第57講基因工程的基本工具與操作程序【課標(biāo)要求】1.概述基因工程是在遺傳學(xué)、微生物學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等學(xué)科基礎(chǔ)上發(fā)展而來的；2.闡明重組DNA技術(shù)的實現(xiàn)需要利用限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶和載體三種基本工具；3.闡明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的獲取、基因表達載體的構(gòu)建、目的基因?qū)胧荏w細胞和目的基因及其表達產(chǎn)物的檢測鑒定等步驟?？键c1基因工程的基本工具考點透析知識1基因工程概述基因工程又叫作重組DNA技術(shù)。項目內(nèi)容主要技術(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)操作環(huán)境操作水平理論依據(jù)基因重組供體提供受體復(fù)制或表達目的基因基本過程切割→改造和拼接→導(dǎo)入→表達優(yōu)點克服的障礙，定向改造生物的知識2基因工程的基本工具1.限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶)圖中可見，限制酶在識別序列中心軸線兩側(cè)切開產(chǎn)生的是，在識別序列中心軸線處切開產(chǎn)生的是。2.DNA連接酶(1)作用：在兩個核苷酸之間形成以連接兩個DNA片段。(2)主要類型：①E.coliDNA連接酶：從中分離；②：從T4噬菌體中分離。兩者都能連接和平末端，但前者連接具有平末端的DNA片段的效率遠遠低于后者。歸納總結(jié)與DNA有關(guān)的酶酶作用作用相關(guān)“鍵”限制酶切割DNA片段，產(chǎn)生兩個(具有相同黏性末端或平末端)DNA片段破壞磷酸二酯鍵DNA連接酶催化兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，從而連接起來形成磷酸二酯鍵解旋酶將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈(ATP水解供能)破壞氫鍵(氫鍵非化學(xué)鍵)DNA聚合酶把游離的脫氧核苷酸連接到引物或者已有的DNA單鏈的3′端上形成磷酸二酯鍵DNA(水解)酶將DNA水解為脫氧核苷酸破壞磷酸二酯鍵逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成cDNA形成磷酸二酯鍵3.載體(1)作用：將基因送入細胞。(2)種類：質(zhì)粒、、動植物病毒等。(3)重要的載體之一——質(zhì)粒①質(zhì)粒的本質(zhì)：是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單，獨立于真核細胞的細胞核或原核細胞擬核DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的。②質(zhì)粒適于作基因載體的特點(載體須具備的條件)特點(條件)作用有一個至多個供外源DNA片段插入其中能在細胞中進行，或整合到受體DNA上，隨受體細胞DNA同步復(fù)制便于目的DNA在受體細胞中穩(wěn)定存在帶有(常是人工改造后具有)，一般為抗生素抗性基因或熒光基因等便于重組DNA分子的篩選(鑒定目的基因是否導(dǎo)入成功)深度指津最常見的標(biāo)記基因——抗生素抗性基因目的基因要轉(zhuǎn)入的受體細胞沒有抵抗相關(guān)抗生素的能力。當(dāng)含有抗生素抗性基因的載體進入受體細胞后，抗性基因在受體細胞內(nèi)表達，使受體細胞能夠抵抗相應(yīng)抗生素，所以在受體細胞的培養(yǎng)體系中加入該種抗生素就可以只保留轉(zhuǎn)入載體的受體細胞，原理如下圖所示(以氨芐青霉素抗性基因為例)：思辨小練1.判斷下列說法的正誤：(1)目前使用的限制酶都是從原核生物中得到的。()(2)質(zhì)粒是存在于細菌細胞中的一種細胞器。()(3)重組DNA技術(shù)所用的工具酶包括限制酶、DNA連接酶和載體。()(4)不同的限制酶切割DNA，可能得到相同的黏性末端。()(5)用DNA連接酶可連接兩種來源不同的DNA。()(6)用同一種限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，是為了獲得相同的黏性末端，以便連接。