T/CIXXXX—2024

基于質(zhì)譜的定量蛋白質(zhì)組技術(shù)規(guī)程

1范圍

本文件規(guī)定了基于質(zhì)譜的定量蛋白質(zhì)組樣品量要求，確立了樣品采集與保存、蛋白質(zhì)提取、樣品運

輸、質(zhì)量控制、蛋白質(zhì)酶解及除鹽、質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集的程序，描述了質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析和數(shù)據(jù)質(zhì)量控制的方法。

本文件適用于動植物組織、細胞、細菌、真菌、血清、血漿、各類體液等樣品中提取的蛋白質(zhì)樣品。

2規(guī)范性引用文件

本文件沒有規(guī)范性引用文件。

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

定量蛋白質(zhì)組quantitativeproteomics(QP）

對一個基因組表達的全部蛋白質(zhì)或一個復雜混合體系內(nèi)所有蛋白質(zhì)進行精確鑒定和定量。

注：可用于篩選和尋找任何因素引起的樣本之間的差異表達蛋白，結(jié)合生物信息學揭示細胞生理病理等功能，同時

也可對某些關(guān)鍵蛋白進行定性和定量分析。

3.2

蛋白質(zhì)酶解proteolysis

蛋白質(zhì)在蛋白酶作用下降解成肽段的過程。

3.3

非標記定量蛋白質(zhì)組labelfree(LF）

不需要對比較樣本做特定標記處理，只需要比較特定肽段/蛋白在不同樣品間的色譜質(zhì)譜響應(yīng)信號

便可得到樣品間蛋白表達量的變化。

3.4

子離子daughterion(DI）

母離子進一步發(fā)生反應(yīng)形成的產(chǎn)物，反應(yīng)可以是單分子解離，形成碎片離子、離子或分子反應(yīng)、或

發(fā)生了電荷數(shù)的改變。

3.5

保留時間retentiontime(RT）

被色譜分離的樣品組分從進樣開始到色譜柱后出現(xiàn)該組分濃度極大值時的時間，也即從進樣開始到

出現(xiàn)某組分色譜峰的頂點時為止所經(jīng)歷的時間，稱為此組分的保留時間，用RT表示，常以分鐘（min）

為時間單位。

4縮略語

下列縮略語適用于本文件：

MS：質(zhì)譜分析法(massspectrometry)

iTRAQ：同位素標記相對和絕對定量(isobarictagsforrelativeandabsolutequantification）

TMT：串聯(lián)質(zhì)量標記定量蛋白質(zhì)組(tandemmasstag）

DDA：數(shù)據(jù)依賴質(zhì)譜掃描模式采集(datadependentacquisition）

DIA：數(shù)據(jù)非依賴質(zhì)譜掃描模式采集(dataindependentacquisition)

MS1：一級質(zhì)譜檢測(massspectrometry1）

MS2：二級質(zhì)譜檢測(massspectrometry2）

iRT：索引保留時間(indexedretentiontime）

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5樣品量要求

根據(jù)不同樣品類型和檢測目標準備足量樣品，在條件許可情況下，盡量加倍準備樣品量，并做好樣

品備份工作，表1為推薦樣品量。

表1推薦樣品量

樣品類型推薦樣品量

新鮮動物組織50mg～2g

新鮮植物組織100mg～50g

細菌/真菌菌體50mg～2g

新鮮培養(yǎng)細胞5×106個～1×107個

血清50μL～100μL

血漿50μL～100μL

唾液、羊水、腦脊液100μL～500μL

尿液15mL～50mL

6樣品采集與保存

6.1保存樣品之前需要對新鮮采集樣品進行預處理，去除易對檢測結(jié)果造成影響的雜質(zhì)或污染物，如：

殘留的血液、培養(yǎng)液、沉淀物、泥土等非目標檢測物，需要對組織和細胞進行充分破碎，以提高蛋白質(zhì)

提取效率，具體要求見表2。

表2樣品采集與保存

樣品類型樣品采集與保存要求

1.1手術(shù)切除的人體組織，使用4℃預冷的無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）或無菌生理鹽水洗去殘留

