ICS65.020.30CCSB4437CodeofpracticeforthepreventionandtreatmentofcolibacillosisindonkeyfoalsIDB37/TXXXX—XXXX本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別專利的責任。本文件由山東省畜牧獸醫(yī)局提出并組織實施。本文件由山東省畜牧業(yè)標準化技術(shù)委員會歸口。1DB37/TXXXX—XXXX驢駒大腸桿菌病防治技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了驢駒大腸桿菌病的流行病學、臨床癥狀、病理變化、診斷、預防、治療、病死驢及病害驢處理和檔案管理。本文件適用于養(yǎng)驢場驢駒大腸桿菌病的防治。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489實驗室生物安全通用要求GB39707醫(yī)療廢物處理處置污染控制標準NY/T388畜禽場環(huán)境質(zhì)量標準NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術(shù)規(guī)范NY5027無公害食品畜禽飲用水水質(zhì)NY/T5030無公害農(nóng)產(chǎn)品獸藥使用準則3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.13.2驢駒大腸桿菌病donkeyfoalscolibacillosis由O78、O101、O8等主要血清型的致病性大腸桿菌引起驢駒的急性、接觸性傳染病。注：病例特征呈現(xiàn)劇烈的下痢和敗血癥癥狀。4流行病學4.1病原特點病原為腸桿菌科大腸埃希氏菌屬中O78、O101、O8等主要血清型的致病性大腸桿菌。病原菌為革蘭氏陰性菌，在驢駒腸道及其糞便污染的環(huán)境中廣泛存在。4.2傳染源發(fā)病驢駒和攜帶致病性大腸桿菌的驢。4.3傳播途徑該病通過消化道傳播，糞-口傳播是主要途徑。病原菌污染糞便、圈舍、飼料、水槽及飲水等均可傳播?？赏ㄟ^臍帶或分娩時經(jīng)產(chǎn)道傳播。2DB37/TXXXX—XXXX4.4易感動物8月齡內(nèi)的驢駒均可發(fā)病，多于出生后2d～3d發(fā)病。4.5發(fā)病特點一年四季均可發(fā)生，以冬末初春季節(jié)交替時段多發(fā)，潛伏期為1d～2d。發(fā)病率為5%～40%，病死率為2%～20%。5臨床癥狀驢駒發(fā)病初期體溫升高，精神沉郁，食欲不振，糞便粥樣或水樣，劇烈腹瀉，肛門失禁，排出液狀糞便，呈黃色、白色或灰白色，有時含多量黏液或血液，腥臭味。發(fā)病中期出現(xiàn)衰弱，脫水，喜躺臥，無法站立。發(fā)病末期，食欲廢絕，腹瀉和便秘交替發(fā)生，由敗血癥和全身微循環(huán)衰竭致死。6病理變化胃黏膜脫落，有出血點和出血斑。小腸、盲腸和結(jié)腸表現(xiàn)為黏膜脫落。肝臟腫大、淤血。脾腫大，包膜下有出血點。心內(nèi)膜和外膜也有出血點，腸系膜淋巴結(jié)腫大、出血。7診斷7.1臨床診斷驢駒出現(xiàn)腹瀉或敗血癥等癥狀可假定大腸桿菌感染，根據(jù)流行病學、臨床癥狀和病理變化等做出初步臨床診斷。7.2實驗室診斷見附錄A。7.2.1采樣按NY/T541的規(guī)定執(zhí)行，主要采集肛拭子、腹瀉物等病料。7.2.2細菌分離培養(yǎng)無菌取病料，經(jīng)三區(qū)劃線接種于麥康凱培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)24h，培養(yǎng)出表面光滑、粉紅色圓形菌落。挑取符合大腸桿菌特征的單菌落純化3次～4次。7.2.3顯微鏡檢將單菌落革蘭氏染色，鏡檢，油鏡下呈現(xiàn)兩端鈍圓，單在或成對的革蘭氏陰性菌。7.2.4生化鑒定將純化后的細菌接種于葡萄糖、甘露醇、乳糖、麥芽糖、吲哚試驗、V-P試驗、甲基紅試驗、枸櫞酸鹽試驗管，37℃恒溫培養(yǎng)24h后觀察。結(jié)果顯示：葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣、甘露醇產(chǎn)酸產(chǎn)氣、乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣、麥芽糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣、吲哚試驗和甲基紅試驗呈陽性，V-P試驗和枸櫞酸鹽試驗呈陰性。7.2.5大腸桿菌O血清型鑒定3DB37/TXXXX—XXXX將純化的大腸桿菌接種于LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h，用0.5%石炭酸生理鹽水洗下菌苔，制成濃稠懸液，經(jīng)121℃高壓2h，制備O抗原。