()(7)限制酶的識別序列都由6個核苷酸組成。()2.限制酶在原核生物中的作用是什么？它會不會切割自己的DNA分子？請解釋。典題說法考向1基因工程中工具酶的選擇和利用例1(2023·重慶卷)某小組通過PCR(假設(shè)引物長度為8個堿基，短于實際長度)獲得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶進行酶切(下圖)，再用所得片段成功構(gòu)建了基因表達載體。下列敘述錯誤的是()A．其中一個引物序列為5′－TGCGCAGT－3′B．步驟①所用的酶是SpeⅠ和CfoⅠC．用步驟①的酶對載體進行酶切，至少獲得了2個片段D．酶切片段和載體連接時，可使用E.coliDNA連接酶或T4DNA連接酶變式下表中列出了幾種限制酶識別序列及其切割位點，圖1、圖2中箭頭表示相關(guān)限制酶的酶切位點。請回答下列問題：限制酶BamHⅠHindⅢEcoRⅠSmaⅠ識別序列及切割位點eq\o(G,\s\up6(↓))GATCCCCTAeq\o(G,\s\do4(↑))Geq\o(A,\s\up6(↓))AGCTTTTCGeq\o(A,\s\do4(↑))Aeq\o(G,\s\up6(↓))AATTCCTTAeq\o(A,\s\do4(↑))GCCeq\o(C,\s\up6(↓))GGGGGeq\o(G,\s\do4(↑))CCC(1)一個圖1所示的質(zhì)粒分子經(jīng)SmaⅠ切割前后，分別含有個游離的磷酸基團。(2)若對圖中質(zhì)粒進行改造，插入的SmaⅠ酶切位點越多，質(zhì)粒的熱穩(wěn)定性越高。(3)用圖中的質(zhì)粒和外源DNA構(gòu)建重組質(zhì)粒，不能使用SmaⅠ切割，原因是。(4)與只使用EcoRⅠ相比較，使用BamHⅠ和HindⅢ兩種限制酶同時處理質(zhì)粒、外源DNA的優(yōu)點在于可以防止。(5)為了獲取重組質(zhì)粒，將切割后的質(zhì)粒與目的基因片段混合，并加入酶。(6)重組質(zhì)粒中抗生素抗性基因的作用是。深度指津限制酶選擇的常見考查方向(1)載體上的標(biāo)記基因至少保留一個(選擇培養(yǎng)基中加對應(yīng)的抗生素，且受體細胞不能有該標(biāo)記基因)。(2)只能切割目的基因兩側(cè)的序列，不能切割內(nèi)部，否則導(dǎo)致目的基因插入失活。(3)目的基因應(yīng)插在啟動子和終止子之間。(4)合理選擇單酶切或者雙酶切，即注意區(qū)分正向插入正常表達和反向插入異常表達。(5)不能破壞載體上的有用序列，如啟動子、終止子和復(fù)制原點等。(6)要破壞對受體細胞不利的DNA片段，如ccdB片段，其表達產(chǎn)物抑制DNA復(fù)制，導(dǎo)入細胞后阻礙受體細胞存活，難以形成單菌落。(7)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中最關(guān)鍵的是T－DNA序列，目的基因必須插在T－DNA上啟動子和終止子之間，最終轉(zhuǎn)化到植物染色體的標(biāo)記基因也是T－DNA上的。(8)注意長序列里面是否含有短序列的酶切位點，比如能被A酶(GGATCC)識別的DNA序列，也可被B酶(GATC)識別。(9)注意同尾酶拼接產(chǎn)物不一定還能被原先酶識別(限制酶的特征是識別特定核苷酸序列，切割特定位點，對堿基序列有嚴(yán)格要求)。(10)雙酶切不一定能實現(xiàn)目的基因定向插入正常表達，比如同尾酶，比如雙平末端。能實現(xiàn)目的基因定向插入的可能是“一平一黏”或“雙黏不同”。提醒：如果對限制酶的選擇仍有困難，建議考慮“排除法”?？枷?基因載體和標(biāo)記基因例2(多選)根據(jù)用途可將基因工程中常用的載體分為克隆載體和表達載體兩種，克隆載體的目的是復(fù)制出更多的目的基因，而表達載體的目的是使外源基因在受體中高效表達。下列有關(guān)敘述錯誤的是()A．克隆載體必須具備的元件是復(fù)制原點、啟動子和終止子B．兩種載體都要具有一個或多個限制酶切點，以便目的基因的插入C．表達載體的元件中必須含有標(biāo)記基因，不一定有復(fù)制原點D．質(zhì)粒、動植物病毒、噬菌體均可作為克隆載體或表達載體考點2基因工程的操作程序考點透析知識1基因工程的基本操作程序1.目的基因的篩選與獲取2.基因表達載體的構(gòu)建(核心工作)(1)過程(2)基因表達載體的組成深度指津復(fù)制原點≠啟動子≠起始密碼子，終止子≠終止密碼子(1)啟動子：一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的，基本組成單位是脫氧核苷酸，其位于基因的上游，緊挨轉(zhuǎn)錄的起始位點，其自身不轉(zhuǎn)錄。