血液等非目標檢測污染物a；

b

1.2其他動物來源組織如肝臟、心臟等可采用灌流方式去血；

1.3如無灌流條件可將組織剪碎后用4℃預冷的PBS或生理鹽水去除血液；

1新鮮動物組織1.4將組織剪/切碎成0.5cm3～1.0cm3的小塊；

1.5液氮速凍后-80℃保存。

a：血液等組織液中因含多種高豐度蛋白質(zhì)，會降低蛋白質(zhì)鑒定數(shù)目，應(yīng)在樣品采集階段決定是否去除高豐

度蛋白質(zhì)；

b；組織樣品需保證新鮮狀態(tài)下才可進行灌流操作，灌流不適用于冷凍保存或經(jīng)固定液浸泡的其他不新鮮的

組織樣品。

2.1木本植物的花、葉等，草本科植物，藻類，蕨類植物和大型真菌等的柔軟組織，推薦樣品

量為0.1g～10g；

2.2果實和種子推薦采集樣品量為0.5g～10g；

2新鮮植物組織2.3富含雜質(zhì)或蛋白質(zhì)含量低的植物樣品，如樹根、樹皮、木質(zhì)部、韌皮部組織等，應(yīng)采集樣

本量為5g～50g；

2.4應(yīng)使用PBS或生理鹽水清洗干凈樣品表面泥土等非目標檢查污染物，去除其他相鄰組織；

2.5取樣后盡快液氮速凍后-80℃保存。含水量多的樣本，如果實、花等，可先凍干再液氮速凍。

3.13000g離心10min收集菌體；

3細菌/真菌菌體3.2使用預冷的無菌PBS清洗沉淀塊三次，離心去除上清液，保留沉淀塊；

3.3液氮速凍后-80℃保存。

4.1貼壁細胞：細胞長至90%密度時，吸干凈培養(yǎng)基，使用預冷的無菌PBS潤洗細胞表面1~2

次，吸干PBS；使用胰蛋白酶消化（需避免過度消化）或使用細胞刮（動作要快）采集細胞；

4℃，300g，5min離心去除上清液；加入預冷PBS重懸細胞后，再4℃，300g，5min

4新鮮培養(yǎng)細胞

離心沉淀細胞，去除上清液；液氮速凍后-80℃保存；

4.2懸浮細胞：采集細胞懸液至離心管；4℃，300g，5min離心去除上清液；經(jīng)預冷PBS輕柔

重懸細胞成單細胞懸液后，再次離心去除上清；液氮速凍后-80℃保存。

5.1采集血液后放入試管，室溫靜置30min；

5.2如不能及時處理樣品，需將新鮮采集的血液置于4℃冰箱，2h內(nèi)離心；

5血清

5.3待血液凝結(jié)后，2000g離心10min，小心吸取上層淡黃色清液于EP管；

5.4液氮速凍后-80℃保存。

6血漿6.1用抗凝管收集血液，輕柔顛倒混勻5次，室溫靜置30min；

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樣品類型樣品采集與保存要求

6.21500g離心10min去除血細胞，吸取上清液至凍存管或EP管；

6.3液氮速凍后-80℃保存。

7.11500g離心10min去除體液中的沉淀，保留上清液至凍存管或EP管；

7唾液、羊水、腦脊液

7.2液氮速凍后-80℃保存。

8.15000g離心30min去除體液中的細胞及尿沉渣，保留上清液至收集管；

8尿液

8.2液氮速凍后-80℃保存。

6.2所有前處理步驟應(yīng)盡量保證在冰上或4℃下低溫操作，并盡可能縮短操作時間以減小蛋白質(zhì)降解

幾率。

6.3制塑劑、聚乙二醇（Polyethyleneglycol，PEG）等表面活性劑屬于污染物，容易影響數(shù)據(jù)質(zhì)量，

應(yīng)避免使用含此類污染物的槍頭、EP管或凍存管處理和保存樣品。

6.4應(yīng)使用旋蓋密封管或氣密性好的容器保存樣品，以免液氮速凍或低溫保存時因氣壓變化造成管蓋

彈開。不方便存儲在EP管或凍存管中的體積較大的組織樣品，可采用錫箔紙等材料仔細包裝。樣品如

需運輸，應(yīng)用封口膜密封管蓋。

7蛋白質(zhì)提取

7.1針對不同樣品類型，提取蛋白質(zhì)的步驟和方法有所不同，需要根據(jù)樣品類型選擇對應(yīng)方法進行操

