1.限制酶選擇標(biāo)準(zhǔn)考點(diǎn)加強(qiáng)課限制酶的選擇與目的基因的檢測(cè)與鑒定專家講座第1頁(yè)（1）依據(jù)目標(biāo)基因兩端限制酶切點(diǎn)確定限制酶種類①應(yīng)選擇切點(diǎn)位于目標(biāo)基因兩端限制酶，方便將目標(biāo)基因“切出”，如圖甲可選擇PstⅠ。②不能選擇切點(diǎn)位于目標(biāo)基因內(nèi)部限制酶，以防破壞目標(biāo)基因，如圖甲不能選擇SmaⅠ。③為防止目標(biāo)基因和質(zhì)粒本身環(huán)化和隨意連接，也可使用不一樣限制酶切割目標(biāo)基因和質(zhì)粒，如圖甲也可選擇用Pst

Ⅰ和EcoRⅠ兩種限制酶（但要確保質(zhì)粒上也有這兩種酶切點(diǎn)），而且這種切點(diǎn)不致于破壞全部“標(biāo)識(shí)基因”以及開(kāi)啟子和終止子?？键c(diǎn)加強(qiáng)課限制酶的選擇與目的基因的檢測(cè)與鑒定專家講座第2頁(yè)（2）依據(jù)質(zhì)粒特點(diǎn)確定限制酶種類考點(diǎn)加強(qiáng)課限制酶的選擇與目的基因的檢測(cè)與鑒定專家講座第3頁(yè)①所選限制酶要與切割目標(biāo)基因限制酶相一致，以確保含有相同黏性末端。②質(zhì)粒作為載體必須具備標(biāo)識(shí)基因等，所以所選擇限制酶盡可能不要破壞這些結(jié)構(gòu)，應(yīng)最少含有一個(gè)完好標(biāo)識(shí)基因，如圖乙中限制酶pst

Ⅰ因其會(huì)破壞標(biāo)識(shí)基因而不宜選擇。③所選限制酶切點(diǎn)不應(yīng)位于復(fù)制原點(diǎn)處以防破壞復(fù)制原點(diǎn)，假如所選酶切點(diǎn)不止一個(gè)，則切割重組后可能會(huì)丟失一些片段，若丟失片段含復(fù)制原點(diǎn)區(qū)，則切割重組后片段進(jìn)入受體細(xì)胞后不能自主復(fù)制?？键c(diǎn)加強(qiáng)課限制酶的選擇與目的基因的檢測(cè)與鑒定專家講座第4頁(yè)④所選限制酶，其切點(diǎn)應(yīng)位于開(kāi)啟子與終止子之間，如圖乙中HindⅢ會(huì)破壞開(kāi)啟子，EcoRⅠ會(huì)破壞終止子，而NdeⅠ和BamHⅠ切出切口可讓目標(biāo)基因嵌入開(kāi)啟子與終止子之間。（3）參考Ti質(zhì)粒T－DNA片段選擇限制酶若質(zhì)粒上標(biāo)出T－DNA片段，則所選限制酶切點(diǎn)應(yīng)位于T－DNA片段中，從而有利于將目標(biāo)基因嵌入到T－DNA片段上——因?yàn)門i質(zhì)粒T－DNA片段最易轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞而且整合到受體細(xì)胞染色體DNA上，如用兩種限制酶Xba

Ⅰ和Sac

Ⅰ（兩種酶切出黏性末端不一樣）切割某DNA，取得含目標(biāo)基因片段。若利用該片段構(gòu)建基因表示載體，則下列圖中甲、乙、丁，Ti質(zhì)粒均不宜選擇，而丙Ti質(zhì)粒宜選取。（分析以下）考點(diǎn)加強(qiáng)課限制酶的選擇與目的基因的檢測(cè)與鑒定專家講座第5頁(yè)考點(diǎn)加強(qiáng)課限制酶的選擇與目的基因的檢測(cè)與鑒定專家講座第6頁(yè)2.目標(biāo)基因檢測(cè)與判定

（1）界定“標(biāo)識(shí)基因”與“DNA分子雜交技術(shù)”在目標(biāo)基因檢測(cè)中作用： ①載體上標(biāo)識(shí)基因標(biāo)識(shí)原理