取潔凈玻片，吸取O抗原滴于玻片兩端，一滴加入10μL抗O血清，一滴加入等量生理鹽水。輕輕晃動玻片，傾斜玻片30°于1min內(nèi)觀察試驗現(xiàn)象。按照表A.1進行判定，出現(xiàn)“++”及以上凝集反應(yīng)判定陽性結(jié)果。7.2.6分離菌株16SrDNA序列測定提取分離菌基因組DNA為模板擴增16SrDNA序列。引物序列按照附錄A。PCR反應(yīng)體系為模板（基因組DNA20ng/μL～50ng/μL）2μL，2×TaqPCRMasterMix12.5μL，上下游引物（20μmol/L）各1μL，ddH2O8.5μL，共25μL反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)程序為95℃預變性5min；95℃變性15s，53℃退火15s，72℃延伸2min，共30個循環(huán)；最終72℃延伸5min，4℃暫時保存。通過1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。片段大小約為1500bp。回收并純化PCR產(chǎn)物，按照雙脫氧鏈終止法測序。7.3結(jié)果判定將PCR測序結(jié)果使用NCBI中的BLAST進行檢索，是否與數(shù)據(jù)庫序列一致。應(yīng)根據(jù)臨床診斷和實驗室診斷結(jié)果確診該病。7.4實驗室生物安全按照GB19489規(guī)定執(zhí)行。8預防8.1環(huán)境衛(wèi)生按NY/T388和NY5027的規(guī)定執(zhí)行。夏季食槽和水槽應(yīng)及時清理。8.2生物安全生產(chǎn)區(qū)內(nèi)不得飼養(yǎng)其他動物，不應(yīng)屠宰和解剖病死驢，不帶入其他畜產(chǎn)品。料庫應(yīng)有防鼠防鳥設(shè)施。8.3管理8.3.1妊娠母驢做好孕驢產(chǎn)前和產(chǎn)后護理工作,將臨產(chǎn)母驢提前轉(zhuǎn)入消毒好的專用產(chǎn)舍。接產(chǎn)人員應(yīng)消毒。產(chǎn)后及時清理胎衣和其它排泄物并徹底消毒。寒冷季節(jié)做好產(chǎn)房保溫。8.3.2驢駒產(chǎn)后及時做好驢駒臍部消毒工作。驢駒吸吮初乳前，對乳區(qū)進行消毒，確保新生驢駒吃到足夠初乳。驢駒斷奶前應(yīng)提前做好補料，預防斷奶應(yīng)激。驢駒設(shè)置獨立圈舍，并保持圈舍干燥、清潔。秋冬季新生驢駒應(yīng)做好保暖工作。8.4預防措施根據(jù)流行病學調(diào)查結(jié)果，發(fā)病率高驢場，在分娩前3d～5d給予母驢微生態(tài)制劑或中獸藥。9治療4DB37/TXXXX—XXXX9.1原則9.1.1口服、注射方式投入獸藥應(yīng)符合NY/T5030的要求。9.1.2抗菌藥物的使用應(yīng)根據(jù)實驗室藥敏試驗結(jié)果，科學規(guī)范使用。9.2方法采用對因治療和對癥治療。推薦藥物見附錄B。10病死驢及病害驢處理10.1病死驢及病害驢的處理見《病死及病害動物無害化處理技術(shù)規(guī)范》（農(nóng)醫(yī)發(fā)[2017]25號）的規(guī)10.2廢棄物與病料處理按照GB39707規(guī)定執(zhí)行。11檔案管理11.1記錄記錄應(yīng)統(tǒng)一、規(guī)范。記錄內(nèi)容包括驢的年齡，發(fā)病時間及癥狀、藥品使用、藥品的生產(chǎn)廠家、生產(chǎn)日期、劑量、療程、消毒、免疫、實驗室檢測結(jié)果、療效及停藥時間。11.2存檔各種記錄保存期限不低于兩年，分類歸檔。5DB37/TXXXX—XXXX主要實驗室診斷方法A.1原理A.1.1麥康凱選擇培養(yǎng)基：大腸桿菌發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸，PH值降低，麥康凱平板中的顯色劑（中性紅）顯紅色，同時有膽鹽沉淀呈現(xiàn)粉色。A.1.2革蘭氏染色：G+菌：細胞壁厚，肽聚糖網(wǎng)狀分子形成一種透性障，當乙醇脫色時，肽聚糖脫水而孔障縮小，故保留結(jié)晶紫-碘復合物在細胞膜上。呈紫色。Gˉ菌：肽聚糖層薄，交聯(lián)松散，乙醇脫色不能使其結(jié)構(gòu)收縮，其脂含量高，乙醇將脂溶解，縫隙加大，結(jié)晶紫-碘復合物溶出細胞壁，沙黃復染后呈紅色。A.1.3大腸桿菌O血清型鑒定：通過抗原與抗體的相互作用，使得抗原或抗體在一定條件下發(fā)生凝集現(xiàn)象，抗體是機體對抗原的特異性免疫應(yīng)答產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì)，它可以與抗原結(jié)合形成免疫復合物。當抗原與抗體結(jié)合時，它們之間的親和力會導致免疫復合物的形成，從而引起凝集反應(yīng)。