作，具體參考表3。

表3樣品前處理

樣品類型樣品前處理備注

1.1低溫快速將大塊的組織剪或切成小塊，使用含1%蛋白酶抑制劑的預冷PBS緩沖液反

復進一步清洗去除血液；

1.2組織塊中如含有血管、脂肪等非目標檢測物，應(yīng)盡量剝離去除；

1.3樣品吸干后稱重并記錄；

1.4進一步破碎組織塊，可選擇液氮研磨、勻漿或加入合適直徑的研磨珠后使用組織破

a應(yīng)盡量充分破

1新鮮動物碎儀將組織破碎；碎和溶解樣品，

組織1.5加入蛋白質(zhì)裂解液溶解破碎樣品，部分組織可能較難溶解，可添加蛋白質(zhì)裂解液后但也需要盡可

在低溫下超聲破碎，或用渦旋振蕩器劇烈振蕩，使其盡可能均勻溶于裂解液中。骨能減少不必要

組織等無機鹽含量高的組織塊最終無法全部溶解，屬正常現(xiàn)象。的破碎步驟，以

a：對于大多數(shù)組織選用1.0mm直徑的研磨珠，纖維類植物樣品如單子葉植物的葉子用2mm～3mm，減少樣品損失；

茵類用0.5mm，細胞類用0.1mm直徑的研磨珠。針對不同的組織類型,珠子的用量不同，如動物組

蛋白質(zhì)裂解液

織球料比一般為1：1，球和料的體積最少不能少于容器的1/3,最高只能2/3。若發(fā)現(xiàn)研磨效果不好，

可以同時加入大小研磨珠配合研磨，另外可適當增加研磨珠數(shù)量和研磨時間。的量要加足，建

議按樣品重量：

2.1低溫快速將大塊的組織剪或切成小塊，液氮速凍后放入超低溫冰箱保存；

裂解液體積（w：

2.2由于植物細胞壁厚，應(yīng)使用液氮充分研磨破碎為細粉；

v）=1:5～1：

2.3加入蛋白質(zhì)裂解液溶解樣品后，需在低溫下（如冰浴）超聲破碎，或用渦旋振蕩器

2新鮮植物

劇烈振蕩（一般每振蕩3min需將樣品插入冰上靜置3min，振蕩次數(shù)則根據(jù)樣品溶10添加。即100

組織

解情況隨機調(diào)整），使其盡可能均勻溶于裂解液中；mg克樣品，加入

0.5mL～1mL

2.4由于植物樣品次級代謝產(chǎn)物和色素較多，容易干擾質(zhì)譜檢測，因此需要添加如丙酮、

三氯乙酸、甲醇等有機溶劑沉淀樣品的步驟來去除色素和次級代謝物、脂肪等雜質(zhì)。的蛋白質(zhì)裂解

液。

3.1菌體樣品因具細胞壁結(jié)構(gòu)，可采用液氮研磨、超聲或高壓細胞破碎儀等方法將菌體

沉淀塊充分破碎，充分破碎菌體，是提高蛋白質(zhì)提取效率的關(guān)鍵；

3細菌/真菌

3.2部分細菌（尤以革蘭陽性菌為甚）細胞壁非常厚，需要使用較強的破碎條件，如增

菌體

強破碎參數(shù)、增加破碎時間、組合3.1b中提到的多種破碎方法以充分破碎樣品；

3.3完成破碎后加入蛋白質(zhì)裂解液，反復震蕩以充分溶解樣品。

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樣品類型樣品前處理備注

4.1貼壁細胞長至90%密度時，吸干凈培養(yǎng)基，使用預冷的無菌PBS潤洗細胞表面1～2

次，吸干PBS后，將培養(yǎng)皿/瓶轉(zhuǎn)移到冰上操作，往培養(yǎng)皿/瓶中直接加蛋白質(zhì)裂解液，

按每25cm2培養(yǎng)瓶底面積加500μL～800μL體積裂解液，使用細胞刮反復刮下每1×106個細

4新鮮培養(yǎng)

培養(yǎng)皿/瓶中貼壁細胞，收集裂解液于EP管；胞添加200μL

細胞

4.2采集懸浮細胞懸液至離心管，離心去除上清液，經(jīng)預冷PBS清洗細胞沉淀塊后，4℃，蛋白質(zhì)裂解液。

300g，5min離心去除上清，按每1×106個細胞添加200μL蛋白質(zhì)裂解液，充分

吹打或渦旋以迅速溶解細胞沉淀塊。

5血清5～8體液類樣品中含高豐度蛋白質(zhì)（如：Albumin,IgG,IgG(lightchains),IgA,IgM,可不加蛋白質(zhì)

