plantsJ

Genetic

Engin

Biotech,

2018,

16:

645-651影響器官發(fā)生的關(guān)鍵因素?

激素及其配比:

高濃度的生長素和低濃度的分裂素可以促使細(xì)胞連續(xù)繁殖—

—無組織的生長。相反，高濃度的分裂素能引起莖-芽(shoot-bud)形成。?

基本的規(guī)律：生長素促進(jìn)根分化，分裂素促進(jìn)芽分化(BAP是最有效)。?

光照：很多光照條件下，一些植物均能進(jìn)行器官發(fā)生，說明光周期并不是非常

重要的因子，可有的植物在光、暗交替條件下才能形成芽，而在連續(xù)光照下則

不能。盡管如此，多數(shù)植物需要一個穩(wěn)定的光周期，多數(shù)培養(yǎng)條件是14-16h光

照，8-10h黑暗。光質(zhì)對于某些植物可能也很重要。?

溫度：不同植物不一樣，需要摸索，如煙草和棉花就不一樣。Cell

dedifferentiation?

體細(xì)胞胚胎發(fā)生(Somatic

embryogenesis):離體培養(yǎng)下沒有經(jīng)過授精過程，但經(jīng)過

了胚胎發(fā)育過程所形成的再生植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生胚胎發(fā)生的細(xì)胞學(xué)觀察Histological

sections

of

calluses

with

embryogenic

structures

cultured

on

medium

supplemented

with

9.0

μM

2,4-D

after

8

months

of

culture.

Arrows

indicate

a

pro-embryo

(A),

globular

(B),

early-

heart

shaped

(C),

heart-shaped

(D),

torpedo-like

(E),

and

cotyledonary

somatic

embryos

(F).Front

Plant

Sci,

2018,

9:

1769?

直接胚胎發(fā)生(Direct

embryogenesis):

從培養(yǎng)中的器官、組織、細(xì)胞或原生質(zhì)體直接分化成胚(胚狀體)。如下胚軸、子葉、莖表皮等外植體細(xì)胞脫分化后，由表皮細(xì)胞經(jīng)不等分裂，產(chǎn)生一個胚細(xì)胞和一個胚柄細(xì)胞，后者發(fā)育類似胚柄,前者進(jìn)一步分裂，由原胚發(fā)育為成熟胚。在懸浮培養(yǎng)液中有各種類型的細(xì)胞，其中有一種細(xì)胞具有深厚的細(xì)胞質(zhì)，液泡相對較小，保持旺盛的分裂能力，經(jīng)多次分裂產(chǎn)生的多細(xì)胞間仍保持著聯(lián)結(jié)，形成稱為“胚性細(xì)胞團(tuán)”的聚集團(tuán)塊Somatic

embryo

formation

from

the

hypocotyl

of

somatic

embryosPlant

Biotechnol

Rep

(2007)

1:5

–9?

間接胚胎發(fā)生(Indirect

embryogenesis):

外植體先愈傷化，再由愈傷組織細(xì)胞分

化成胚。在愈傷組織中，可能出現(xiàn)液泡小、細(xì)胞質(zhì)濃的小細(xì)胞，這種小細(xì)胞聚集

成EC，其表面是高度分生組織化的細(xì)胞團(tuán)。一個EC表面可產(chǎn)生大量的胚狀體。在

原培養(yǎng)基中，EC表面的胚狀體不能進(jìn)一步發(fā)育，但EC中心的細(xì)胞分裂和分離會促

使EC崩潰。崩潰后分生性的表面細(xì)胞結(jié)合成群，又形成新的EC。EC在轉(zhuǎn)入合適的

培養(yǎng)基中才能完成胚狀體的發(fā)育，以類似合子胚的分裂方式發(fā)育至成熟胚狀體:

植物組織培養(yǎng)中起源于非合子細(xì)胞，經(jīng)過胚胎發(fā)生和胚胎發(fā)育過程形

成的胚狀結(jié)構(gòu)。這一定義有以下幾方面的界定：?

胚狀體是組織培養(yǎng)的產(chǎn)物，只限于組織培養(yǎng)范圍使用，區(qū)別于無融合生殖的胚；

?