A.1.4PCR反應(yīng)：聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）是80年代中期發(fā)展起來的分子生物學技術(shù)。其基本原理是用兩段人工合成的寡核苷酸片段為引物，以雙鏈或單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶作用下，經(jīng)過反復多個循環(huán)的變性、復性、延伸等對特定的核酸片段進行擴增，這一方法穩(wěn)定，能在很短的時間內(nèi)擴增，得到大量所需要的特異性DNA片段，而且擴增的片段以2n的方式倍增。A.1.5瓊脂糖凝膠電泳實驗：凝膠電泳的原理是基于DNA分子的電荷和大小差異。DNA分子是帶有負電荷的，因此可以在電場中移動。凝膠是一種具有微孔結(jié)構(gòu)的材料，可以限制DNA分子的運動，使其只能通過微孔的大小進行分離。A.2試劑或材料A.2.1無菌棉簽。A.2.2生理鹽水。A.2.3麥康凱固體培養(yǎng)基。A.2.4無菌培養(yǎng)皿。A.2.5革蘭氏染色試劑盒。A.2.6載玻片。A.2.7無菌試管。A.2.8營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基。A.2.9LB液體培養(yǎng)基。A.2.10細菌基因組提取試劑盒。A.2.11瓊脂糖。A.2.12TAE緩沖液。A.2.13DNA純化試劑盒。A.2.14PCRMix酶。A.2.15ddH2O。A.2.16無菌移液器槍頭（10μL、200μL、1000μL）。6DB37/TXXXX—XXXXA.2.172mL無菌EP管。A.2.18PCR反應(yīng)管。A.3儀器設(shè)備A.3.1高速冷凍離心機：最大速度：14800轉(zhuǎn)每分，最大RCF：21100xg，溫度范圍：-9℃~+40℃。A.3.2細菌培養(yǎng)箱：溫度范圍+28℃~+70℃。A.3.3醫(yī)用冰箱：冷藏室溫度范圍：2℃~8℃,冷凍室溫度范圍：-20℃~-40℃。A.3.4超低溫冰箱：溫度范圍-40℃~-86℃。A.3.5PCR擴增儀。A.3.6核酸電泳儀。A.3.7恒溫搖床：溫控范圍：RT+5℃~60℃,恒溫狀態(tài)溫控精度：±0.1℃,溫度均勻度：±0.5℃。A.3.8正置顯微鏡。A.4試驗步驟無菌取病料，經(jīng)三區(qū)劃線接種于麥康凱培養(yǎng)基上，37℃溫箱培養(yǎng)24h，培養(yǎng)出表面光滑、粉紅色圓形菌落。挑取符合大腸桿菌特征的單菌落純化3次～4次。將單菌落革蘭氏染色，鏡檢，油鏡下呈現(xiàn)兩端鈍圓，單在或成對的革蘭氏陰性菌。將純化后的細菌接種于葡萄糖、甘露醇、乳糖、麥芽糖、吲哚試驗、V-P試驗、甲基紅試驗、枸櫞酸鹽試驗管37℃恒溫培養(yǎng)24h后觀察。將純化的大腸桿菌接種于LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h，用0.5%石炭酸生理鹽水洗下菌苔，制成濃稠懸液，經(jīng)121℃高壓2h，制備O抗原。取潔凈玻片，吸取O抗原滴于玻片兩端，一滴加入10μL抗O血清，一滴加入等量生理鹽水。輕輕晃動玻片，傾斜玻片30°于1min內(nèi)觀察試驗現(xiàn)象，根據(jù)試驗現(xiàn)象和表A.1，判斷試驗結(jié)果。將純化的大腸桿菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，置37℃恒溫搖床中培養(yǎng)20h，提取分離菌基因組DNA為Mix12.5μL，上下游引物27F（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'1492R（5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'）各1μL，ddH2O8.5μL，共25μL反應(yīng)體系，按順序加入PCR反應(yīng)管內(nèi)并混勻。PCR反應(yīng)程序為95℃預變性5min；95℃變性15s，53℃退火15s，72℃延伸2min，共30個循環(huán)；最終72℃延伸5min，4℃暫時保存。通過1%瓊脂糖凝膠經(jīng)核酸電泳儀電泳鑒定。根據(jù)目的片段回收并純化PCR產(chǎn)物，送生物公司測序。A.5數(shù)據(jù)處理將PCR測序結(jié)果使用NCBI中的BLAST進行檢索。表A.1O血清型鑒定判定標準+—1DB37/TXXXX—XXXX（資料性）推薦治療方法B.1對因治療根據(jù)藥敏試驗結(jié)果選擇合適藥物。消化道給藥：口服或灌腸慶大霉素，磺胺脒等敏感藥物。靜脈注射或肌肉注射：慶大霉素、頭孢類藥物、氨基糖苷類藥物。根據(jù)脫水程度，補充葡萄糖、鈉制劑、鉀制劑和維生素，調(diào)整胃腸機能。冬季補液應(yīng)加溫。B.2對癥治療對癥治療：對癥治療是治療本病的關(guān)鍵，患病驢常因心力衰竭、酸中毒、