6血漿IgD,IgE等），會極大降低質(zhì)譜對其他中、低豐度蛋白質(zhì)的鑒定效率，從而得到較低的裂解液，經(jīng)蛋白

7唾液、羊總蛋白質(zhì)鑒定數(shù)量。若檢測目標為中、低豐度蛋白，可選擇的方法有兩種：質(zhì)濃度檢測后，

水、腦脊液1）采用高豐度蛋白質(zhì)去除試劑盒，以去除高豐度蛋白質(zhì)；直接進入酶解

8尿液2）或采用低豐度蛋白質(zhì)富集試劑盒，以富集低豐度蛋白質(zhì)。操作環(huán)節(jié)。

7.2應(yīng)選擇溶解性強的蛋白質(zhì)裂解液裂解樣品，推薦蛋白質(zhì)裂解液見表4，亦可采購樣品溶解效果好、

蛋白質(zhì)提取效率高、酶解及質(zhì)譜兼容的商品化蛋白質(zhì)裂解液。為取得最佳的使用效果，可以適當將裂解

液分裝后使用，應(yīng)盡量避免過多的反復凍融。

表4各種裂解液主要特點、差異和選擇

裂解液編號1號2號3號4號5號

細胞組織蛋白質(zhì)提取裂

1%SDS裂解液4%SDS裂解液1%SDC裂解液8M尿素裂解液水化液

解液

7M尿素，2M硫

1%（w/v）SDS，1%4%（w/v）SDS，1%脲，20mMDTT，

8M尿素，1%

（w/v）蛋白酶抑制（w/v）蛋白酶抑1%（w/v）SDC，1001%（w/v）蛋白酶

（w/v），100mM

配方劑Cocktail，100制劑Cocktail，mMTris/HCl抑制劑

Tris/HCl（pH

mMTris/HCl100mMTris/HCl（pH8.0）。Cocktail，2%

8.0）。

（pH8.0）。（pH8.0）。（w/v）CHAPS，

1%（w/v）SDS。

裂解強度強強強強強

對膜蛋白的提取好較好較好較好非常好

對胞漿蛋白的提取很好很好很好很好很好

對核蛋白的提取很好很好很好很好很好

胞漿磷酸化蛋白提取很好很好很好很好很好

細胞核轉(zhuǎn)錄因子提取很好很好很好很好很好

含蛋白酶抑制劑是是否否是

含磷酸酯酶抑制劑否否否否否

不同物種樣品兼容性高高高高高

推薦的蛋白質(zhì)濃度檢測去垢劑兼容的

BCA試劑盒BCA試劑盒BCA試劑盒BCA試劑盒

試劑盒Bradford試劑盒

若進行超濾管輔助酶解，

否否否否否

是否需要丙酮沉淀？

若進行非超濾管輔助的

溶液酶解，是否需要丙酮是是否否是

沉淀？

若進行膠內(nèi)酶解，是否需

否否否否否

要丙酮沉淀？

植物、細菌（革

貼壁細胞、懸浮細蘭陽性菌）、真

優(yōu)先推薦裂解的樣品類動物組織、細菌動物組織、細菌（革動物組織、細菌

胞、外泌體、亞細菌、膜蛋白含量

型（革蘭陰性菌）蘭陰性菌）（革蘭陰性菌）

胞器高的樣品類型、

難溶性蛋白質(zhì)

7.3若選擇表4中的1號、2號、4號和5號裂解液則按照以下步驟進行操作：

a)需在使用裂解液前新鮮加入終濃度為1mM的PMSF。如需檢測磷酸化蛋白，必須加入含磷酸酶

抑制劑的蛋白酶抑制劑化合物。所有步驟都需在冰上或4℃進行；

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b)加入蛋白質(zhì)裂解液后在冰上裂解30min，每隔10min渦旋震蕩樣品管20s，可促進蛋白質(zhì)

從細胞中釋放；

c)在4℃，16000g離心30min，收集上清液為樣品蛋白質(zhì)溶液，可進行步驟7.5的蛋白質(zhì)濃度

測定；

d)此步驟獲得的蛋白質(zhì)樣品可直接進行后續(xù)實驗，也可分裝保存至-80℃冰箱/液氮罐中。此步

驟獲得的蛋白質(zhì)樣品可直接兼容步驟10.1介紹的超濾管輔助酶解實驗流程。

7.4若選擇3號裂解液則按照以下步驟進行操作：

a)金屬浴95℃，1000rpm振蕩5min；對于血液樣品，可直接取0.5μL進行酶解步驟的操作；

b)在4℃，12000g離心20min，取蛋白質(zhì)上清液，可進行步驟7.5的蛋白質(zhì)濃度測定；

c)此步驟獲得的蛋白質(zhì)樣品可直接進行后續(xù)實驗，也可分裝保存至-80℃冰箱/液氮罐中。此步

驟獲得的蛋白質(zhì)樣品可直接兼容步驟10.2介紹的快速溶液內(nèi)酶解實驗流程。

7.5若選擇1號、2號、3號和4號裂解液應(yīng)選擇BCA法（BicinchoninicAcid）蛋白質(zhì)濃度檢測試劑

盒對測定樣品蛋白質(zhì)濃度，選擇5號裂解液則應(yīng)選擇考馬斯亮藍法（Bradford）。通常人和小鼠軟組織

樣品蛋白質(zhì)總量/樣品重量在0.5%～0.7%為正常蛋白質(zhì)提取效率，蛋白質(zhì)總量不低于200μg、蛋白質(zhì)