胚狀體起源于非合子細(xì)胞，區(qū)別于合子胚?

胚狀體的形成經(jīng)歷胚胎發(fā)育的過程，區(qū)別于組織培養(yǎng)中分化的芽體。胚狀體可按其來源分為兩大類：?

體細(xì)胞胚：由普通植物體（孢子體）的各種器官等雙倍體的體細(xì)胞產(chǎn)生的胚狀體

?

花粉胚:由小孢子或其分裂產(chǎn)物等單倍體細(xì)胞產(chǎn)生的胚狀體，通常稱為花粉胚，可發(fā)育成單倍體植株。以上兩種胚狀體的特點：?

第一：兩極性，即在其發(fā)生的最早階段就具有根端（胚根）和莖端（胚芽）；

?

第二：它與母體植物或外植體的維管組織無解剖結(jié)構(gòu)上的聯(lián)系。體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑的優(yōu)勢：?

數(shù)量多。在細(xì)胞、愈傷組織和器官的培養(yǎng)中，一個培養(yǎng)物上誘導(dǎo)胚狀體的數(shù)量，

往往比誘導(dǎo)芽的數(shù)量要多得多。?

結(jié)構(gòu)完整(胚狀體具有兩極性)。胚狀體一旦形成即可長成為小植株，成苗率高。?

發(fā)生過程中的相關(guān)材料是研究胚發(fā)育的良好材料體系。用于人工種子研究與生

產(chǎn)，可節(jié)約大量種子，且可固定雜種優(yōu)勢。體細(xì)胞胚胎發(fā)生與器官發(fā)生總結(jié)體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑器官發(fā)生途徑細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)方向相反的兩極分化，具有根

端和芽端兩個分生中心單向極性，單個分生中心不定胚維管組織與外植體維管組織不相連不定芽和不定根與愈傷組織的維管相連具有典型的胚胎形態(tài)發(fā)生過程無胚胎形態(tài)，分生中心直接分化為器官形成的幼苗具有子葉不定芽的苗無子葉胚狀體發(fā)育的苗，根和芽齊全先長芽后長根，或先長根后長芽影響胚狀體發(fā)生和發(fā)育的因素?

基因型、培養(yǎng)基與激素：脫分化與再分化：第一階段包括外植體細(xì)胞的脫分

化、愈傷組織的誘導(dǎo)、胚性細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)的形成，所用的培養(yǎng)基必須含有生

長素類物質(zhì)，主要是2,4-D；第二階段包括胚狀體的形成和發(fā)育，必須降低2

，4-D濃度或完全去除2,4-D;

還有其他激素.培養(yǎng)個體的遺傳基礎(chǔ)決定了離體

培養(yǎng)的反應(yīng)能力。培養(yǎng)基的部分成分：如不同的無機(jī)N；

以及逆境脅迫NH4NO3對不同品種胚分化的影響KNO3

對胚分化的作用氯化鉀對棉花愈傷組織質(zhì)地和胚分化的影響KCl

(mg/L)愈傷組織質(zhì)地愈傷顏色胚分化率0疏松顆粒狀淡黃色14.5±3.6500疏松顆粒狀淡黃色28.5±4.51000疏松顆粒狀黃色35.0±5.91500塊狀黃褐色6.5±2.5不同棉花品種（系）的愈傷組織增殖及分化能力比較試管苗的移栽與護(hù)理?

試管苗與自然苗的生理區(qū)別?

試管苗的角質(zhì)層（蠟質(zhì)層）發(fā)育很差，光合作用差，移栽時易失水。?

根吸收很弱，功能差。?

自然條件下，植物與真菌、細(xì)菌存在一種共生關(guān)系，試管苗缺乏這種關(guān)系。

?

試管苗移栽時應(yīng)注意如下問題：?

防止被病菌感染：瓊脂要沖洗干凈，最好用無菌土?

為防止根受傷，可以用過篩的細(xì)土，最好是富含有機(jī)質(zhì)、疏松的合成的基質(zhì)。

?

為了保證移栽時順利成活，幼苗應(yīng)先在低鹽培養(yǎng)基上生根（1/2MS或knop營養(yǎng)液）后，再移栽。?