終止子：一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的下游。一個DNA上有多個啟動子。啟動子靠近模板鏈的3′端。(2)起始密碼子和終止密碼子位于上，分別控制翻譯過程的啟動和終止。起始密碼子靠近mRNA的5′端。(3)復(fù)制原點是DNA上的一段序列，富含A—T，是DNA復(fù)制開始的地方，一個DNA有一個或多個復(fù)制原點。3.將目的基因?qū)胧荏w細胞受體細胞常用方法操作過程植物細胞(常用體細胞或受精卵)(我國獨創(chuàng))方法一：用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房；方法二：將DNA溶液滴加在授粉后一定時間內(nèi)的花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進入胚囊將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T－DNA上→農(nóng)桿菌→感染植物細胞→T－DNA整合到受體細胞染色體的DNA上→表達動物細胞(常用受精卵)將含有目的基因的表達載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動物微生物細胞(感受態(tài)細胞法)Ca2＋處理細胞→感受態(tài)細胞→重組表達載體DNA分子與感受態(tài)細胞混合→感受態(tài)細胞吸收周圍環(huán)境中的DNA分子解疑釋惑(1)目的基因進入受體細胞內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的過程，稱為。實質(zhì)是目的基因整合到受體細胞染色體基因組中。(2)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法原理：農(nóng)桿菌易感染植物細胞，并將其Ti質(zhì)粒上的轉(zhuǎn)移并整合到受體細胞染色體DNA上。4.目的基因的檢測與鑒定(1)通過等技術(shù)檢測目的基因是否導(dǎo)入或是否轉(zhuǎn)錄出mRNA。(2)利用技術(shù)檢測目的基因是否翻譯。(3)進行個體生物學(xué)水平的抗蟲、抗病、功能活性等鑒定。注：若用報告基因，如綠色熒光蛋白基因與目的基因構(gòu)建融合基因，可根據(jù)熒光情況進行定性、定量和定位的研究分析。知識2PCR技術(shù)1.原理：和DNA的熱變性。2.特點：可在短時間內(nèi)目的基因。3.PCR反應(yīng)所需的條件及作用條件作用有一段已知目的基因的核苷酸序列便于合成在一定的中進行提供相對穩(wěn)定的pH環(huán)境4種脫氧核苷酸(實際上用脫氧核苷三磷酸，即dNTP)作為合成DNA子鏈的，同時提供DNA母鏈作為DNA復(fù)制的模板的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)催化合成DNA子鏈引物(是一小段，作為DNA復(fù)制的起始序列，它能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對)使DNA聚合酶能夠從引物的端開始連接脫氧核苷酸4.過程及圖解循環(huán)重復(fù)上述過程，n次循環(huán)后，目的基因的量將被擴增倍。思辨小練1.判斷下列說法的正誤：(1)利用PCR技術(shù)擴增目的基因時，兩種引物的堿基序列應(yīng)互補。()(2)體內(nèi)DNA復(fù)制和PCR技術(shù)都需要解旋酶打開DNA雙螺旋。()(3)體內(nèi)DNA復(fù)制和PCR過程中，都是一條鏈連續(xù)復(fù)制(前導(dǎo)鏈)，一條鏈不連續(xù)(后隨鏈)。()(4)構(gòu)建基因表達載體時，須將目的基因插入啟動子與終止子之間。()(5)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法常用的受體細胞是花粉細胞。()(6)目的基因必須整合到受體細胞的DNA中才能復(fù)制。()(7)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法實質(zhì)是將Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到宿主細胞的染色體上。()2.