Flotillin-2基因：解鎖鼻咽癌轉(zhuǎn)移機制與治療新靶點的關(guān)鍵密碼一、引言1.1研究背景與意義鼻咽癌（NasopharyngealCarcinoma，NPC）是一種起源于鼻咽上皮的頭頸部惡性腫瘤，具有明顯的地域分布特征，在中國南方、東南亞和北非某些地區(qū)發(fā)病率較高。據(jù)統(tǒng)計，全球每年約有超過13萬新增鼻咽癌病例，而中國的病例數(shù)占比超過40%。鼻咽癌嚴(yán)重威脅著人類的健康，其危害不僅僅體現(xiàn)在腫瘤本身對局部組織的破壞，更在于其較高的轉(zhuǎn)移率，這對患者的預(yù)后產(chǎn)生了極為不利的影響。轉(zhuǎn)移是鼻咽癌患者死亡的主要原因之一。臨床上，60%-85%的鼻咽癌患者在診斷時已出現(xiàn)轉(zhuǎn)移。鼻咽癌常見的轉(zhuǎn)移途徑包括淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、局部侵犯和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其中遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移常見部位為骨、肺、肝。一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，患者的5年總體生存率會顯著降低，例如鼻咽癌患者骨轉(zhuǎn)移的五年生存率約為11%-15.9%。轉(zhuǎn)移的發(fā)生使得治療難度大幅增加，患者往往需要承受更強烈的治療副作用，生活質(zhì)量嚴(yán)重下降，同時也給患者家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。因此，深入研究鼻咽癌轉(zhuǎn)移的分子機制，尋找有效的治療靶點，對于改善鼻咽癌患者的預(yù)后具有至關(guān)重要的意義。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，眾多學(xué)者致力于探索鼻咽癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子標(biāo)志物，以期為鼻咽癌的診斷、治療和預(yù)后評估提供新的思路和方法。Flotillin-2（Flot2）作為細(xì)胞膜上平面脂筏的重要組成蛋白，逐漸進(jìn)入研究者的視野。平面脂筏是富含膽固醇和鞘磷脂的細(xì)胞膜表面微結(jié)構(gòu)域，與多種細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)相關(guān)。已有研究證實Flot2與中性粒細(xì)胞的細(xì)胞骨架形成及細(xì)胞的遷移能力有關(guān)。過表達(dá)Flot2能夠?qū)⒌椭掳┬耘c低轉(zhuǎn)移性的黑色素瘤細(xì)胞系SB2轉(zhuǎn)變成高致癌性與高轉(zhuǎn)移性的癌細(xì)胞；在乳腺癌細(xì)胞中，沉默F(xiàn)lot2可導(dǎo)致平面脂筏的完全缺失，降低乳腺癌肺轉(zhuǎn)移率。近來研究還提示，F(xiàn)lot2在神經(jīng)細(xì)胞中參與到Src激酶的激活過程中，而Src激酶已被證明是TGF-β促進(jìn)癌癥轉(zhuǎn)移的重要下游信號。然而，關(guān)于Flot2在鼻咽癌轉(zhuǎn)移中的具體作用及機制，目前尚不明確。本研究旨在探討鼻咽癌候選轉(zhuǎn)移相關(guān)基因Flotillin-2的表達(dá)及其與鼻咽癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系，并初步探索其作用機制。通過對Flotillin-2的研究，有望揭示鼻咽癌轉(zhuǎn)移的新機制，為鼻咽癌的治療提供新的靶點和策略，從而提高鼻咽癌患者的生存率和生活質(zhì)量，具有重要的理論和臨床意義。1.2Flotillin-2基因概述Flotillin-2基因位于人類染色體17q11.2，是一種蛋白編碼基因。其編碼的Flotillin-2蛋白，也被稱為筏蛋白2，是細(xì)胞膜上平面脂筏的關(guān)鍵組成部分。平面脂筏作為富含膽固醇和鞘磷脂的細(xì)胞膜表面微結(jié)構(gòu)域，在細(xì)胞的生理過程中扮演著不可或缺的角色，特別是在細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)方面發(fā)揮著重要作用。Flotillin-2主要分布于細(xì)胞膜的胞質(zhì)面，以及某些內(nèi)吞囊泡的表面。從結(jié)構(gòu)上看，它具有獨特的氨基酸序列和空間構(gòu)象，這賦予了其特殊的生物學(xué)功能。在功能方面，大量研究表明Flotillin-2參與了多種細(xì)胞生理過程。例如，它與中性粒細(xì)胞的細(xì)胞骨架形成密切相關(guān)，通過影響細(xì)胞骨架的組裝和解聚，進(jìn)而對細(xì)胞的遷移能力產(chǎn)生作用。在腫瘤細(xì)胞中，F(xiàn)lotillin-2的功能表現(xiàn)尤為突出。過表達(dá)Flotillin-2能夠使低致癌性與低轉(zhuǎn)移性的黑色素瘤細(xì)胞系SB2轉(zhuǎn)變?yōu)楦咧掳┬耘c高轉(zhuǎn)移性的癌細(xì)胞，這一過程涉及到細(xì)胞內(nèi)一系列信號通路的激活和調(diào)控。在乳腺癌細(xì)胞中，沉默F(xiàn)lotillin-2可導(dǎo)致平面脂筏的完全缺失，進(jìn)而降低乳腺癌肺轉(zhuǎn)移率，這充分說明了Flotillin-2在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵作用。此外，在神經(jīng)細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)lotillin-2參與到Src激酶的激活過程中。Src激酶作為一種非受體類酪氨酸激酶，已被證實是TGF-β促進(jìn)癌癥轉(zhuǎn)移的重要下游信號。這一發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步揭示了Flotillin-2在細(xì)胞信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中的重要地位，以及其與腫瘤轉(zhuǎn)移之間的潛在聯(lián)系。綜合來看，F(xiàn)lotillin-2在細(xì)胞的結(jié)構(gòu)維持、信號傳導(dǎo)以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移等多個方面都發(fā)揮著重要作用，對其深入研究有助于我們更好地理解細(xì)胞生理病理過程，為腫瘤等疾病的治療提供新的靶點和策略。1.3鼻咽癌轉(zhuǎn)移機制研究現(xiàn)狀鼻咽癌轉(zhuǎn)移是一個多步驟、多因素參與的復(fù)雜過程，涉及腫瘤細(xì)胞與宿主微環(huán)境之間的相互作用，其轉(zhuǎn)移機制的研究一直是腫瘤領(lǐng)域的熱點和難點。鼻咽癌常見的轉(zhuǎn)移途徑主要包括淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、局部侵犯和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。其中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移在鼻咽癌中較為常見，以頸淋巴結(jié)腫大為首發(fā)癥狀者約占60%，常先出現(xiàn)單側(cè)頸深部上群淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，之后可逐漸發(fā)展為雙側(cè)。局部侵犯方面，瘤體可直接侵犯咽旁間隙；發(fā)生于咽隱窩的腫瘤易破壞顱底骨質(zhì)，或通過破裂孔及頸內(nèi)動脈侵犯巖骨尖，進(jìn)而導(dǎo)致腦神經(jīng)損害。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移常見部位為骨、肺、肝，一旦發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，患者的預(yù)后往往較差。在分子機制層面，目前研究涉及多個方面。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）機制理論備受關(guān)注，EMT是指極化的上皮細(xì)胞通過基底面與基底膜相互作用而發(fā)生多種生物化學(xué)變化的過程。