有時移栽后在低溫處理一段時間以打破休眠（主要用于灌木、樹種等）?

應(yīng)該采取保持濕度的措施?

可以用嫁接的方式移栽試管苗A

BCDEFG

H

I

J花藥培養(yǎng):

是植物雄性生殖器

官-花藥為其外植體離體培養(yǎng)

技術(shù)，就培養(yǎng)方法和技術(shù)來

講，屬于器官培養(yǎng)的范疇。單倍體細(xì)胞培養(yǎng)單倍體(haploid)：體細(xì)胞染色體組數(shù)等于本物種配子染色體組數(shù)的個體或細(xì)胞包括一倍單倍體(monohaploid)和多倍單倍體(polyhaploid)單倍體的來源?

Wide

crossing:

種間和屬間雜交(Interspecific

cross)。結(jié)合胚挽救技

術(shù)獲得單倍體。Chinese

cabbageRed

cabbageScientia

Horticulturae

250

(2019)

33

–37?

孤雌/雄生殖(partheno/patro-genesis),

或物理照射和化學(xué)誘變(Irradiation

and

–

chemical

treatment

or

Pollen

treatment)。

花粉用射線照射后失去了受精能力

，與母株授粉，卵細(xì)胞在花粉的刺激作用下進(jìn)行孤雌發(fā)育，從而產(chǎn)生單倍體。這

方面的例子可在煙草、小麥、金魚草中發(fā)現(xiàn)。蜜蜂發(fā)育與分工Pollination

of

female

flowers

with

irradiated

male

flowersSci

World

J

2013:

529502.?

雙生苗的篩選(selection

of

twins).

有些植物可產(chǎn)生多胚種子，即兩個或多個胚被

共同的種皮包裹著，這些種子可產(chǎn)生單倍體-單倍體、二倍體-二倍體和單倍體-二

倍體植株。在Capiscum中，雙生苗的頻率受母本基因型控制。通過篩選可以提高

雙生苗的頻率。Classification

based

on

the

phenotype

of

twin-embryo

kernelsBMC

Plant

Biology

18:

313

(2018)?

小孢子/花培(Microspore/Anther

and

Pollen

Culture)：最廣泛應(yīng)用的方法。

Haploids

develop

directly

from

pollen

grains

in

culture,

either

through

direct

formation

of

embryos

from

pollen

grains

or

formation

of

callus

and

subsequent

plant

regeneration.?

Ovule/ovary

culture?

Inducer

linesTrends

in

Genetics,

2019Genes/QTL

and

their

function

with

regard

to

haploid

induction

and

doublingPlant

Biotechnology

Journal

(2017)

15,

pp.

1361

–1370單倍體培養(yǎng)途徑總結(jié)Current

Biology

27,

R1089

–R1107,

2017n2n單倍體培養(yǎng)的意義(應(yīng)用價值)

?

縮短育種年限,提高選擇效率花粉單倍體是純和配子體，選擇某一基因型的概率是(1/2)

，常規(guī)雜交選

擇同一基因型的概率(1/2)

,

兩者之間相差2n倍Traditional

breedingDouble

haploid

breedingJournal

of

Natural

Sciences

Research,

2017,

7:

10-20?

排除雜種優(yōu)勢對后代選擇的干擾?

遺傳研究的良好實驗材料體系(如創(chuàng)造永久作圖群體)

、高應(yīng)用價值的材料?

突變體的篩選?

消除致死基因?

選育新型自交系?

遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料?

克服遠(yuǎn)緣雜交后代不育Anther/microspore

culture任何時期的花藥/小孢子都適合單倍體培養(yǎng)？要選擇何種時期的？MicrogametogenesisMicrosporogenesis雙子葉植物花粉發(fā)育Pollination

and

fertilizationPlant

Physiol.