要合成有生物活性的胰島素，為什么受體細胞最好用單細胞真核生物？3.自然界中生物的DNA復(fù)制和人工合成中的多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)之所以需要引物，是因為在DNA合成時DNA聚合酶只能來合成子鏈(延伸方向是5′→3′)。典題說法考向1基因表達載體的構(gòu)建例1(2023·湖北卷)用氨芐青霉素抗性基因(AmpR)、四環(huán)素抗性基因(TetR)作為標(biāo)記基因構(gòu)建的質(zhì)粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質(zhì)粒，構(gòu)建基因表達載體(重組質(zhì)粒)，并轉(zhuǎn)化到受體菌中。下列敘述錯誤的是()A．若用HindⅢ酶切，目的基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四環(huán)素)培養(yǎng)基中的菌落，不一定含有目的基因C．若用SphⅠ酶切，可通過DNA凝膠電泳技術(shù)鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功與否D．若用SphⅠ酶切，攜帶目的基因的受體菌在含Amp(氨芐青霉素)和Tet的培養(yǎng)基中能形成菌落變式我國科研人員將寒帶地區(qū)海魚中的抗凍基因轉(zhuǎn)入千禧果(番茄品種)細胞中，成功培育出抗凍千禧果。下圖為培育過程使用的Ti質(zhì)粒示意圖，Vir區(qū)的基因活化能促進T－DNA的加工和轉(zhuǎn)移。下列敘述錯誤的是()A．選擇圖示Ti質(zhì)粒構(gòu)建基因表達載體，應(yīng)選擇限制酶ⅢB．利用PCR從海魚基因組中擴增抗凍基因需要添加一對特異性引物C．用含卡那霉素的選擇培養(yǎng)基篩選成功導(dǎo)入抗凍基因的受體細胞D．可用抗原—抗體雜交技術(shù)檢測抗凍基因在轉(zhuǎn)基因千禧果中的表達量考向2基因工程的操作過程例2(2024·淮安調(diào)研)乙烯具有促進果實成熟的作用，ACC氧化酶和ACC合成酶是番茄細胞合成乙烯的兩個關(guān)鍵酶。利用反義DNA技術(shù)(原理見圖1)，可以抑制這兩個基因的表達，從而使番茄具有耐儲存、宜運輸?shù)膬?yōu)點，圖2為融合ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因的反義表達載體的結(jié)構(gòu)示意圖。(1)從番茄體內(nèi)提取RNA作為模板，通過合成ACC氧化酶和ACC合成酶基因，合成的基因中(填“含”或“不含”)啟動子區(qū)域。(2)該技術(shù)首先需要合成ACC氧化酶和ACC合成酶的融合基因，通過PCR合成出的ACC氧化酶基因兩端分別含限制酶BamHⅠ和XbaⅠ的酶切位點，ACC合成酶基因兩端含SacⅠ和XbaⅠ的酶切位點，用限制酶對上述兩個基因進行酶切，再用DNA連接酶處理形成融合基因，相應(yīng)的表達載體應(yīng)用限制酶進行切割，確保融合基因能夠插入載體中。(3)圖2中的啟動子2A11為特異性啟動子，為了達到目的，啟動子2A11應(yīng)在番茄的果實(器官)中特異性啟動基因轉(zhuǎn)錄。將融合基因(填“正向”或“反向”)插入啟動子下游即可構(gòu)成反義融合基因。將圖中表達載體與農(nóng)桿菌菌液混合后，接種在含有的培養(yǎng)基中，可篩選出含有反義融合基因的農(nóng)桿菌，再利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法獲得轉(zhuǎn)基因番茄。2A11啟動子和反義融合基因都應(yīng)該位于T－DNA片段內(nèi)，原因是。(4)在檢測番茄細胞中是否存在反義融合基因時，(填“能”或“不能”)用放射性標(biāo)記的ACC氧化酶基因片段做探針進行檢測，理由是。(5)研究人員嘗試從個體水平鑒定轉(zhuǎn)基因是否成功，請設(shè)計實驗方案并預(yù)測實驗結(jié)果：。配套精練第57講基因工程的基本工具與操作程序一、單項選擇題1.下列有關(guān)重組DNA技術(shù)的基本工具的敘述，正確的是()A．限制酶能夠識別RNA分子的特定核苷酸序列B．?dāng)y帶外源DNA片段的質(zhì)?？稍谑荏w細胞中進行復(fù)制C．DNA連接酶不能連接雙鏈DNA片段的平末端D．DNA連接酶能連接DNA分子雙鏈堿基對之間的氫鍵2.(2025·揚州期初)目前研究混雜DNA群體中的特異DNA序列，一般基于兩種不同的方法，即DNA克隆和DNA分子雜交，如圖所示。