中藥鑒定創(chuàng)新方法體系的建立與推廣

DNAbarcodingsystemforherbalmaterials

陳士林ShilinChen中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所中藥鑒定技術(shù)瓶頸

一萬余種中藥材物種鑒定品種混亂傳統(tǒng)四大鑒定方法體系的局限路在何方？基原鑒定形態(tài)鑒定顯微鑒定理化鑒定DNA條形碼中藥鑒定領(lǐng)域的變革與突破經(jīng)典中藥鑒定方法難以滿足現(xiàn)代需求鑒定方法缺失導(dǎo)致嚴(yán)重安全性事件

--關(guān)木通誤當(dāng)木通服用，導(dǎo)致急性腎功能衰竭（馬兜鈴酸腎病事件）

--土三七誤當(dāng)三七服用，導(dǎo)致嚴(yán)重肝毒性Hoangetal.ScienceTranslationalMedicine,2013,5:197ra102.NortierJL,MartinezMCM,SchmeiserHH,etal.NewEnglandJournalofMedicine,2000,342(23):1686-1692.關(guān)木通百度百科木通中藥材天地網(wǎng)DNAbarcodingcanachievearapidandaccurateidentificationforherbsApowerfultoolforidentifyingmedicinalplantsandtraditionalChinesemedicinalmaterialsAbruscantoniensis

Abrusprecatorius

MedicinalplantsChineseherbalmedicinesDNAbarcodingtechnologyusesashortandstandardizedgeneregiontoidentifyspeciesOnesequenceOnespecies首次驗(yàn)證ITS2為藥用植物鑒定通用條形碼通過研究比較psbA-trnH,matK,rbcL,rpoC1,ycf5,ITS2和

ITS等七個候選DNA條形碼，發(fā)現(xiàn)ITS2是最佳條形碼序列ITS2長度約230bp，易于擴(kuò)增和測序，物種鑒定能力強(qiáng)，適合中藥材等存在DNA降解材料的鑒定人參、西洋參、羌活、寬葉羌活DNA條形碼鑒定方法正在納入國家藥典

Relativedistributionofinter-specificdivergencebetweencongenericspeciesandintra-specificvariationforfourloci.Thetwobarsineachboxrepresentinter-specific(above)andintra-specific(below)geneticdistances.IdentificationofthefamilyRosaceaeW+W-RelativeRanks,n,PvalueResultITS2matKW+=703,W-=0,n=37,P≤1.139×10-7ITS2>matKITS2rbcLW+=703,W-=0,n=37,P≤1.137×10-7ITS2>rbcLITS2rpoC1W+=703,W-=0,n=37,P≤1.133×10-7ITS2>rpoC1matKrbcLW+=620,W-=46,n=36,P≤6.479×10-6matK>rbcLmatKrpoC1W+=655,W-=11,n=36,P≤4.174×10-7matK>rpoC1rbcLrpoC1W+=359,W-=106,n=30,P≤0.009rbcL>rpoC1Wilcoxonsigned-ranktestsofinter-specificdivergenceamongloci.ITS2andrbcL,matK,rpoC1werecompared.For54samplesfrom43speciesin19diversegenera,thesuccessfulidentificationratewithITS2was100%,followedbymatK(94%)andrbcL(65%).

For1410samplesfrom893speciesin96genera

No.ofgenera(≥2species):47(1351samples)

No.ofspecies(≥2samples):297(814samples)

IdentificationratewithITS2was100%and78%at

genusandspecieslevel,respectively.XPang,ShilinChen*.Cladistics,2011,27ComparativeanalysisofalargedatasetindicatesthatITSshouldbeincorporatedintothecorebarcodeforseedplants

ChinaPlantBOLGroup,LiDezhuetal.,PNAS,2011WethereforeproposethatITS/ITS2shouldbeincorporatedintothecorebarcodeforseedplants.(建議ITS/ITS2應(yīng)成為種子植物的核心條形碼)IncaseswhereitisdifficulttoamplifyanddirectlysequenceITSinitsentirety,justusingITS2isausefulback-upasitiseasiertoamplifyandsequencethissubsetofthemarker.(ITS難以擴(kuò)增和測序時，ITS2可以有效地彌補(bǔ)該缺陷)