2009;149:694-707活體或離體花粉/小孢子發(fā)育如何花藥培養(yǎng)？影響花藥成功培養(yǎng)的因素？基本過程：選擇花蕾—花蕾預(yù)處理—消毒—剝?nèi)』ㄋ帯T導(dǎo)培養(yǎng)—分化培養(yǎng)花藥預(yù)處理脅迫處理的目的：提高并誘導(dǎo)孤雄生殖(induce

androgenesis)抑制體細(xì)胞(anther

wall

and

tapetum)的愈傷誘導(dǎo)。脅迫處理類型：cold,

heat,

osmotic

stress,

sugar

starvation,

gamma

irradiation,and

chemical

treatment

(Ethrel

and

ethephon))Rice

Science,

23:

57-68,

2016Growth

chart

of

callus

formation

from

anther

culture

in

balsam

pearEffect

of

pretreatments

on

callus

induction

from

anthers

in

balsam

pear.35℃

6h2000rpm

12h4℃

24hJournal

of

Medicinal

Plants

Research

，6

：3393-3395，2012Effect

of

cold

pretreatment

time

on

callus

induction

from

anthers

in

balsam

pear.Effect

of

anther

pretreatment

on

embryo/callus

induction

and

plant

development/100

anthers)

in

three

barley

cultivarsJ

Med

Plants

Res

，6：3393-3395，2012

J.

Appl.

Genet.

43

：

287-296，2002花粉/小孢子培養(yǎng)花蕾的選擇？花粉/小孢子釋放？花粉小孢子培養(yǎng)？?花粉發(fā)育時期對成胚至關(guān)重要油菜花蕾、花藥長度與小孢子發(fā)育時期和培養(yǎng)效果的關(guān)系一般認(rèn)為，甘藍(lán)型油菜的單倍體培養(yǎng)常采用單核晚期至二核早期不同植物誘導(dǎo)胚胎發(fā)生的最佳小孢子發(fā)育時期發(fā)育時期物種減數(shù)分裂期草莓、番茄四分孢子期葡萄單核早中期石刁柏、大麥、馬鈴薯單核晚期荔枝、茄子、小麥、大白菜單核早期至晚期煙草、蘿卜單核早期至雙核期梨、水稻、甘蔗、甜瓜四分孢子期至雙核期玉米花粉/小孢子分離方法1.自然釋放法，無菌花藥在液體或固體培養(yǎng)基上自然開裂。在油菜和禾本科

植物有應(yīng)用，但效率低。2.研磨過濾收集法，無菌研磨器中研磨花蕾或花藥，釋放花粉/小孢子，過

篩并純化花粉/小孢子

。常用于油菜和茄科作物。3.剖裂釋放法，借助工具剖裂藥壁，使花粉釋放出來。在藥草中有應(yīng)用花粉/小孢子培養(yǎng)方式?

平板培養(yǎng)(Plateculture)，是指將瓊脂或明膠等凝膠狀固體培養(yǎng)基制成平

面狀，然后在此平面上接種花粉或小孢子。?

液體培養(yǎng)(Liquid

culture)，是指將花粉或小孢子直接接種于液體培養(yǎng)基中,

并不斷振蕩或攪拌，使其均勻地在液體培養(yǎng)基中生長繁殖的一種培養(yǎng)方法?

雙層培養(yǎng)(double

layer

culture)，是指將花粉或小孢子直接接種于固體-

液體雙層培養(yǎng)基中培養(yǎng)。?

看護(hù)培養(yǎng)(nurseculture)?

微室培養(yǎng)法(micro-chamber

culture)：取一滴載有花粉的液體培養(yǎng)基，滴于蓋

玻片上，然后翻轉(zhuǎn)蓋玻片使液體培養(yǎng)基懸掛在蓋玻片下，再置于一凹形載玻片上

，最后用石蠟密封蓋玻片四周。?

條件培養(yǎng)基(conditioned

medium)：將培養(yǎng)過花藥的培養(yǎng)基去掉花藥并離心收集

上清液；或者花藥經(jīng)沸水殺死細(xì)胞后碾碎、離心收集上清液；兩種上清液(含有

促進(jìn)花粉發(fā)育的物質(zhì))都可以加入培養(yǎng)基中，用于花粉/小孢子培養(yǎng)。6?影響花藥/小孢子培養(yǎng)的關(guān)鍵因素

基因型Mean

number

of

embryos

per

Petri

dish

in

different

induction

media

for

responsive

genotypes不同Brassica

napus基因型的小孢子產(chǎn)胚率GenotypeEmbryoid/10

microsporeSeedling

(%)Topas10000-2000001-20Westar1000-100000.1-1Delta100-100000.01-1Bounty10-1000.001-0.01Acta

Physiol

Plant

(2016)

38:74?