在此過程中，上皮細(xì)胞失去細(xì)胞與細(xì)胞之間的連接和頂端-基底細(xì)胞極性，細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榧忓N狀，細(xì)胞遷移、侵襲能力增加，從而促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。多種信號通路參與了鼻咽癌EMT進(jìn)程，例如Notch信號通路，它是一種高度進(jìn)化保守的通路，涉及細(xì)胞多項功能，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖、凋亡等。在鼻咽癌中，有研究發(fā)現(xiàn)Notch2在轉(zhuǎn)移性和低分化鼻咽癌細(xì)胞中低表達(dá)，NOTCH2可與TRAF6結(jié)合，通過TRAF6/AKT信號通路調(diào)控EMT進(jìn)程。Wnt/β-catenin信號通路也在鼻咽癌EMT中發(fā)揮作用，該通路的異常激活可導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞核內(nèi)積聚，激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。腫瘤微環(huán)境理論認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞所處的微環(huán)境對其轉(zhuǎn)移具有重要影響。腫瘤微環(huán)境包含腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)以及各種細(xì)胞因子和趨化因子等。其中，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）在鼻咽癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。TAM可分泌多種細(xì)胞因子，如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等，這些因子能夠促進(jìn)腫瘤血管生成、調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力。此外，腫瘤微環(huán)境中的缺氧狀態(tài)也可誘導(dǎo)一系列基因的表達(dá)變化，促進(jìn)鼻咽癌的轉(zhuǎn)移。例如，缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）在缺氧條件下穩(wěn)定表達(dá)，它可調(diào)控VEGF等基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤血管生成，為腫瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移提供條件。腫瘤干細(xì)胞理論學(xué)說指出，腫瘤干細(xì)胞具有自我更新、多向分化和高致瘤性的特點，被認(rèn)為是腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的根源。在鼻咽癌中，也存在具有腫瘤干細(xì)胞特性的細(xì)胞亞群。這些細(xì)胞高表達(dá)一些干細(xì)胞標(biāo)志物，如CD44、Oct4等。CD44作為一種細(xì)胞表面糖蛋白，參與細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互作用，其高表達(dá)與鼻咽癌的轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后密切相關(guān)。腫瘤干細(xì)胞能夠通過上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化等機制獲得更強的遷移和侵襲能力，從而促進(jìn)鼻咽癌的轉(zhuǎn)移。盡管目前對鼻咽癌轉(zhuǎn)移機制的研究取得了一定進(jìn)展，但仍存在許多難點和未解之謎。例如，不同轉(zhuǎn)移途徑之間的相互關(guān)系以及如何精準(zhǔn)調(diào)控這些途徑以抑制轉(zhuǎn)移尚不清楚；多種分子機制之間的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控關(guān)系復(fù)雜，難以全面解析；在臨床應(yīng)用方面，如何將基礎(chǔ)研究成果轉(zhuǎn)化為有效的治療手段，提高鼻咽癌患者的生存率和生活質(zhì)量，仍然是亟待解決的問題。1.4研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入探究鼻咽癌候選轉(zhuǎn)移相關(guān)基因Flotillin-2的表達(dá)情況，明確其與鼻咽癌轉(zhuǎn)移之間的內(nèi)在聯(lián)系，并初步解析其作用機制，具體研究目的如下：檢測Flotillin-2在鼻咽癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)水平：運用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）、蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）和免疫組織化學(xué)（IHC）等技術(shù)，精準(zhǔn)測定Flotillin-2在鼻咽癌組織及正常鼻咽組織、不同轉(zhuǎn)移潛能的鼻咽癌細(xì)胞系中的mRNA和蛋白表達(dá)水平，分析其表達(dá)差異，為后續(xù)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。明確Flotillin-2表達(dá)與鼻咽癌轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后的相關(guān)性：收集大量鼻咽癌患者的臨床病理資料，包括腫瘤的轉(zhuǎn)移情況、分期等，結(jié)合Flotillin-2的表達(dá)數(shù)據(jù)，進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，明確Flotillin-2表達(dá)與鼻咽癌轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后之間的關(guān)聯(lián)，評估其作為鼻咽癌轉(zhuǎn)移預(yù)測標(biāo)志物和預(yù)后指標(biāo)的潛在價值。探討Flotillin-2對鼻咽癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響：構(gòu)建Flotillin-2過表達(dá)和基因沉默的鼻咽癌細(xì)胞模型，利用細(xì)胞劃痕實驗、Transwell小室實驗等方法，檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力的變化，明確Flotillin-2對鼻咽癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響，從細(xì)胞水平揭示其在鼻咽癌轉(zhuǎn)移中的作用。初步探索Flotillin-2影響鼻咽癌轉(zhuǎn)移的作用機制：通過生物信息學(xué)分析、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用研究等手段，篩選與Flotillin-2相互作用的蛋白和相關(guān)信號通路，利用Westernblot、免疫共沉淀（Co-IP）等實驗技術(shù)進(jìn)行驗證，初步解析Flotillin-2影響鼻咽癌轉(zhuǎn)移的分子機制，為鼻咽癌的治療提供潛在的分子靶點。本研究將圍繞以上研究目的展開，具體研究內(nèi)容包括：臨床標(biāo)本的收集與檢測：收集鼻咽癌患者的腫瘤組織及配對的癌旁正常組織標(biāo)本，詳細(xì)記錄患者的臨床病理信息。運用qRT-PCR、Westernblot和IHC技術(shù)，檢測Flotillin-2在這些標(biāo)本中的表達(dá)水平，分析其表達(dá)與患者臨床病理特征（如腫瘤分期、轉(zhuǎn)移情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)等）之間的相關(guān)性。細(xì)胞實驗：選擇不同轉(zhuǎn)移潛能的鼻咽癌細(xì)胞系，如低轉(zhuǎn)移潛能的CNE-1細(xì)胞系和高轉(zhuǎn)移潛能的CNE-2細(xì)胞系。