濃度不低于1μg/μL說明提取效果較好。

8樣品運輸

8.1樣品如果需要運輸，應(yīng)盡量送往距離最近的實驗室進行后續(xù)實驗操作。

8.2如需低溫運送，應(yīng)使用足夠多的冰袋和保溫盒，保證整個運輸過程中的溫度維持在-20℃。

8.3空運時可使用-20℃封閉式冰盒，以防止溫度過低而使塑料管變脆破裂。

9蛋白質(zhì)樣品質(zhì)量控制

使用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）對樣品進行質(zhì)檢，將所有蛋白質(zhì)樣品取等量（推薦上樣量：

20μg蛋白質(zhì)/樣品）加載到凝膠后進行電泳，對凝膠進行考馬斯亮藍染色，脫色至背景透明無色后使用

凝膠成像儀掃描獲得樣品的完整蛋白質(zhì)組條帶。樣品結(jié)果判定及對應(yīng)解決方法見表5。

表5SDS質(zhì)量控制結(jié)果判定及解決方法

SDS結(jié)果質(zhì)檢結(jié)果判定解決方法

背景干凈，可明顯分辨蛋白質(zhì)梯狀條帶，

在不同分子量間分布均勻，同類樣品間蛋

質(zhì)量高，可繼續(xù)后續(xù)實驗操作。/

白質(zhì)條帶整體和局部無明顯差異，各泳道

重復性和顏色一致。

蛋白質(zhì)濃度檢測結(jié)果不準確，不

樣品間的蛋白質(zhì)條帶灰度值差異過大。重新進行蛋白質(zhì)濃度檢測后再次質(zhì)檢。

符合要求。

再次實驗，重新提取蛋白質(zhì)，再次質(zhì)檢判

樣品質(zhì)量存疑，有待再次實驗判

同一類型樣品蛋白質(zhì)條帶分布差異過大。定是提取不充分導致條帶差異過大還是樣

定。

品本身存在差異。

蛋白質(zhì)分布不均勻，出現(xiàn)如：分布在某一

蛋白質(zhì)提取效率低，提取不充使用較前更強的破碎/裂解條件處理樣品后

范圍分子量的蛋白質(zhì)條帶過少，或樣品條

分。不符合要求。再次質(zhì)檢。

帶分布零星且單一。

蛋白質(zhì)條帶中橫紋、縱紋較多，或背景較蛋白質(zhì)樣品中鹽類等雜質(zhì)含量使用有機溶劑如丙酮、甲醇沉淀蛋白質(zhì)后

深，無法清洗分辨出蛋白質(zhì)梯狀條帶。高，不符合要求。溶于蛋白質(zhì)裂解液后再次質(zhì)檢。

無明顯梯狀蛋白質(zhì)條帶、條帶出現(xiàn)拖尾、采集新鮮樣品，注意操作手法，重新進行

蛋白質(zhì)樣品發(fā)生降解。

主要條帶堆積在低分子量區(qū)域。蛋白質(zhì)提取和質(zhì)檢。

10蛋白質(zhì)酶解及除鹽

10.1超濾管輔助的蛋白質(zhì)酶解（Filter-aidedsamplepreparation，F(xiàn)ASP）

10.1.1當使用的蛋白質(zhì)裂解液為SDS裂解、水化液，或含有PEG及各種表面活性劑（如SDS、CHAPS、

Triton、Tweens、DMSO、NP-40等），應(yīng)使用FASP方法進行酶解。

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10.1.2采購質(zhì)譜級品質(zhì)的試劑耗材進行實驗，蛋白質(zhì)酶解及除鹽的試劑配方見表6。