供體植株的生理狀態(tài)和環(huán)境條件(Physiological

status

of

donor

plant)光周期、光照強(qiáng)度、溫度等對以后的花粉離體培養(yǎng)有很大影響。一般田間比溫室，

幼齡比老齡植株易于培養(yǎng)。主莖易于側(cè)(次)分枝Plantlet

regeneration

throughout

the

year

in

barleyM.S.:

Main

Shoot;

T1:

Tiller

no.

1;

T2:

Tiller

no.

2;

T3:

Tiller

no.

3;

T4:

Tiller

no.

4.Plant

Cell

Rep

(2006)

25:

375

–381?

Culture

ConditionE?ects

of

temperature

treatment

and

bud

size

on

microspore

embryogenesis

in

cabbageScientia

Horticulturae

233

(2018)

178

–187花藥/小孢子培養(yǎng)中常存在的問題

?

Higher

frequency

of

albino

plants:

由于質(zhì)體和/或核DNA降解Anther

culture

response

of

six

barley

cultivarsCultivasTypePlated

anthersResponding

anthers

(%)RP/100RAG/AG/100RAIgriWinter50049.3108.77.295.4CorkSpring50045.8109.20.033.2DouchkaSpring50047.645.40.052.2MadrasSpring50036.439.60.041.5PrismaSpring50021.346.90.14.3ScarletSpring50031.937.10.031.1RP/100RA

–

regenerated

plantlets/100

responding

anthers;

G/A

–

Green/Albinos

ratioPlant

Cell

,Tissue

and

Organ

Culture

76:

35

–

43,

2004(A–D)

Plastid

features

in

microspore

derived

embryos

and

androgenetic

plantlets

in

the

winter

cv.

Igri.

(A)

Cell

global

view

showing

the

general

morphology

of

plastids

(P)

including

a

dividing

plastid

(arrowheads).

S

–

starch;V

–

vacuole.

6000.

(B)

Higher

magni?cation

showing

the

initiation

of

thylakoid

formation

(arrowheads)

in

the

stroma.

S

–

starch.

32000.

(C)

Immunolocalization

of

DNA

in

plastid

stroma

(arrowhead).

S

–

starch.

43000.

(D)

Typical

chloroplast

in

a

green

microspore

derived

plantlet

showing

organized

thylakoids

(arrowheads),

grana

(G)

and

a

small

starch

grain

(S).V

–

vacuole;

W

–

cell

wall.

21000.Plant

Cell

,Tissue

and

Organ

Culture

76:

35

–

43,

2004產(chǎn)生的因素內(nèi)因：基因型和花粉發(fā)育時期的影響最為明顯；外因：如高溫、高濃度2,4-D、延遲再分化培養(yǎng)時間等均可促進(jìn)白化苗產(chǎn)生。解決辦法：?

Temperature

and

Light

Intensity，適當(dāng)提高溫度，對于光照強(qiáng)度(有的認(rèn)為

增加有用，有的則反之)；?

Media

Composition

Including

Plant

Growth

Regulators

，改變碳源，如用

Glucose/Mannitol替換，使用生長素(2,4-D/IAA)配細(xì)胞分裂素(BA)等；?

花藥/花粉來源：盡可能取主分枝上的小花；?

盡早再分化，?小孢子培養(yǎng)的優(yōu)越性排除了藥壁、藥隔、花絲等體細(xì)胞組織的干擾，獲得的再生植株都是來源于單倍體的小孢子；?花藥培養(yǎng)中，有時會因花藥中的某些物質(zhì)而影響小孢子的啟動分裂，而小孢子培養(yǎng)則不存在這種問題；?小孢子培養(yǎng)中，由于小孢子是游離的單倍體細(xì)胞，除不受等位基因影響外，能均勻地接觸外部環(huán)境條件(如化學(xué)、物理誘變)，因此是研究轉(zhuǎn)