通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，構(gòu)建Flotillin-2過表達(dá)和基因沉默的細(xì)胞模型。利用細(xì)胞劃痕實驗和Transwell小室實驗，檢測這些細(xì)胞模型的遷移和侵襲能力，觀察Flotillin-2表達(dá)改變對鼻咽癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響。同時，運用CCK-8實驗、流式細(xì)胞術(shù)等方法，檢測Flotillin-2對鼻咽癌細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響，全面評估其對鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)行為的作用。機制研究：采用生物信息學(xué)分析方法，預(yù)測與Flotillin-2相互作用的蛋白和可能參與的信號通路。利用Co-IP技術(shù)，驗證Flotillin-2與預(yù)測蛋白之間的相互作用關(guān)系。通過Westernblot檢測相關(guān)信號通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)和磷酸化水平，明確Flotillin-2影響鼻咽癌轉(zhuǎn)移的作用機制。此外，還將進(jìn)行裸鼠成瘤和轉(zhuǎn)移實驗，在體內(nèi)水平驗證Flotillin-2對鼻咽癌轉(zhuǎn)移的影響及其作用機制。預(yù)期通過本研究，能夠明確Flotillin-2在鼻咽癌轉(zhuǎn)移中的作用及機制，為鼻咽癌的診斷、治療和預(yù)后評估提供新的靶點和策略，有望改善鼻咽癌患者的生存率和生活質(zhì)量。二、材料與方法2.1實驗材料2.1.1細(xì)胞系和組織樣本實驗選用人鼻咽癌細(xì)胞系，包括低轉(zhuǎn)移潛能的CNE-1細(xì)胞系和高轉(zhuǎn)移潛能的CNE-2細(xì)胞系，均購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。這些細(xì)胞系在含10%胎牛血清（FBS，Gibco公司）、1%雙抗（青霉素-鏈霉素混合液，Solarbio公司）的RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco公司）中培養(yǎng)，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中，定期進(jìn)行細(xì)胞傳代和凍存，凍存時采用含10%二甲基亞砜（DMSO，Sigma公司）的胎牛血清作為凍存液，將細(xì)胞置于程序降溫盒中，-80℃冰箱過夜后轉(zhuǎn)入液氮保存。鼻咽癌患者組織樣本收集自[醫(yī)院名稱]耳鼻咽喉頭頸外科，共收集[X]例鼻咽癌患者的腫瘤組織及配對的癌旁正常組織標(biāo)本。所有患者術(shù)前均未接受放療、化療等抗腫瘤治療，標(biāo)本經(jīng)病理確診，并詳細(xì)記錄患者的年齡、性別、臨床分期、病理分型、轉(zhuǎn)移情況等臨床病理信息。組織標(biāo)本離體后，一部分立即置于液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，用于后續(xù)RNA和蛋白質(zhì)的提取；另一部分用10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，用于免疫組織化學(xué)檢測。2.1.2主要實驗試劑和儀器主要實驗試劑包括：兔抗人Flotillin-2多克隆抗體（Abcam公司），鼠抗人GAPDH單克隆抗體（Proteintech公司），HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG二抗（JacksonImmunoResearch公司），免疫組化試劑盒（ZSGB-BIO公司），蛋白質(zhì)提取試劑盒（ThermoFisherScientific公司），BCA蛋白定量試劑盒（Beyotime公司），SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（Bio-Rad公司），Westernblot轉(zhuǎn)膜儀配套試劑（Millipore公司），實時熒光定量PCR試劑盒（TaKaRa公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司），Transwell小室（Corning公司），Matrigel基質(zhì)膠（Corning公司），RNA干擾試劑（針對Flotillin-2的siRNA，RiboBio公司），Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen公司），TRIzol試劑（Invitrogen公司），PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。主要實驗儀器有：熒光顯微鏡（Olympus公司），倒置顯微鏡（Nikon公司），酶標(biāo)儀（Bio-Tek公司），實時熒光定量PCR儀（AppliedBiosystems公司），蛋白電泳儀（Bio-Rad公司），凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司），CO?培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），超凈工作臺（蘇凈集團安泰公司），高速冷凍離心機（Eppendorf公司），低溫冰箱（ThermoFisherScientific公司），液氮罐（MVE公司），恒溫?fù)u床（NewBrunswick公司），移液器（Eppendorf公司）。2.2實驗方法2.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與處理將人鼻咽癌細(xì)胞系CNE-1和CNE-2從液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴鍋中，不斷搖晃凍存管，使其在1-2分鐘內(nèi)快速解凍。用75%酒精擦拭凍存管外壁后，放入超凈工作臺內(nèi)。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含有9ml完全培養(yǎng)基（RPMI-1640培養(yǎng)基添加10%胎牛血清、1%雙抗）的15ml離心管中，800-1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。加入5ml完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，用移液管輕輕吹打8-10次，使細(xì)胞均勻分散，避免產(chǎn)生氣泡。將細(xì)胞懸液接種到T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞傳代時，當(dāng)細(xì)胞生長密度達(dá)到80%-90%時，棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。加入1-2ml0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（對于難消化的細(xì)胞可適當(dāng)延長消化時間），在顯微鏡下密切觀察細(xì)胞消化情況，當(dāng)細(xì)胞大部分變圓并開始脫落時，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞完全脫落。立即加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化，輕輕吹打均勻后吸出細(xì)胞懸液，1000rpm離心3-5分鐘，棄去上清液。補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻，將細(xì)胞懸液按1：2-1：5的比例分到新的T25培養(yǎng)瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。對于細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗，當(dāng)細(xì)胞生長至60%-70%融合度時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。針對Flotillin-2基因設(shè)計特異性的siRNA序列，同時設(shè)置陰性對照siRNA。將Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑和siRNA分別用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋，室溫孵育5分鐘后，將兩者混合均勻，室溫孵育20分鐘，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。棄去細(xì)胞原有的培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞1-2次，加入不含血清和抗生素的Opti-MEM培養(yǎng)基。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入培養(yǎng)瓶中，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6-8小時后，更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時，用于后續(xù)實驗。2.2.2基因表達(dá)檢測技術(shù)采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測Flotillin-2基因及相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平。首先，使用TRIzol試劑提取鼻咽癌組織、癌旁正常組織以及鼻咽癌細(xì)胞系的總RNA。具體操作如下：將組織或細(xì)胞樣品加入到含有TRIzol試劑的離心管中，充分勻漿，室溫靜置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全解離。加入0.2ml***，劇烈振蕩15秒，室溫靜置2-3分鐘后，4℃、12000rpm離心15分鐘。取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入0.5ml異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10分鐘，4℃、12000rpm離心10分鐘，此時RNA沉淀于管底。棄去上清液，用75%乙醇洗滌RNA沉淀2次，4℃、7500rpm離心5分鐘，盡量棄盡乙醇。將RNA沉淀室溫晾干后，加入適量的DEPC水溶解RNA。使用分光光度計測定RNA的濃度和純度，確保A260/A280比值在1.8-2.0之間。然后，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的操作步驟，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板，使用特異性引物進(jìn)行qRT-PCR擴增。引物序列根據(jù)GenBank中Flotillin-2基因及內(nèi)參基因GAPDH的序列進(jìn)行設(shè)計，并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反應(yīng)體系包含2×SYBRGreenMasterMix、上下游引物、cDNA模板和ddH?O。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后進(jìn)行40個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性5秒，60℃退火30秒。采用2^-ΔΔCt法計算Flotillin-2基因mRNA的相對表達(dá)量。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）用于檢測Flotillin-2蛋白及相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。收集細(xì)胞或組織樣品，加入適量的細(xì)胞裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30分鐘，期間不斷振蕩。4℃、12000rpm離心15分鐘，取上清液作為總蛋白樣品。使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，以牛血清白蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取等量的蛋白樣品與5×SDS上樣緩沖液混合，100℃煮沸5分鐘使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結(jié)束后，使用半干轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將PVDF膜放入5%脫脂奶粉溶液中，室溫封閉1小時，以減少非特異性結(jié)合。封閉后，將PVDF膜放入含有兔抗人Flotillin-2多克隆抗體（稀釋度1:1000）和鼠抗人GAPDH單克隆抗體（稀釋度1:5000）的雜交液中，4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。然后將PVDF膜放入含有HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG二抗（稀釋度1:5000）的雜交液中，室溫孵育1小時。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，使用ECL發(fā)光液顯色，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光拍照，采用ImageJ軟件分析蛋白條帶的灰度值，計算Flotillin-2蛋白的相對表達(dá)量。免疫組織化學(xué)（IHC）用于檢測Flotillin-2蛋白在鼻咽癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)和定位。將石蠟包埋的組織切片進(jìn)行脫蠟至水，具體步驟為：依次將切片放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各10分鐘，然后放入無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ中各5分鐘，再放入95%、85%、75%乙醇中各3分鐘，最后用蒸餾水沖洗。采用微波修復(fù)抗原的方法，將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）的容器中，微波爐加熱至沸騰后，保持低火加熱10-15分鐘，使抗原充分暴露。待切片冷卻至室溫后，用3%過氧化氫溶液孵育10-15分鐘，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次5分鐘。將切片放入正常山羊血清中，室溫封閉30分鐘。棄去封閉液，加入兔抗人Flotillin-2多克隆抗體（稀釋度1:200），4℃孵育過夜。次日，用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次5分鐘。加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗，室溫孵育30分鐘。用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次5分鐘。使用DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色，顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)陽性部位呈現(xiàn)棕黃色時，用蒸餾水沖洗終止顯色。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，自來水沖洗返藍(lán)。依次將切片放入75%、85%、95%乙醇中各3分鐘，無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ中各5分鐘，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各10分鐘進(jìn)行脫水、透明。最后用中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察Flotillin-2蛋白的表達(dá)和定位情況。根據(jù)陽性細(xì)胞占全部細(xì)胞數(shù)的百分比進(jìn)行半定量分析：陽性細(xì)胞數(shù)＜10%為陰性（-），10%-50%為弱陽性（+），51%-80%為中度陽性（++），＞80%為強陽性（+++）。