表6非標記定量蛋白質(zhì)組蛋白質(zhì)酶解及除鹽試劑配方

試劑配方主要溶劑備注

應(yīng)新鮮配置，現(xiàn)配現(xiàn)用；使用

8MUrea，100mMTris/HCl，pH8.0～

8M尿素（Urea）緩沖液前充分混勻；操作過程應(yīng)注意

8.5

溫度不可超過37℃。

500mM碘乙酰胺（IAA）500mMIAA現(xiàn)配現(xiàn)用，避光使用。

1M二硫蘇糖醇（DTT）1MDTT

50mM三乙基碳酸氫銨（TEAB）50mMTEAB

金標水

0.5%三氟乙酸（TFA）0.5%（v/v）TFA

0.1%TFA0.1%（v/v）TFA

5%（v/v）乙腈（ACN），0.5%（v/v）現(xiàn)配現(xiàn)用。

平衡液

TFA

0.1%甲酸（FA）0.1%（v/v）FA

溶劑A2%ACN，98%H2O，0.1%FA

溶劑B80%ACN，20%H2O，0.1%FA質(zhì)譜級乙腈

10.1.3取7.3c）步驟獲得的蛋白質(zhì)50μg～100μg進行酶解。

10.1.4加適當體積的8M尿素，使其終濃度大于4M。

10.1.5加適量體積的1MDTT溶液，使其工作濃度為20mM。

10.1.637℃水浴1小時。

10.1.7待樣品恢復至室溫，加適量體積500mM的IAA，使其工作濃度在50mM。

10.1.8室溫避光孵育30分鐘。

10.1.9加入200uL的50mM的TEAB潤洗新的V型超濾管（10Kda），12000g離心10min至液體

全部濾下。

10.1.10樣品加入超濾管，每管體積不要超過400μL，4℃，12000g離心，單次離心時間不可超過

15min，離心次數(shù)視超濾管內(nèi)殘留液體情況而定，直至液體全部濾下。

10.1.11加200μL的8M尿素，4℃，12000g離心潤洗樣品，單次離心時間不可超過15min，離心

次數(shù)視超濾管內(nèi)殘留液體情況而定，直至液體剛好全部濾下；若使用的離心機是定角轉(zhuǎn)子，在每一次離

心前可水平旋轉(zhuǎn)超濾管180°，以使樣品得到更充分的潤洗。

10.1.12若細胞組織裂解液中含SDS、硫脲、CHAPS、β-巰基乙醇、Triton、DMSO等去垢劑成分，需重

復10.1.10步驟3次～6次，方能去除以上物質(zhì)的干擾；若使用的裂解液是8M尿素裂解液則重復

10.1.10步驟一次即可。

10.1.13加入200μL的50mMTEAB潤洗樣品2次～5次，根據(jù)步驟10.1.10的離心難易程度調(diào)整

離心次數(shù)，越難離心的樣品應(yīng)該增加離心次數(shù)。

10.1.14將超濾管從舊收集管套中取出，用干凈的無粉濾紙將超濾管外的液體吸干，將超濾管放置到

新的收集管套中。

10.1.15依次加入50mM的TEAB和胰蛋白酶溶液。

10.1.16加入TEAB的體積依據(jù)所加胰蛋白酶的體積定，使兩者體積之和為120μL～130μL。

10.1.17胰蛋白酶溶液可配置為1μg/μL，按照與蛋白質(zhì)的量比例為1:30～1:50加入，渦旋震蕩1min；

10.1.18封口膜封住，放入37℃培養(yǎng)箱過夜。

10.1.19酶解時間8h～16h，不能超過16h。

10.1.20在室溫下，12000g離心，轉(zhuǎn)移收集濾下的多肽溶液至干凈的EP管。

10.1.21超濾管內(nèi)加70μL的50mMTEAB，渦旋振蕩；在室溫下，12000g離心，轉(zhuǎn)移濾下多肽溶液

與步驟10.1.20的多肽過濾液混合。

10.1.22重復10.1.21步驟一次。

10.1.23使用BCA多肽濃度測定試劑盒測定多肽濃度，計算酶解效率（酶解效率=酶解后多肽量/酶

解前蛋白量），酶解效率一般在60%～90%說明酶解效率和多肽回收率較好。

10.1.24使用真空冷凍干燥機凍干縮小樣本體積至50μL，轉(zhuǎn)到步驟10.3進行多肽除鹽。

10.2溶液內(nèi)酶解（Insolutiondigestion）

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10.2.1取步驟7.4b)獲得的蛋白質(zhì)10μg～30μg（總體積不能超過20μL），加入終濃度為20mM