下列有關(guān)敘述錯誤的是()A．方法①需要限制酶和DNA連接酶B．方法②需要解旋酶和DNA聚合酶C．方法③需要對探針進行特殊標(biāo)記D．方法①②③都遵循堿基互補配對原則3.(2024·湖南卷)某同學(xué)將質(zhì)粒DNA進行限制酶酶切時，發(fā)現(xiàn)DNA完全沒有被酶切，分析可能的原因并提出解決方法。下列敘述錯誤的是()A．限制酶失活，更換新的限制酶B．酶切條件不合適，調(diào)整反應(yīng)條件如溫度和酶的用量等C．質(zhì)粒DNA突變導(dǎo)致酶識別位點缺失，更換正常質(zhì)粒DNAD．酶切位點被甲基化修飾，換用對DNA甲基化不敏感的限制酶4.(2023·新課標(biāo)卷)某同學(xué)擬用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA連接酶為工具，將目的基因(兩端含相應(yīng)限制酶的識別序列和切割位點)和質(zhì)粒進行切割、連接，以構(gòu)建重組表達載體。限制酶的切割位點如圖所示。下列重組表達載體構(gòu)建方案合理且效率最高的是()A．質(zhì)粒和目的基因都用酶3切割，用E.coliDNA連接酶連接B．質(zhì)粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA連接酶連接C．質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA連接酶連接D．質(zhì)粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA連接酶連接5.如表為四種限制酶所識別的核苷酸序列及相應(yīng)的切割位置(箭頭所指)，下列敘述正確的是()限制酶種類序列及切點①EcoRⅠ②BamHⅠ③BglⅡ④NotⅠA.①②③④可催化磷酸二酯鍵和氫鍵斷裂，形成黏性末端B．①切出的DNA片段，只有用E.coliDNA連接酶才能連接起來C．②③切出的末端連接后形成的片段，不能再被②或③識別切割D．構(gòu)建基因表達載體時，用②③進行雙酶切，可防止目的基因與載體的反向連接6.重組質(zhì)?？梢詳y帶目的基因進入受體細胞，則下列不一定可以說明目的基因成功導(dǎo)入受體細胞的是()A．大腸桿菌中檢測到人胰島素基因的mRNAB．水稻細胞中檢測到氨芐青霉素抗性基因C．棉花細胞中檢測到抗棉鈴蟲基因D．鯉魚細胞中檢測到人的生長激素7.(2025·如皋期初)科研人員將四種酶的基因(EcCAT、OsGLO1、EcGCL、TSR)與葉綠體轉(zhuǎn)運肽(引導(dǎo)合成的蛋白質(zhì)進入葉綠體)基因連接，構(gòu)建多基因表達載體(載體中部分序列如圖)，在水稻葉綠體內(nèi)構(gòu)建了一條新代謝途徑，提高了水稻的產(chǎn)量。下列說法正確的是()A．限制酶需要識別特定的序列，具有專一性，DNA連接酶不具有專一性B．含卡那霉素的培養(yǎng)基上不能存活的植物受體細胞未成功導(dǎo)入四種目的基因C．OsGLO1、EcCAT基因轉(zhuǎn)錄時以DNA的不同單鏈為模板D．利用PCR等技術(shù)檢測OsGLO1基因是否轉(zhuǎn)錄時，需要的酶是TaqDNA聚合酶8.如圖表示PCR過程中某個階段反應(yīng)體系的情況，①②③④表示相關(guān)物質(zhì)，L、R表示方向。下列敘述正確的是()A．②鏈從L到R的方向為3′→5′，①②鏈均可作為子鏈合成的模板B．PCR過程需要通過解旋酶斷開氫鍵，且為邊解旋邊復(fù)制C．以1個DNA為模板經(jīng)3次循環(huán)需消耗8個引物③D．物質(zhì)③的5′端添加了某序列，至少需經(jīng)2次循環(huán)才可獲得含該序列的雙鏈產(chǎn)物9.在基因工程中，常采用花粉管通道法和土壤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因?qū)胫参锛毎?。如圖為花粉管通道法的一般原理示意圖。相關(guān)敘述正確的是()A．外源DNA進入胚囊最終獲得的種子均含有目的基因B．植物生長各個時期均可通過花粉管通道導(dǎo)入外源DNAC．花粉管通道法最大的優(yōu)點是無需植物組織培養(yǎng)，技術(shù)簡單D．含外源DNA的種子發(fā)育成植株后均具有相應(yīng)性狀二、多項選擇題10.(2024·海安中學(xué))反向PCR是一種通過已知序列設(shè)計反向引物對未知序列(圖中L、R)進行擴增的技術(shù)，其過程如下圖所示。