2.2.3細(xì)胞功能實驗細(xì)胞劃痕實驗用于檢測鼻咽癌細(xì)胞的遷移能力。將對數(shù)生長期的鼻咽癌細(xì)胞以5×10?個/孔的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁生長至融合度達(dá)到90%-100%時，用10μl移液器槍頭在細(xì)胞單層上垂直劃痕，劃痕盡量保持均勻。用PBS輕輕沖洗細(xì)胞3次，以去除劃下的細(xì)胞。加入無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。分別在劃痕后0小時、24小時、48小時在倒置顯微鏡下拍照記錄，使用ImageJ軟件測量劃痕寬度，計算細(xì)胞遷移率，遷移率=（0小時劃痕寬度-各時間點劃痕寬度）/0小時劃痕寬度×100%。Transwell實驗用于檢測鼻咽癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。遷移實驗時，將Transwell小室（8μm孔徑）放入24孔板中，上室加入200μl無血清培養(yǎng)基重懸的細(xì)胞（細(xì)胞密度為5×10?個/孔），下室加入500μl含10%FBS的培養(yǎng)基作為趨化因子。培養(yǎng)24小時后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未穿過膜的細(xì)胞。將小室放入甲醇中固定15分鐘，然后用結(jié)晶紫染色15分鐘。用蒸餾水沖洗小室，晾干后在顯微鏡下隨機選取5個視野計數(shù)穿過膜的細(xì)胞數(shù)，以評估細(xì)胞的遷移能力。侵襲實驗操作與遷移實驗類似，但在上室預(yù)先鋪Matrigel基質(zhì)膠，使其在37℃下凝固形成一層基質(zhì)膜，模擬細(xì)胞外基質(zhì)，細(xì)胞接種前需用無血清培養(yǎng)基將Matrigel基質(zhì)膠水化，其余步驟同遷移實驗，通過計數(shù)穿過Matrigel基質(zhì)膠和膜的細(xì)胞數(shù)來評估細(xì)胞的侵襲能力。CCK-8實驗用于檢測Flotillin-2對鼻咽癌細(xì)胞增殖能力的影響。將鼻咽癌細(xì)胞以5×103個/孔的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置5個復(fù)孔。分別在接種后0小時、24小時、48小時、72小時、96小時向每孔加入10μlCCK-8試劑，繼續(xù)孵育1-4小時。使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的吸光度（OD值），以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，時間為橫坐標(biāo)繪制細(xì)胞增殖曲線。流式細(xì)胞術(shù)用于檢測細(xì)胞周期和凋亡情況。收集轉(zhuǎn)染后的鼻咽癌細(xì)胞，用PBS清洗2次，加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液消化細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。加入預(yù)冷的70%乙醇，輕輕吹打均勻，4℃固定過夜。次日，1000rpm離心5分鐘，棄去固定液，用PBS清洗細(xì)胞2次。加入含有碘化丙啶（PI）和RNaseA的染色液，室溫避光孵育30分鐘。使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布，分析G0/G1期、S期、G2/M期細(xì)胞的比例。檢測細(xì)胞凋亡時，收集細(xì)胞后，用PBS清洗2次，按照AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明書的步驟進(jìn)行操作，將細(xì)胞與AnnexinV-FITC和PI染色液混合，室溫避光孵育15分鐘，加入適量的結(jié)合緩沖液，用流式細(xì)胞儀檢測早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）和晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）的比例。2.2.4動物實驗建立人鼻咽癌裸鼠皮下移植瘤模型，選用4-6周齡的BALB/c裸鼠，購自[實驗動物供應(yīng)商名稱]。將處于對數(shù)生長期的鼻咽癌細(xì)胞（如CNE-2細(xì)胞）用0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液消化后，用無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×10?個/ml。在裸鼠右側(cè)腋下皮下注射0.2ml細(xì)胞懸液。接種后，每天觀察裸鼠的一般狀態(tài)，包括飲食、活動、精神狀態(tài)等。每隔3天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計算腫瘤體積。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到100-150mm3時，將裸鼠隨機分為實驗組和對照組，每組[X]只。實驗組裸鼠通過尾靜脈注射針對Flotillin-2的siRNA脂質(zhì)體復(fù)合物（siRNA劑量為[X]μg/只），對照組裸鼠注射等量的陰性對照siRNA脂質(zhì)體復(fù)合物。每周注射2次，共注射4周。在實驗過程中，密切觀察裸鼠的體重變化、腫瘤生長情況以及有無不良反應(yīng)發(fā)生。實驗結(jié)束后，處死裸鼠，完整取出腫瘤組織，稱重并拍照記錄。將腫瘤組織一部分用10%中性福爾馬林固定，用于制作石蠟切片，進(jìn)行HE染色和免疫組化檢測；另一部分置于液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，用于后續(xù)的RNA和蛋白質(zhì)提取。為了進(jìn)一步研究Flotillin-2對鼻咽癌轉(zhuǎn)移的影響，建立裸鼠肺轉(zhuǎn)移模型。將高轉(zhuǎn)移潛能的鼻咽癌細(xì)胞（如5-8F細(xì)胞）用無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10?個/ml。通過尾靜脈注射的方式將0.2ml細(xì)胞懸液注入裸鼠體內(nèi)。注射后，定期觀察裸鼠的生存狀態(tài)。在實驗設(shè)定的時間點（如注射后4周），處死裸鼠，取出肺組織，用生理鹽水沖洗干凈，吸干水分后稱重。將肺組織固定于10%中性福爾馬林溶液中，制作石蠟切片，進(jìn)行HE染色，在顯微鏡下觀察肺轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量和大小。同時，采用免疫組化方法檢測肺組織中Flotillin-2蛋白的表達(dá)情況。2.2.5數(shù)據(jù)分析方法使用GraphPadPrism8.0軟件和SPSS22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），若方差齊性，組間兩兩比較采用LSD法；若方差不齊，組間兩兩比較采用Dunnett'sT3法。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。生存分析采用Kaplan-Meier法，并使用Log-rank檢驗進(jìn)行組間比較。通過這些數(shù)據(jù)分析方法，全面、準(zhǔn)確地分析實驗數(shù)據(jù)，揭示Flotillin-2在鼻咽癌中的表達(dá)特征、與臨床病理參數(shù)的關(guān)系以及對鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，為研究Flotillin-2在鼻咽癌轉(zhuǎn)移中的作用及機制提供有力的統(tǒng)計學(xué)支持。三、Flotillin-2基因與鼻咽癌轉(zhuǎn)移的關(guān)聯(lián)研究3.1Flotillin-2在鼻咽癌組織中的表達(dá)情況3.1.1免疫組化檢測結(jié)果分析通過免疫組化技術(shù)，對收集的[X]例鼻咽癌患者的腫瘤組織及配對的癌旁正常組織標(biāo)本進(jìn)行Flotillin-2蛋白表達(dá)檢測。在顯微鏡下觀察，F(xiàn)lotillin-2蛋白陽性表達(dá)產(chǎn)物主要定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，呈現(xiàn)棕黃色顆粒。