的三(2-羧乙基)膦（Tris(2-carboxyethyl)phosphine，TCEP）和終濃度為40mM的2-氯乙酰胺

（2-Chloroacetamide，CAA），金屬浴95℃，1000rpm振蕩5min。

10.2.2加熱結(jié)束待樣品恢復至室溫后，加入15μL的胰蛋白酶與重組賴氨酸酶（Lys-C）混合物；添

加比例為：胰蛋白酶：蛋白（質(zhì)量比）=1：20、Lys-C；蛋白(質(zhì)量比）＝1：50，并吹打混勻；混勻，

金屬浴37℃，800rpm振蕩酶解2h。

10.2.3加入終濃度0.5%的TFA混勻，終止酶解反應(yīng)，此時會有沉淀出現(xiàn)，20000g室溫離心1min，

吸取上清為酶解好的多肽，使用BCA多肽濃度測定試劑盒測定多肽濃度。

10.2.4酶解后樣本如不能及時進行后續(xù)脫鹽處理，可-80℃存放2周。

10.3多肽除鹽

10.3.1將步驟10.1.24或10.2.4得到的多肽溶液，取0.5μL～1μL樣品點在pH試紙上檢測此時

樣品pH值，可使用20%TFA溶液條件樣品pH值，確保樣品pH﹤3。

10.3.2加入100微升質(zhì)譜級ACN，室溫1000g離心1min，以活化C18除鹽柱。

10.3.3加入100微升平衡液，室溫1000g離心1min，以平衡C18除鹽柱；重復此步驟一次。

10.3.4把復溶好的多肽溶液加入C18除鹽柱，1000g室溫離心1min，使多肽溶液從柱子流出，并檢

查多肽溶液是否都穿過柱子，如果溶液未完全穿過柱子，可適當延長離心時間，但不可增加離心力；收

集流出溶液，反復過柱子2次以增加C18對多肽的吸附效果。

10.3.5加入100μL0.1%的TFA溶液，1000g室溫離心1min，以濾洗除鹽柱，重復濾洗1次。

10.3.6更換新的收集管，加入50μL70%的ACN溶液至除鹽柱，1000g室溫離心1min，將肽段洗脫

下來；重復一次本步驟，最終樣本體積約為100μL，此時得到除鹽后的多肽溶液。

10.3.7使用真空冷凍干燥機凍干得到除鹽后的多肽干粉，凍干后可于-80℃保存1年。

10.3.8加入10μL～20μL0.1%甲酸重新溶解多肽干粉，經(jīng)BCA多肽濃度測定試劑盒定量后，各樣

品分別取10μg多肽，凍干后等待進行質(zhì)譜分析。

10.4TMT標記實驗流程

10.4.1TMT標記實驗

采購質(zhì)譜級品質(zhì)的試劑耗材進行實驗，TMT標記實驗試劑及說明詳見表7。

表7TMT標記實驗試劑及說明

試劑說明

1M的TEAB用于同量異位質(zhì)量標簽標記實驗的10X溶解緩沖液。

50%羥胺10X淬滅試劑，用于TMT實驗的胺反應(yīng)性標記。

是串聯(lián)質(zhì)譜標簽，設(shè)計用于提高樣品多通路水平，同時不影響蛋白鑒定和定量。Thermo

TMTpro標記試劑

ScientificTMTpro18plex標記試劑套件實現(xiàn)對多達18份樣品的多通路檢測。

從-80℃取出標記試劑使其恢復室溫，加入ACN，使標記試劑終濃度為20μg/μL。

將步驟10.2.3獲得的不同樣品的多肽干粉取出7μg多肽后真空濃縮干，然后用4μL0.1M

的TEAB溶解。

將TMT標記試劑順序打亂，向每一個樣本中隨機加入2.1μL標記試劑，充分混勻。

25℃金屬浴上反應(yīng)1.5h。

加入0.5μL5%羥胺，混勻后室溫放置15min，以終止反應(yīng)。

每樣品各取2μL混合成一管，將混合樣品使用質(zhì)譜儀檢測各樣品的含量是否一致以及標記

效率是否大于95%，剩余的樣品可進行真空濃縮干燥等待除鹽。

標記效率大于95%說明標記成功。

10.4.2TMT標記后的多肽除鹽

采購質(zhì)譜級品質(zhì)的試劑耗材進行實驗，TMT標記實驗試劑及說明詳見表8。

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表8TMT標記后多肽除鹽耗材及試劑配方

試劑耗材耗材及試劑配方

除鹽柱Sep-PakC181ccVacCartridge50mg

活化液無水甲醇

平衡液80%ACN，0.1%TFA

多肽溶解液2%ACN，0.1%TFA

清洗液2%ACN，0.1%TFA

洗脫液40%ACN，0.1%TFA

用適配的注射器緩慢加入1mL活化液，讓活化液從柱子流出，以活化C18除鹽柱，去除管

底流出液。

加入1mL平衡液，去除管底流出液。重復此步驟一次。

使用400μL多肽溶解液溶解步驟獲得的多肽干粉，將溶解好的多肽溶液緩慢加

入除鹽柱，吸取從除鹽柱流出的溶液重新緩慢加入除鹽柱，以增加C18填料對多肽的吸附效率。