相關(guān)敘述正確的有()A．過程①可用同一種限制酶對未知序列兩端進行切割B．過程③和①獲得的DNA片段長度相同，序列不同C．過程②需使用DNA連接酶，形成氫鍵和磷酸二酯鍵D．該技術(shù)可檢測T－DNA整合到植物細胞染色體DNA上的位置11.(2024·湖南卷)最早的雙脫氧測序法是在PCR反應(yīng)體系中，分別再加入一種少量的雙脫氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP)，子鏈延伸時，雙脫氧核苷三磷酸也遵循堿基互補配對原則，以加入ddATP的體系為例：若配對的為ddATP，延伸終止；若配對的為脫氧腺苷三磷酸(dATP)，繼續(xù)延伸；PCR產(chǎn)物變性后電泳檢測。通過該方法測序某疾病患者及對照個體的一段序列，結(jié)果如圖所示。下列敘述正確的是()A．上述PCR反應(yīng)體系中只加入一種引物B．電泳時產(chǎn)物的片段越小，遷移速率越慢C．5′－CTACCCGTGAT－3′為對照個體的一段序列D．患者該段序列中某位點的堿基C突變?yōu)镚三、非選擇題12.(2024·重慶卷節(jié)選)大豆是重要的糧油作物，提高大豆產(chǎn)量是我國農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的重要任務(wù)。我國研究人員發(fā)現(xiàn)，基因S在大豆品種DN(種子較大)中的表達量高于品種TL(種子較小)，然后克隆了該基因(兩品種中基因S序列無差異)及其上游的啟動子序列，并開展相關(guān)研究。(1)基因S啟動子的基本組成單位是。(2)通過基因工程方法，將DN克隆的“啟動子D＋基因S”序列導(dǎo)入無基因S的優(yōu)質(zhì)大豆品種YZ中。根據(jù)題圖所示信息(不考慮未標(biāo)明序列)判斷，構(gòu)建重組表達載體時，為保證目標(biāo)序列的完整性，不宜使用的限制酶是。此外，不宜同時選用酶SpeⅠ和XbaⅠ，原因是。(3)為驗證“啟動子D＋基因S”是否連接在表達載體上，可用限制酶對重組表達載體酶切后進行電泳。電泳時，對照樣品除指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物外，還應(yīng)有。(4)用檢測后的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化品種YZ所得再生植株YZ－1的種子變大。同時將從TL克隆的“啟動子T＋基因S”序列成功導(dǎo)入YZ，所得再生植株YZ－2的種子也變大，但小于YZ－1。綜合分析，大豆品種DN較TL種子大的原因是。13.(2025·南通如東期初)鋁毒是酸性土壤中限制作物生長的主要因素之一。某科研團隊研究發(fā)現(xiàn)，鋁脅迫可誘導(dǎo)鋁耐受型大豆根尖SGF14a基因(簡稱S基因)的表達。為了驗證SGF14a基因在植物應(yīng)答鋁脅迫中的作用，研究人員構(gòu)建含SGF14a基因的表達載體，將其轉(zhuǎn)化到煙草細胞，進而獲得轉(zhuǎn)基因煙草，并對轉(zhuǎn)基因煙草進行鋁耐受性的研究，具體操作流程如圖1所示。請回答下列問題：圖1(1)提取鋁耐受型大豆根總RNA，在的催化下合成cDNA，最終獲得S基因。根據(jù)S基因的核苷酸序列設(shè)計相應(yīng)的引物進行PCR擴增，兩條引物設(shè)計時常加入不同的限制性內(nèi)切核酸酶切割位點，主要目的是。已知圖中大豆S基因的A位點和B位點分別是起始密碼子和終止密碼子對應(yīng)的基因位置，選用的引物組合應(yīng)為。(2)PCR擴增的產(chǎn)物進行電泳時，發(fā)現(xiàn)除了目標(biāo)序列外還有很多非特異性條帶，出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因可能是(2分)。A．引物特異性不高B．熱變性時間過長C．延伸時間過長D．復(fù)性溫度過低(3)將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化后的煙草細胞誘導(dǎo)形成的愈傷組織先放在含(填抗生素)的生芽培養(yǎng)基中，待生芽后，將芽移到生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以獲得煙草植株，生芽培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基中相關(guān)植物激素含量的區(qū)別是