癌旁正常組織中，F(xiàn)lotillin-2蛋白呈低表達(dá)或陰性表達(dá)，陽性細(xì)胞數(shù)較少，染色強度較弱，多數(shù)視野中僅可見散在的弱陽性細(xì)胞。而在鼻咽癌組織中，F(xiàn)lotillin-2蛋白表達(dá)明顯增強，陽性細(xì)胞數(shù)增多，染色強度加深，部分區(qū)域可見成片的強陽性細(xì)胞。對免疫組化結(jié)果進(jìn)行半定量分析，根據(jù)陽性細(xì)胞占全部細(xì)胞數(shù)的百分比進(jìn)行評分：陽性細(xì)胞數(shù)＜10%為陰性（-），10%-50%為弱陽性（+），51%-80%為中度陽性（++），＞80%為強陽性（+++）。統(tǒng)計結(jié)果顯示，鼻咽癌組織中Flotillin-2蛋白陽性表達(dá)率為[X]%（[陽性例數(shù)]/[總例數(shù)]×100%），其中弱陽性表達(dá)[X]例，中度陽性表達(dá)[X]例，強陽性表達(dá)[X]例；癌旁正常組織中Flotillin-2蛋白陽性表達(dá)率為[X]%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，采用卡方檢驗）。這表明Flotillin-2蛋白在鼻咽癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁正常組織，提示其可能在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。3.1.2表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性進(jìn)一步探討Flotillin-2蛋白表達(dá)水平與鼻咽癌患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。將患者的臨床病理參數(shù)，包括TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等，與Flotillin-2蛋白表達(dá)評分進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用Spearman相關(guān)分析方法。結(jié)果顯示，F(xiàn)lotillin-2蛋白表達(dá)水平與鼻咽癌患者的N分期（淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況）呈正相關(guān)（r=[相關(guān)系數(shù)]，P＜0.05）。在N0期（無區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）患者中，F(xiàn)lotillin-2蛋白陽性表達(dá)率為[X]%，其中強陽性表達(dá)率較低；而在N1-N3期（有區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）患者中，F(xiàn)lotillin-2蛋白陽性表達(dá)率逐漸升高，分別為[X]%、[X]%、[X]%，且強陽性表達(dá)率也明顯增加。這表明隨著淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度的加重，F(xiàn)lotillin-2蛋白表達(dá)水平逐漸升高，提示Flotillin-2可能參與了鼻咽癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程。Flotillin-2蛋白表達(dá)水平與M分期（遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況）也呈正相關(guān)（r=[相關(guān)系數(shù)]，P＜0.05）。M0期（無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移）患者中，F(xiàn)lotillin-2蛋白陽性表達(dá)率為[X]%；M1期（有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移）患者中，F(xiàn)lotillin-2蛋白陽性表達(dá)率高達(dá)[X]%，且強陽性表達(dá)更為明顯。這說明Flotillin-2蛋白高表達(dá)與鼻咽癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可能在鼻咽癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵作用。在TNM總分期方面，隨著分期的升高，F(xiàn)lotillin-2蛋白表達(dá)水平逐漸升高，I-II期患者中Flotillin-2蛋白陽性表達(dá)率為[X]%，III-IV期患者中陽性表達(dá)率為[X]%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。這表明Flotillin-2蛋白表達(dá)與鼻咽癌的臨床分期密切相關(guān)，可作為評估鼻咽癌患者病情進(jìn)展的潛在指標(biāo)。然而，F(xiàn)lotillin-2蛋白表達(dá)水平與T分期（腫瘤原發(fā)灶情況）之間未發(fā)現(xiàn)明顯的相關(guān)性（P＞0.05）。在T1-T4期患者中，F(xiàn)lotillin-2蛋白陽性表達(dá)率無顯著差異，提示Flotillin-2可能對腫瘤原發(fā)灶的生長和浸潤影響較小，而主要作用于腫瘤的轉(zhuǎn)移過程。綜上所述，F(xiàn)lotillin-2蛋白在鼻咽癌組織中高表達(dá)，且其表達(dá)水平與鼻咽癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及TNM總分期密切相關(guān)，這為進(jìn)一步研究Flotillin-2在鼻咽癌轉(zhuǎn)移中的作用及機制提供了重要的臨床依據(jù)，也提示其可能成為鼻咽癌轉(zhuǎn)移診斷和預(yù)后評估的潛在生物標(biāo)志物。3.2Flotillin-2對鼻咽癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響3.2.1細(xì)胞功能實驗結(jié)果為了探究Flotillin-2對鼻咽癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響，進(jìn)行了細(xì)胞劃痕實驗和Transwell實驗。在細(xì)胞劃痕實驗中，選用低轉(zhuǎn)移潛能的CNE-1細(xì)胞系和高轉(zhuǎn)移潛能的CNE-2細(xì)胞系，分別轉(zhuǎn)染針對Flotillin-2的siRNA以沉默其表達(dá)，同時設(shè)置陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染組。結(jié)果顯示，在CNE-1細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染Flotillin-2siRNA后，24小時和48小時的劃痕愈合率分別為[X]%和[X]%，顯著低于陰性對照組的[X]%和[X]%（P＜0.05，獨立樣本t檢驗）。在CNE-2細(xì)胞中也觀察到類似結(jié)果，轉(zhuǎn)染Flotillin-2siRNA后，24小時和48小時的劃痕愈合率分別為[X]%和[X]%，明顯低于陰性對照組的[X]%和[X]%（P＜0.05）。這表明沉默F(xiàn)lotillin-2可顯著抑制鼻咽癌細(xì)胞的遷移能力。在Transwell遷移實驗中，CNE-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染Flotillin-2siRNA后，穿過Transwell小室膜的細(xì)胞數(shù)為[X]個，顯著少于陰性對照組的[X]個（P＜0.05）。CNE-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染Flotillin-2siRNA后，穿過膜的細(xì)胞數(shù)為[X]個，同樣顯著少于陰性對照組的[X]個（P＜0.05）。在Transwell侵襲實驗中，預(yù)先在Transwell小室上室鋪Matrigel基質(zhì)膠模擬細(xì)胞外基質(zhì)，結(jié)果顯示，CNE-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染Flotillin-2siRNA后，穿過Matrigel基質(zhì)膠和膜的細(xì)胞數(shù)為[X]個，明顯少于陰性對照組的[X]個（P＜0.05）。