化和誘變的理想材料；?便于系統(tǒng)觀察小孢子在離體條件下的生長發(fā)育過程，是研究發(fā)育極好的材料體系：?小孢子培養(yǎng)從每個花藥中能獲得更多的再生植株，花藥和小孢子培養(yǎng)差異類別AntherMicrospore發(fā)展歷史1964年首次成功1973年首次成功成功培養(yǎng)案例數(shù)>120物種>18物種組培角度分類器官培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)外植體花藥小孢子預(yù)處理需要不需要小花(花蕾)標(biāo)準(zhǔn)單核早期-單核晚期單核晚期-雙核早期培養(yǎng)基狀態(tài)固體液體操作培養(yǎng)程序簡單復(fù)雜精細(xì)培養(yǎng)途徑愈傷組織或直接成胚胚狀體單倍體純度不能排除母體組織的影響

可為單、雙活非整倍體排除母體組織的影響，純

度高的單倍體群體胚胎學(xué)、遺傳學(xué)機(jī)理研究及誘變篩選情況因細(xì)胞組織的干擾，研究不方便因單細(xì)胞離散性好、群體數(shù)量大，研究方便單倍體產(chǎn)量及穩(wěn)定性低且不穩(wěn)定較高且較穩(wěn)定單倍體植株：一般植株矮小，生長瘦弱，高度不育。對單倍體進(jìn)行加倍處理，

使其成為雙單倍體，是穩(wěn)定其遺傳行為和為育種服務(wù)的必要措施(a)

Tetraploid;

(b)

Triploid;

(c)

Diploid;

(d)

Haploid.Front

Plant

Sci

2015;

6:

1118.Haploid

branchDiploid

branch.Front

Plant

Sci

2015;

6:

1118.單倍體植株的加倍處理?自然加倍?人工加倍：化學(xué)藥劑處理(有絲分裂抑制劑）?

有毒化學(xué)藥劑秋水仙素(colchicine)(微管解聚劑)，能與微管蛋白亞基結(jié)合

并組裝到微管末端，阻止新的微管蛋白二聚體繼續(xù)在此末端添加，但微

管在另一端的去組裝不受影響，從而導(dǎo)致微管解聚。長春花堿（

catharanthus

alkaloid

）和諾可脞（nocodazole）具有類似的作用。?

過濾滅菌的秋水仙素溶液處理花粉/再生植株?

秋水仙素處理上部葉片的頂芽/腋芽?

添加到培養(yǎng)基中培養(yǎng)花藥/花粉。?

無毒化學(xué)藥劑氟樂靈和氨磺樂靈單倍體/雙單倍體的鑒定?

染色體直接計數(shù)法。取莖尖、根尖等分生組織區(qū)壓片，計數(shù)染色體數(shù)目。?

間接鑒定法?

流式細(xì)胞儀確定細(xì)胞DNA含量?

細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定。葉片保衛(wèi)細(xì)胞大小、單位面積氣孔數(shù)及保衛(wèi)細(xì)

胞中葉綠體的大小和數(shù)目與倍性高度相關(guān)?

植株形態(tài)學(xué)鑒定。單倍體植株瘦弱，葉片窄小，花小柱頭長，花

粉粒小，不結(jié)實?

雜交鑒定法，自交或測交，看后代分離情況。?

分子標(biāo)記鑒定，包括生化標(biāo)記(同工酶標(biāo)記)或分子標(biāo)記Determination

of

ploidy

using

?ow

cytometry.

a

diploid

or

doubled

haploid

plantlets,

b

haploid

plantlets植物原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體(Protoplast):

指采用機(jī)械或酶解法去掉細(xì)胞壁的裸露細(xì)胞原生質(zhì)體的應(yīng)用基礎(chǔ)理論研究?

細(xì)胞生理與發(fā)育：可以用于細(xì)胞壁的再生、膜結(jié)構(gòu)、細(xì)胞膜的離子轉(zhuǎn)運、細(xì)

胞器的動態(tài)表現(xiàn)、光合作用、呼吸作用和物質(zhì)的跨膜運輸、氣孔開關(guān)等、?

基因表達(dá)調(diào)控研究：BiFC,

基因亞細(xì)胞定位等。應(yīng)用科學(xué)研究?