創(chuàng)建ITS2為主體條形碼的中草藥鑒定體系研究一萬余份藥材樣本（涉及數(shù)千個基原物種）70余篇相關(guān)文章發(fā)表于Cladistics、PLoSONE、PNAS、BMCEvolBiol、中國科學(xué)等雜志出版《中藥DNA條形碼分子鑒定》人民衛(wèi)生出版社起草中國藥典中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則，已獲準(zhǔn)納入國家藥典建立中藥DNA條形碼分子鑒定標(biāo)準(zhǔn)流程冬蟲夏草混偽品及近緣種人造偽品：滇紫菀冬蟲夏草及其混偽品/近緣種背景：分布范圍狹窄，生態(tài)環(huán)境脆弱，資源蘊(yùn)藏量有限（產(chǎn)量每年80-100噸）；

市場產(chǎn)不足銷，價格已超黃金(Guo,2012)

混偽品泛濫，如古尼蟲草，蛹蟲草，人造偽品滇紫菀等

樣品：冬蟲夏草與13種混偽品及近緣種，冬蟲夏草采自四川、青海、西藏等主產(chǎn)區(qū)

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條ITS/ITS2序列

(冬蟲夏草樣品53份，偽品45份，GenBank序列87條)A：正品：冬蟲夏草B：偽品：亞香棒蟲草/古尼蟲草C：人造偽品：滇紫菀D：偽品涼山蟲草E：偽品：蟬花F：偽品：下垂蟲草G：偽品：Cordycepsrobertsii（新西蘭）結(jié)果：基于BLAST/DISTANCE的鑒定效率：100%基于NJtree的鑒定結(jié)果：所有的冬蟲夏草序列單獨(dú)聚為一支，

并能與所有的混偽品及近緣種區(qū)分開XiangL,ChenSL,etal.FEMSmicrobiologyletters,2013,347(2):156-162.DNA條形碼鑒定冬蟲夏草及其偽品《中國藥典》中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則

Morphologicalcharacteristicsofthepowder,decoctionpieces,seed,seedling,andfibreamongtheP.ginseng,P.quinquefolius,Pnotoginsenganditscloselyrelatedspeciesaresimilar.Itisdifficulttoidentifysomanydifferentpanaxspeciesandginsengproduceinmedicinalusesbytraditionalclassificationmethods.UsingDNAbarcodetoidentifypanaxmedicinalspecies人參類及其混偽品的鑒定13

15101520253035404550SN01:p.ginseng;SN03:p.quinquefolius顯示人參、西洋參ITS2序列的SNPs位點(diǎn)信息。Position32and43為區(qū)別人參和西洋參的SNPs位點(diǎn)為驗(yàn)證該方法準(zhǔn)確性，我們下載了GenBank所有人參、西洋參ITS2序列，表明兩個SNPs位點(diǎn)穩(wěn)定存在樣品來源：采集了主產(chǎn)區(qū)吉林，遼寧，黑龍江，北京，山東,加拿大及上海和香港藥市人參西洋參樣品共計(jì)72份應(yīng)用ITS2序列兩個SNPs可以快速準(zhǔn)確鑒別人參西洋參，所得組合為C-T，則確定為人參，所得組合為T-C，則確定為西洋參ITS2sequenceposition1-50ofp.ginsengandp.quinquefolius

方法結(jié)果結(jié)論基于ITS2條形碼鑒定人參和西洋參Gene,2013,530(1):39-43.AFastSNPIdentificationofMedicinalPanaxSpeciesBasedonDNABarcodingAnalysis,

14金銀花藥材及其混偽品的ITS2條形碼鑒定金銀花（忍冬）山銀花（紅腺忍冬）山銀花（黃褐毛忍冬）山銀花（灰氈毛忍冬）研究對象：包括24份金銀花藥材。M:marker1、26:陰性對照(CK)2-25:金銀花27-47：混偽品DNA提?。喝〗疸y花藥材約25mg，利用植物基因組DNA提取試劑盒(TiangenBiotechCo.,China)提取總DNA。ITS2序列PCR擴(kuò)增程序及電泳圖94℃變性5min94℃變性30sec58℃退火30sec72℃延伸45sec72℃延伸10min40個循環(huán)BLAST鑒定