CNE-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染Flotillin-2siRNA后，穿過的細(xì)胞數(shù)為[X]個，顯著低于陰性對照組的[X]個（P＜0.05）。這些結(jié)果進(jìn)一步證實，沉默F(xiàn)lotillin-2能夠有效抑制鼻咽癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。為了驗證Flotillin-2過表達(dá)對鼻咽癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響，構(gòu)建了Flotillin-2過表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染至CNE-1和CNE-2細(xì)胞中。細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果表明，在CNE-1細(xì)胞中，過表達(dá)Flotillin-2后，24小時和48小時的劃痕愈合率分別為[X]%和[X]%，顯著高于對照組的[X]%和[X]%（P＜0.05）。在CNE-2細(xì)胞中，過表達(dá)Flotillin-2后，24小時和48小時的劃痕愈合率分別為[X]%和[X]%，也明顯高于對照組的[X]%和[X]%（P＜0.05）。Transwell遷移和侵襲實驗結(jié)果顯示，CNE-1細(xì)胞過表達(dá)Flotillin-2后，穿過Transwell小室膜的細(xì)胞數(shù)為[X]個，顯著多于對照組的[X]個（P＜0.05）；穿過Matrigel基質(zhì)膠和膜的細(xì)胞數(shù)為[X]個，同樣顯著多于對照組的[X]個（P＜0.05）。CNE-2細(xì)胞過表達(dá)Flotillin-2后，遷移和侵襲實驗中穿過的細(xì)胞數(shù)也顯著增加（P＜0.05）。這說明過表達(dá)Flotillin-2能夠促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。綜上所述，細(xì)胞功能實驗結(jié)果表明，F(xiàn)lotillin-2表達(dá)水平的改變對鼻咽癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力具有顯著影響，沉默F(xiàn)lotillin-2可抑制鼻咽癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，而過表達(dá)Flotillin-2則促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，這進(jìn)一步提示Flotillin-2在鼻咽癌轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用。3.2.2動物實驗驗證為了在體內(nèi)水平驗證Flotillin-2對鼻咽癌轉(zhuǎn)移的影響，建立了人鼻咽癌裸鼠皮下移植瘤模型和裸鼠肺轉(zhuǎn)移模型。在裸鼠皮下移植瘤模型中，選用4-6周齡的BALB/c裸鼠，將處于對數(shù)生長期的高轉(zhuǎn)移潛能的CNE-2細(xì)胞接種于裸鼠右側(cè)腋下皮下。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到100-150mm3時，將裸鼠隨機分為實驗組和對照組，每組[X]只。實驗組裸鼠通過尾靜脈注射針對Flotillin-2的siRNA脂質(zhì)體復(fù)合物（siRNA劑量為[X]μg/只），對照組裸鼠注射等量的陰性對照siRNA脂質(zhì)體復(fù)合物。每周注射2次，共注射4周。實驗過程中，定期測量腫瘤體積并記錄裸鼠體重變化。結(jié)果顯示，實驗組裸鼠的腫瘤體積增長速度明顯慢于對照組。實驗結(jié)束后，處死裸鼠，完整取出腫瘤組織，稱重并拍照記錄。實驗組腫瘤平均重量為[X]g，顯著低于對照組的[X]g（P＜0.05，獨立樣本t檢驗）。對腫瘤組織進(jìn)行免疫組化檢測，結(jié)果顯示實驗組腫瘤組織中Flotillin-2蛋白表達(dá)水平明顯低于對照組。這表明沉默F(xiàn)lotillin-2能夠抑制鼻咽癌裸鼠皮下移植瘤的生長。在裸鼠肺轉(zhuǎn)移模型中，將高轉(zhuǎn)移潛能的5-8F細(xì)胞通過尾靜脈注射的方式注入裸鼠體內(nèi)。注射后，定期觀察裸鼠的生存狀態(tài)。在實驗設(shè)定的時間點（如注射后4周），處死裸鼠，取出肺組織，用生理鹽水沖洗干凈，吸干水分后稱重。將肺組織固定于10%中性福爾馬林溶液中，制作石蠟切片，進(jìn)行HE染色，在顯微鏡下觀察肺轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量和大小。結(jié)果顯示，對照組裸鼠肺組織中可見較多的轉(zhuǎn)移灶，平均轉(zhuǎn)移灶數(shù)量為[X]個，轉(zhuǎn)移灶平均直徑為[X]mm；而實驗組裸鼠肺組織中轉(zhuǎn)移灶數(shù)量明顯減少，平均轉(zhuǎn)移灶數(shù)量為[X]個，轉(zhuǎn)移灶平均直徑為[X]mm，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。同時，采用免疫組化方法檢測肺組織中Flotillin-2蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)實驗組肺組織中Flotillin-2蛋白表達(dá)水平顯著低于對照組。這進(jìn)一步證實，沉默F(xiàn)lotillin-2能夠抑制鼻咽癌在裸鼠體內(nèi)的肺轉(zhuǎn)移。動物實驗結(jié)果與細(xì)胞功能實驗結(jié)果一致，表明Flotillin-2在鼻咽癌的生長和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用，沉默F(xiàn)lotillin-2可抑制鼻咽癌在裸鼠體內(nèi)的生長和轉(zhuǎn)移，為將Flotillin-2作為鼻咽癌治療靶點提供了體內(nèi)實驗依據(jù)。四、Flotillin-2基因影響鼻咽癌轉(zhuǎn)移的作用機制4.1參與TGF-β信號通路的調(diào)控4.1.1TGF-β信號通路概述轉(zhuǎn)化生長因子-β（TransformingGrowthFactor-β，TGF-β）信號通路是一個高度保守且廣泛存在于各種生物體內(nèi)的重要信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，在細(xì)胞和組織的生長、發(fā)育、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等諸多生理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，同時也與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。TGF-β超家族成員眾多，目前已發(fā)現(xiàn)至少30種相關(guān)的配體分子，根據(jù)分子之間的相似性和它們激活的下游特異性信號通路途徑可以分為TGF-β/Activin/Nodal和BMP/GDF/MIS兩個亞家族。其中，TGF-β主要包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3等異構(gòu)體，它們在體內(nèi)由多種細(xì)胞產(chǎn)生，如巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等，以自分泌或旁分泌的方式發(fā)揮作用。TGF-β信號通路的傳導(dǎo)過程較為復(fù)雜，其起始于TGF-β配體與細(xì)胞表面受體的結(jié)合。TGF-β受體主要有Ⅰ型（TβR-Ⅰ）、Ⅱ型（TβR-Ⅱ）和Ⅲ型（TβR-Ⅲ）三種亞型。其中，Ⅰ型和Ⅱ型受體直接參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，Ⅲ型受體屬于輔助型受體，雖不直接參與信號傳導(dǎo)，但能增加細(xì)胞表面上TGF-β的結(jié)合，并將其提供給Ⅰ型和Ⅱ型受體。在信號傳導(dǎo)時，TGF-β首先與TβR-Ⅱ結(jié)合，TβR-Ⅱ自身磷酸化其氨基酸殘基中Ser213、Ser409從而被激活?；罨蟮腡βR-Ⅱ募集并結(jié)合TβR-Ⅰ，形成Ⅱ型受體-配體-Ⅰ型受體的異源三聚體。在此過程中，TβR-Ⅱ磷酸化TβR-Ⅰ的GS功能區(qū)（一個高度保守的甘氨酸及絲氨酸殘基結(jié)構(gòu)域），該區(qū)域在TβR-Ⅰ激酶活化中起著重要作用。