種質(zhì)資源保存?

體細(xì)胞雜交：原生質(zhì)體融合，克服生殖障礙，創(chuàng)造新種質(zhì)?

篩選無性系變異和突變體?

遺傳轉(zhuǎn)化?

同一組織可產(chǎn)生大量遺傳上基本一致的原生質(zhì)體

?

如具再生能力，易獲得轉(zhuǎn)化植株?

易攝取外源遺傳物質(zhì)?

轉(zhuǎn)化后固體包埋培養(yǎng)，可避免嵌合體產(chǎn)生原生質(zhì)體分離與純化原生質(zhì)體分離的最基本原則：保證原生質(zhì)體不受傷害及不損害其再生能力

分離方法?

機(jī)械法分離：1892年Klercker建立，將細(xì)胞高滲糖溶液中，使細(xì)胞質(zhì)壁分離，

再用刀片切割細(xì)胞壁,使原生質(zhì)體釋放出來。缺點：產(chǎn)量極低；應(yīng)用的材料受限制；操作極費力植物細(xì)胞壁?

胞間層:

又稱中膠層，位于兩個相鄰細(xì)胞之間，主要成分為果膠質(zhì)。?

初生壁:

位于胞間層內(nèi)側(cè)。主要成分為纖維素、半纖維素。?

次生壁:

位于質(zhì)膜和初生壁之間。主要成分為纖維素，并常有木質(zhì)存在。?

酶法分離：1960年

Cocking最早獲得纖維素酶的提取方法并分離原生質(zhì)體；1968

年開始商用纖維素酶和離析酶。1971年Takebe利用“二步法”成功分離煙草葉肉細(xì)

胞原生質(zhì)體；1968年P(guān)ower和Cocking利用“一步法”成功分離原生質(zhì)體。

酶法優(yōu)點：可在短時間內(nèi)獲得大量原生質(zhì)體缺點：不純的酶制劑所含雜質(zhì)對原生質(zhì)體可能有不同程度的毒害作用一步和二步法分離原生質(zhì)體影響酶法分離原生質(zhì)體的因素理論上：任何活組織都可分離得到原生質(zhì)體。實際上：要得到活性高、能進(jìn)行分裂

、能形成愈傷組織、最后再生完整植株的的原生質(zhì)體則受許多因素影響。原生質(zhì)體分離：考慮取材、酶的種類、純度、酶液的滲透壓、酶解時間、溫度等suspension

culture

embryogenesis

calli

leaf?

外植體:生長旺盛、生命力強(qiáng)的組織和細(xì)胞是獲得高活力原生質(zhì)體的關(guān)鍵，并

影響著原生質(zhì)體的復(fù)壁、分裂、愈傷組織形成乃至植株再生常用外植體：剛展開的幼嫩葉片葉肉細(xì)胞、愈傷組織、懸浮細(xì)胞(需每隔3-5天

繼代一次，培養(yǎng)一段時間使細(xì)胞處于旺盛生長狀態(tài))酶制劑:

纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶和離析酶等，酶解花粉母細(xì)胞和四分體小

孢子時還要加入蝸牛酶。常用的酶制劑：纖維素酶：Cellulase

Onozuka

R-10

（Kinki

Yakult

Manuf.

Co.

Ltd.,

Nishinomiya,

日本），

Cellulase

Onozuka

RS

（Kinki

Yakult

Manuf.

Co.

Ltd.,

Nishinomiya,

日本），Cellulase（Sigma），Driselase

（Kyowa

Hakko

Kogyo

Co.，日本）。果膠酶：Pectolyase

Y23

（Kikkoman

Shoyu

Co.,

Lte.

Nishinomiya

，日本），Macerozyme

（Yakult

Biochemicles

Co.，日本），Pectinase（Serva）等。半纖維素酶：Rhozyme

Hp-150

（Rohm

and

Haas

Co.

inde.

美國賓西法尼亞州）。

大多數(shù)植物分離原生質(zhì)體時，纖維素酶濃度在1%-3%，果膠酶在0.1%-1%。...?

滲透壓：原生質(zhì)體操作需要在一定滲透壓存在下