IdentificationofCortexHerbsSunZY,ChenSL*.JNatMed.2012.Theidentificationefficiencyof51samplesbelongingto19kindsof

cortexherbsinChinesePharmacopoeia

examinedwas100%usingITS2sequenceasDNAbarcode.ApplytheITS2barcodetoauthenticate

medicinalmaterials皮類藥材的條形碼鑒定條羌N.franchetii大頭羌N.franchetii蠶羌N.incisumPhylogenetictreeconstructedwiththeITS/ITS2sequencesadulterantsITSITS231medicinalmaterialssamplesStabilityandAccuracyoftheIdentificationusingITS/ITS2barcodes

(Notopterygii)羌活藥材ITS/ITS2條形碼鑒定及其穩(wěn)定性與準(zhǔn)確性研究TheNJtreesshowedthatQianghuoanditsadulterantscanbeeasilydifferentiatedaccordingtotheirmonophyly..ITSITS2HaplotypeVariablesitesHaplotypeVariablesitesN.incisum4433N.franchetii61045XinTChenS*,etal.ActaPharmSin.2012,8UseofthepotentialDNAbarcodeITS2toidentifyherbalmaterials全草類DNA條形碼鑒定

TheITS2barcodecoulddistinguishsuccessfullyallthe34herbsfromtheir111adulterants.Figure1.Thepresence/absenceofbarcodegapsbetweenherbsandtheiradulterants.

PangXH,ChenSL*etal.JNatMed.2012建立中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)網(wǎng)站

DNAbarcodesystemshowsstrongabilitiesinidentifyingherbcrypticspeciesBLASTPROCESS打開網(wǎng)址，進(jìn)入中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)主頁點(diǎn)擊物種鑒定，選擇植物類藥材鑒定（ITS2/ITS）進(jìn)入右圖界面。在空白處粘貼入需要校對的序列（Query）點(diǎn)擊左下角的提交比對序列相似性信息100.0%為人參，說明該序列鑒定結(jié)果為人參Quick-and-easyDNAidentificationofherbsisunderway華潤三九中藥材DNA條形碼鑒定專用軟件2025/7/22

七葉皂苷注射劑娑羅子藥材的基原植物為七葉樹Aesculus

chinensis、浙江七葉樹Aesculus

chinensisvar.chekiangensis和天師栗Aesculus

wilsonii娑羅子藥材DNA條形碼鑒定1.材料

七葉樹屬10個物種42份樣本采自云南、四川、陜西、湖北、浙江和北京的各個分布區(qū)域結(jié)論七葉樹屬候列擴(kuò)增效率與測序成功率均為100%，并且物種鑒定效率最高，為95.4%，更適用于七葉樹屬的鑒定分析。psbA-trnH序列的種間差異最大，在區(qū)分物種上具有優(yōu)勢?；趐sbA-trnH序列構(gòu)建的NJ樹，可準(zhǔn)確鑒別其各個基原物種。七葉樹屬植物psbA-trnH序列比對變異位點(diǎn)圖正品柴胡Chaihu正品：為傘形科植物柴胡BupleurumchinenseDC.、狹葉柴胡B.scorzonerifoliumWilld.的干燥根。近緣種：同屬植物麗江柴胡B.rockii，小葉黑柴胡B.smithiivar.parvifolium，抱莖柴胡B.longicaulevar.amplexicaule，細(xì)莖有柄柴胡B.petiolulatumvar.tenerum和窄竹葉柴胡B.marginatumvar.stenophyllum。（三）柴胡與其近緣種的NJ樹圖所示：柴胡正品基原柴胡與狹葉柴胡均獨(dú)立聚為一支，與其混偽品可以區(qū)別開。結(jié)果表明：基于ITS2序列能很好的區(qū)分柴胡及其近緣種（一）柴胡及其及其近緣物種ITS2序列的二級結(jié)構(gòu)：（二）柴胡與其混偽品ITS2序列間存在較多變異位點(diǎn)柴胡不同基原ITS2條形碼consensus序列柴胡ITS2序列峰圖常用中藥材進(jìn)行了DNA條形碼研究課題組已經(jīng)進(jìn)行DNA條形碼研究的常用中藥材包括：人參，西洋參，三七，大黃，石斛，重樓，金銀花，丹參，天南星，紅豆蔻，肉蓯蓉，京大戟，麻黃，高良姜，何首烏，吳茱萸，連翹，甘草，玉竹，冬蟲夏草，羌活等

PublishedpapersonDNAbarcodeCladistics,2011,27:BMCEvol.Biol.,2010,10:324

PLoSONE,2010,5:e13102.ChinaPlantBOLGroup.PN