熒光定量PCR原理及實驗步驟_第1頁
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文檔簡介

熒光定量PCR原理及實驗步驟一、實時熒光定量PCR原理常規(guī)PCR技術(shù)對PCR擴增反應(yīng)的終點產(chǎn)物進行定量和定性分析無法對起始模板準(zhǔn)確定量，無法對擴增反應(yīng)實時檢測。實時定量PCR技術(shù)，在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對起始模板進行定量分析。幾個概念：擴增曲線：熒光閾值：Ct值：標(biāo)準(zhǔn)曲線SYBRGreen工作原理：1、SYBRGreen

能結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位2、SYBRGreen

只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光3、變性時，DNA雙鏈分開，無熒光4、復(fù)性和延伸時，形成雙鏈DNA，SYBRGreen發(fā)熒光，在此階段采集熒光信號。二、實驗步驟1.實驗前先在大型儀器共享平臺上預(yù)約多元熒光定量PCR儀。將所需引物和SYBgreen（避光）拿出，解凍。計算好所有引物和SYBgreen的用量。反應(yīng)體系（25μL）如下：H2O11μLSYBgreen12.5Μl上游引物0.25μL下游引物0.25μLcDNA1μL可先將H2O和SYBgreen按照所需量配好后，分裝，再根據(jù)需要加引

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