載體上標(biāo)識(shí)基因普通是一些抗生素抗性基因。目標(biāo)基因要轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞沒(méi)有抵抗相關(guān)抗生素能力。當(dāng)含有抗生素抗性基因載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，抗性基因在受體細(xì)胞內(nèi)表示，使受體細(xì)胞能夠抵抗對(duì)應(yīng)抗生素，所以在受體細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入該種抗生素就能夠只保留轉(zhuǎn)入載體受體細(xì)胞，倘若在選擇培養(yǎng)基中不能存活，則表明無(wú)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入，當(dāng)然不會(huì)有“目標(biāo)基因”轉(zhuǎn)入，能存活時(shí)必含該載體，原理以下列圖所表示：考點(diǎn)加強(qiáng)課限制酶的選擇與目的基因的檢測(cè)與鑒定專家講座第7頁(yè)②“標(biāo)識(shí)基因”篩選后為何還需應(yīng)用“DNA分子雜交技術(shù)”確認(rèn)目標(biāo)基因是否轉(zhuǎn)入？經(jīng)上述步驟篩選得到受體細(xì)胞，只是含特定標(biāo)識(shí)基因質(zhì)粒，然而，該質(zhì)粒上是否成功嵌入了目標(biāo)基因，還不能確定，故仍需使用“目標(biāo)基因”作探針，利用DNA分子雜交技術(shù)，檢測(cè)受體細(xì)胞質(zhì)粒上是否含目標(biāo)基因。考點(diǎn)加強(qiáng)課限制酶的選擇與目的基因的檢測(cè)與鑒定專家講座第8頁(yè)（2）使用“目標(biāo)基因”作探針，利用“分子雜交技術(shù)”檢測(cè)目標(biāo)基因是否轉(zhuǎn)錄出特定mRNA。（3）采取“抗原—抗體雜交技術(shù)”，從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)（作抗原）與對(duì)應(yīng)抗體雜交，依據(jù)是否出現(xiàn)雜交帶確認(rèn)目標(biāo)基因是否“指導(dǎo)”特定蛋白質(zhì)合成。（4）采取抗蟲(chóng)、抗病毒等“接種試驗(yàn)”進(jìn)行目標(biāo)基因成功表示“個(gè)體生物學(xué)”水平檢測(cè)?？键c(diǎn)加強(qiáng)課限制酶的選擇與目的基因的檢測(cè)與鑒定專家講座第9頁(yè)【例證】

（·全國(guó)卷Ⅲ，40）圖（a）中三個(gè)DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三種限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列與切割位點(diǎn)，圖（b）為某種表示載體示意圖（載體上EcoRⅠ、Sau3AⅠ切點(diǎn)是唯一）?？键c(diǎn)加強(qiáng)課限制酶的選擇與目的基因的檢測(cè)與鑒定專家講座第10頁(yè)依據(jù)基因工程相關(guān)知識(shí)，回答以下問(wèn)題：（1）經(jīng)BamHⅠ酶切后得到目標(biāo)基因能夠與上述表示載體被

酶切后產(chǎn)物連接，理由是________________________________________________________。（2）若某人利用圖（b）所表示表示載體取得了甲、乙、丙三種含有目標(biāo)基因重組DNA分子，如圖（c）所表示，這三種重組DNA分子中，不能在宿主細(xì)胞中表示目標(biāo)基因產(chǎn)物有

，不能表示原因是_______________________________?？键c(diǎn)加強(qiáng)課限制酶的選擇與目的基因的檢測(cè)與鑒定專家講座第11頁(yè)圖（c）（3）DNA連接酶是將兩個(gè)DNA片段連接起來(lái)酶，常見(jiàn)有