加入1mL清洗液，去除管底流出液。重復此步驟一次，將除鹽柱放入新的收集管。

加入200μL洗脫液。重復此步驟一次，此時得到400μL除鹽后的多肽溶液。

使用真空冷凍干燥機凍干得到除鹽后的多肽干粉，凍干后可于-80℃保存1年。

按照步驟10.6對凍干后的多肽樣品分餾。

10.5iTRAQ標記定量蛋白質(zhì)組蛋白質(zhì)酶解及標記（以8標為例）

10.5.1蛋白質(zhì)酶解

蛋白質(zhì)定量后取20μg～100μg蛋白溶液置于離心管中，如果是血清、血漿等含有非蛋白

氮（Non-proteinamines）的樣本，則需要減少樣本的總量。

往樣品中加入5倍體積預冷丙酮，-20℃放置1小時，充分沉淀蛋白。

4℃，12000g離心10min，取沉淀真空冷凍干燥。

加入50μL的DissolutionBuffer（試劑盒自帶）充分溶解蛋白沉淀。

加入1μLDenaturant（試劑盒自帶），渦旋混勻。

加入2μLReducingReagent（試劑盒自帶），渦旋混勻，60℃反應(yīng)1h。

低速離心收集管壁液體，加入2μLCysteine-BlockingReagent（試劑盒自帶），渦旋混

勻，室溫10分鐘。

用100μL的50mMTEAB潤洗超濾管（10Kda），12000g離心15min，將還原烷基化后的

蛋白溶液加入超濾管中，12000g離心20min，直到超濾膜上沒有過剩的液體，棄掉收集管底部溶液（轉(zhuǎn)

速設(shè)置不超過使用的超濾管的最高值，單次離心時間不超過15min，離心次數(shù)可根據(jù)超濾管內(nèi)殘留液

體量實際情況進行調(diào)整，直至將所有體離心濾出）。

加入iTRAQ試劑盒中的DissolutionBuffer100μL，12000g離心20min，棄掉收集管底

部溶液，重復3次本步驟。

0更換新的收集管，在超濾管中加入胰蛋白酶，總量1-2μg（與蛋白質(zhì)量比1：50～1：100），

體積25μL，37℃酶切8h～16h。

1取出超濾管，渦旋1min后，12000g離心20min，將酶解消化后的肽段溶液離心于收集管

底部。

2在超濾管中加入25μLDissolutionBuffer，渦旋1min，12000g再次離心20min，與

上步驟1濾出液合并，收集管底部共得到50μL酶解后的樣品（如果體積有損失，加入

DissolutionBuffer調(diào)至50μL）。

10.5.2iTRAQ標記

從冰箱中取出iTRAQ標記試劑，平衡到室溫，將iTRAQ標記試劑室溫低速離心至管底（檢查

iTRAQ標記試劑的體積，約為25μL左右）。

向每管iTRAQ標記試劑中加入150μL有機溶劑（加入的有機溶液的體積可以根據(jù)樣品體積

進行調(diào)整，保證其終濃度為70%以上；4標的有機溶劑為乙醇，8標的有機溶劑為異丙醇），渦旋振蕩，

室溫低速離心至管底。

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取50μL步驟2獲得的樣品轉(zhuǎn)移到新的離心管中。

將iTRAQ標記試劑添加到樣品中，渦旋振蕩，室溫低速離心至管底，取0.5μL樣本檢測其

pH值，如果pH小于7.5，可以加入5μL的DissolutionBuffer。

室溫反應(yīng)2h。

加入100μL金標水終止反應(yīng)。

為了檢測標記效率及定量準確性，從8組樣品中各取出1ul混合，用Ziptip除鹽柱脫鹽后

進行質(zhì)譜鑒定，確認標記反應(yīng)良好，標記效率應(yīng)達到98%以上。

把8組標記后的樣品進行混合，渦旋振蕩，離心至管底。

真空冷凍離心干燥，凍干后的多肽樣本可保存于-80℃一年。

0按照步驟10.6對凍干后的多肽樣品分餾。

10.6肽段分餾（高pH反相分餾法）

10.6.1將標記好混合凍干后的樣本用150μL流動相A（20mM甲酸胺（pH10））復溶，渦旋振蕩，

12000g離心20min，吸取上清上樣。

10.6.2用Ultimate3000系統(tǒng)連接反向柱（XBridgeC18column,4.6mmx250mm,5μm）進行

高pH分離。

10.6.3準備48個1.5mL離心管，依次標記為1～48，用于收集分離得到的組份1～48。

10.6.4流速設(shè)置為0.8mL/min，分離梯度如表9：

表9高pH反相分餾梯度

時間（min）流動相B（20mM甲酸胺（pH10），80%ACN）

05%

55%

3015%

4538%

4690%

54.590%

555%