和

，其中既能連接黏性末端又能連接平末端是_________________________________。考點(diǎn)加強(qiáng)課限制酶的選擇與目的基因的檢測(cè)與鑒定專家講座第12頁(yè)[慧眼識(shí)圖獲取信息]（1）三種限制酶切割結(jié)果分析考點(diǎn)加強(qiáng)課限制酶的選擇與目的基因的檢測(cè)與鑒定專家講座第13頁(yè)（2）表示載體與重組DNA分子分析考點(diǎn)加強(qiáng)課限制酶的選擇與目的基因的檢測(cè)與鑒定專家講座第14頁(yè)答案（1）Sau3AⅠ兩種酶切割后產(chǎn)生片段含有相同黏性末端（2）甲、丙甲中目標(biāo)基因插入在開(kāi)啟子上游，丙中目標(biāo)基因插入在終止子下游，二者目標(biāo)基因均不能被轉(zhuǎn)錄（3）E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶T4DNA連接酶考點(diǎn)加強(qiáng)課限制酶的選擇與目的基因的檢測(cè)與鑒定專家講座第15頁(yè)1.（·湖南長(zhǎng)沙長(zhǎng)郡中學(xué)月考）下列圖是利用工程菌（大腸桿菌）生產(chǎn)人生長(zhǎng)激素試驗(yàn)流程。所用pBR322質(zhì)粒含有限制酶Pst

Ⅰ、EcoRⅠ和HindⅢ切點(diǎn)各一個(gè)，且三種酶切割形成末端各不相同，而Ampr表示氨芐青霉素抗性基因，Tetr表示四環(huán)素抗性基因。請(qǐng)回答以下相關(guān)問(wèn)題：考點(diǎn)加強(qiáng)課限制酶的選擇與目的基因的檢測(cè)與鑒定專家講座第16頁(yè)（1）過(guò)程①所用到組織細(xì)胞是

，過(guò)程④所用酶是

。⑤過(guò)程慣用

溶液處理大腸桿菌。（2）經(jīng)②過(guò)程得到互補(bǔ)DNA片段，稱為

。（3）假如用限制酶Pst

Ⅰ、EcoRⅠ和HindⅢ對(duì)圖中質(zhì)粒進(jìn)行切割，用一個(gè)酶、兩種酶和三種酶分別切割時(shí)形成DNA片段種類與用一個(gè)酶和兩種酶分別切割時(shí)形成DNA片段種類

（填“相同”或“不一樣”），這些種類DNA片段中含有完整氨芐青霉素抗性基因DNA片段和四環(huán)素抗性基因DNA片段分別有

種和

種。考點(diǎn)加強(qiáng)課限制酶的選擇與目的基因的檢測(cè)與鑒定專家講座第17頁(yè)（4）假如只用限制酶Pst

Ⅰ切割目標(biāo)基因和質(zhì)粒，完成過(guò)程④、⑤后（受體大腸桿菌不含Ampr、Tetr），將三角瓶?jī)?nèi)大腸桿菌先接種到甲培養(yǎng)基上，形成菌落后用無(wú)菌牙簽挑取培養(yǎng)基甲上單個(gè)菌落，分別接種到乙和丙兩個(gè)培養(yǎng)基相同位置上，一段時(shí)間后，菌落生長(zhǎng)情況如圖乙、丙所表示。接種到甲培養(yǎng)基上目標(biāo)是篩選

大腸桿菌；接種到培養(yǎng)基乙上大腸桿菌菌落，能存活大腸桿菌體內(nèi)導(dǎo)入是

。含有目標(biāo)基因大腸桿菌在培養(yǎng)基乙和丙上生存情況是_______________________________________________?？键c(diǎn)加強(qiáng)課限制酶的選擇與目的基因的檢測(cè)與鑒定專家講座第18頁(yè)（5）將大腸桿菌培養(yǎng)在含氨芐青霉素、四環(huán)素培養(yǎng)基上過(guò)程，屬于基因工程基本操作中_______________________________________________________________步驟。該基因工程中pBR322質(zhì)粒徹底水解產(chǎn)物是______________________。解析（1）過(guò)程①取得是人生長(zhǎng)激素mRNA，所以組織細(xì)胞取自人垂體組織細(xì)胞；過(guò)程④構(gòu)建基因表示載體酶是DNA連接酶；過(guò)程⑤將基因表示載體導(dǎo)入大腸桿菌前，慣用CaCl2溶液處理大腸桿菌，使之成為感受態(tài)細(xì)胞。（2）②過(guò)程是人生長(zhǎng)素mRNA逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA過(guò)程?？键c(diǎn)加強(qiáng)課限制酶的選擇與目的基因的檢測(cè)與鑒定專家講座第19頁(yè)（3）Pst

Ⅰ、EcoRⅠ和HindⅢ三種酶切點(diǎn)分別用1、2、3表示，一個(gè)酶酶切時(shí)，一共能夠得到3種相同長(zhǎng)度片段；兩種酶酶切時(shí)，可得到1－2，2－1，2－3，3－2，1－3，3－1六種片段；三種酶酶切時(shí)，可得到1－2，2－3，3－1三種片段，與前面重復(fù)，所以用一個(gè)酶、兩種酶和三種酶分別切割時(shí)形成DNA片段種類與用一個(gè)酶和兩種酶分別切割時(shí)形成DNA片段種類相同。這些種類DNA片段中含有完整氨芐青霉素抗性基因DNA片段和四環(huán)素抗性基因DNA片段分別有3種和3種?？键c(diǎn)加強(qiáng)課限制酶的選擇與目的基因的檢測(cè)與鑒定專家講座第20頁(yè)（4）在甲中能生長(zhǎng)是含有四環(huán)素抗性細(xì)菌，含有四環(huán)素抗性基因；在乙培養(yǎng)基中能生長(zhǎng)是含有四環(huán)素和氨芐青霉素抗性細(xì)菌，所以導(dǎo)入是完整pBR322質(zhì)?；蚝蠥mpr、Tetr質(zhì)粒。與丙相比，乙培養(yǎng)基中少了兩個(gè)菌落，說(shuō)明丙培養(yǎng)基中這兩個(gè)菌落中大腸桿菌成功導(dǎo)入了重組質(zhì)粒，而且目標(biāo)基因插入質(zhì)粒后，破壞了氨芐青霉素抗性基因，使含有目標(biāo)基因大腸桿菌不能在含有氨芐青霉素乙培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，但四環(huán)素抗性基因是完好，則含有目標(biāo)基因大腸桿菌能在含有四環(huán)素丙培養(yǎng)基上生長(zhǎng)?？键c(diǎn)加強(qiáng)課限制酶的選擇與目的基因的檢測(cè)與鑒定專家講座第21頁(yè)（5）將大腸桿菌培養(yǎng)在含氨芐青霉素、四環(huán)素培養(yǎng)基上過(guò)程，屬于基因工程中篩選含目標(biāo)基因受體細(xì)胞步驟。該基因工程中pBR322質(zhì)?；瘜W(xué)本質(zhì)是DNA，其徹底水解產(chǎn)物是磷酸、脫氧核糖和四種含氮堿基。答案（1）人垂體組織細(xì)胞DNA連接酶CaCl2（2）cDNA（3）相同3

3（4）含四環(huán)素抗性基因完整pBR322質(zhì)粒（或含有Ampr、Tetr質(zhì)粒）在丙中能存活，在乙中不能存活（5）篩選含目標(biāo)基因受體細(xì)胞磷酸、脫氧核糖、四種含氮堿基考點(diǎn)加強(qiáng)課限制酶的選擇與目的基因的檢測(cè)與鑒定專家講座第22頁(yè)2.（·河南名校聯(lián)盟調(diào)研）如圖所表示為培育轉(zhuǎn)基因細(xì)菌操作流程，回答以下問(wèn)題：（1）圖中①過(guò)程所用工具酶有

。為了預(yù)防載體和外源DNA自連，應(yīng)怎樣操作？______________________________________________。（2）當(dāng)細(xì)菌轉(zhuǎn)化過(guò)程中吸收外源DNA是病毒DNA時(shí)，該轉(zhuǎn)化過(guò)程又稱轉(zhuǎn)染。圖中外源DNA來(lái)自

。為了提升轉(zhuǎn)染效率，應(yīng)使用

處理細(xì)菌。（3）圖中②過(guò)程，重組DNA增殖時(shí)需要哪些條件？_________________。考點(diǎn)加強(qiáng)課限制酶的選擇與目的基因的檢測(cè)與鑒定專家講座第23頁(yè)（4）圖中③過(guò)程，篩選含重組質(zhì)粒細(xì)菌需用到

基因功效。已知所用載體內(nèi)有青霉素抗性基因和四環(huán)素抗性基因兩種抗性基因，請(qǐng)寫出能在含四環(huán)素培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，但不能在含青霉素培養(yǎng)基上生長(zhǎng)細(xì)菌即為含外源DNA細(xì)菌前提條件：_____________________________________________________________________________________________________________________（答出兩點(diǎn)即可）。解析依據(jù)轉(zhuǎn)染定義可知，