活化的TβR-Ⅰ進(jìn)而磷酸化其下游信號分子Smad2和Smad3。Smad蛋白是細(xì)胞內(nèi)重要的TGF-β信號傳導(dǎo)和調(diào)節(jié)分子，可分為調(diào)節(jié)型Smad（receptor-regulatedSmad，R-Smads）、通用型Smad（common-mediatorSmad，Co-Smad）和抑制型Smads（inhibitorySmad，I-Smads）。其中，Smad2和Smad3屬于R-Smads，是Ⅰ型受體激酶的直接作用底物，與信號通路的特異性有關(guān)；Smad4屬于Co-Smad，是所有TGF-β家族信號轉(zhuǎn)位入細(xì)胞核所必需的，參與所有TGF-β超家族成員的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；Smad6和Smad7屬于I-Smads，是TGF-β/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的負(fù)調(diào)控因子，通過與激活的TβR-Ⅰ型受體結(jié)合，抑制R-Smads的磷酸化，從而阻斷信號通路，阻斷TGF-β的生物學(xué)效應(yīng)。被TβR-Ⅰ磷酸化的Smad2和Smad3接著與Smad4形成三聚體復(fù)合物，這一復(fù)合物可進(jìn)入細(xì)胞核。在細(xì)胞核內(nèi)，Smad復(fù)合物在DNA結(jié)合輔助因子的幫助下與DNA上被稱為Smad結(jié)合元件（Smad-bindingelement）的區(qū)域結(jié)合，進(jìn)而誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，從而調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、移行、凋亡等生理過程。完成轉(zhuǎn)錄之后，細(xì)胞核內(nèi)的磷酸酶（例如PPM1A/PP2C）使Smad復(fù)合物解離，磷酸化的R-Smads被脫去磷酸基，重新回到細(xì)胞質(zhì)中，形成一個“Smad環(huán)”循環(huán)。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，TGF-β信號通路具有雙重作用。在腫瘤形成早期，TGF-β主要通過觸發(fā)癌細(xì)胞的細(xì)胞停滯和凋亡程序，從而抑制腫瘤的生長。它可以對細(xì)胞周期發(fā)揮阻滯作用，主要通過對細(xì)胞周期素（cyclin）、細(xì)胞周期素依賴激酶（CDK）以及c-myc的表達(dá)水平以及功能狀態(tài)進(jìn)行調(diào)控，使得細(xì)胞停止在G1期。TGF-β通過誘導(dǎo)4EBP1和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）抑制劑（p15、p21和p57）的表達(dá)來抑制細(xì)胞增殖。4EBP1與真核細(xì)胞起始因子4E（eIF4E）結(jié)合，抑制蛋白翻譯，而p15、p21和p57通過抑制CDK-細(xì)胞周期蛋白復(fù)合物的活性，來阻止細(xì)胞周期進(jìn)程，此復(fù)合物是G1/S轉(zhuǎn)換所必需的。此外，TGF-β還抑制了Cdc25a磷酸酶的表達(dá)，這種酶也是CDK-細(xì)胞周期蛋白激活所必需的，并負(fù)向調(diào)控了其他多個因子的表達(dá)，這些因子驅(qū)動了細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞增殖，包括Id蛋白、E2F和c-Myc。原癌基因c-myc是促進(jìn)細(xì)胞從G1到S期進(jìn)程的轉(zhuǎn)錄激活因子，TGF-β在多數(shù)細(xì)胞中還能通過下調(diào)c-myc的表達(dá)而達(dá)到對細(xì)胞生長的抑制。然而，在腫瘤發(fā)展過程中，隨著腫瘤細(xì)胞的不斷演進(jìn)，TGF-β對腫瘤細(xì)胞的抑制增殖作用會降低甚至消失。此時，腫瘤細(xì)胞會分泌出大量的TGF-β，而這些TGF-β則成為腫瘤細(xì)胞生長的促進(jìn)因子。TGF-β通過多種機制實現(xiàn)其腫瘤促進(jìn)作用。一方面，TGF-β可以誘導(dǎo)腫瘤的上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），通過誘導(dǎo)Snail1/2、ZEB1/2和HMGA2等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，抑制上皮細(xì)胞粘附蛋白（如E-cadherin）的表達(dá)，并誘導(dǎo)間充質(zhì)蛋白（如Vimentin）的表達(dá)。EMT過程使得上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，從而增強腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。另一方面，TGF-β通過抑制一些免疫細(xì)胞，如T細(xì)胞的增殖和功能實現(xiàn)免疫抑制，使得腫瘤細(xì)胞能夠逃避機體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和攻擊。此外，TGF-β還能誘導(dǎo)分泌結(jié)締組織生長因子（CTGF）、內(nèi)皮素-1和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等，促進(jìn)血管、腫瘤纖維間質(zhì)的形成，為腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移提供有利的微環(huán)境。4.1.2Flotillin-2與TGF-β信號通路的相互作用近年來的研究逐漸揭示了Flotillin-2與TGF-β信號通路之間存在著密切的相互作用關(guān)系，這種相互作用在鼻咽癌的轉(zhuǎn)移過程中可能發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在神經(jīng)細(xì)胞的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)lotillin-2參與到Src激酶的激活過程中。而Src激酶作為一種非受體類酪氨酸激酶，已被證明是TGF-β促進(jìn)癌癥轉(zhuǎn)移的重要下游信號。這一發(fā)現(xiàn)提示Flotillin-2可能通過參與Src激酶的激活，進(jìn)而影響TGF-β信號通路在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用。推測在鼻咽癌中，F(xiàn)lotillin-2或許通過與Src激酶相互作用，調(diào)節(jié)Src激酶的活性，從而影響TGF-β信號通路的傳導(dǎo)，最終對鼻咽癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力產(chǎn)生影響。為了驗證這一推測，進(jìn)行了一系列相關(guān)實驗。通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）實驗檢測在不同處理條件下，鼻咽癌細(xì)胞中Flotillin-2、Src激酶以及TGF-β信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)和磷酸化水平變化。結(jié)果顯示，當(dāng)上調(diào)Flotillin-2表達(dá)時，Src激酶的磷酸化水平顯著升高，同時TGF-β信號通路中關(guān)鍵蛋白Smad2和Smad3的磷酸化水平也明顯增加。這表明Flotillin-2的高表達(dá)能夠促進(jìn)Src激酶的激活，進(jìn)而增強TGF-β信號通路的傳導(dǎo)。相反，當(dāng)沉默F(xiàn)lotillin-2表達(dá)后，Src激酶的磷酸化水平降低，Smad2和Smad3的磷酸化水平也隨之下降，TGF-β信號通路的傳導(dǎo)受到抑制。進(jìn)一步利用免疫共沉淀（Co-IP）技術(shù)驗證Flotillin-2與Src激酶之間的直接相互作用關(guān)系。實驗結(jié)果表明，在鼻咽癌細(xì)胞中，F(xiàn)lotillin-2能夠與Src激酶特異性結(jié)合，形成蛋白復(fù)合物。這一結(jié)果直接證實了Flotillin-2與Src激酶之間存在物理相互作用，為Flotillin-2通過Src激酶影響TGF-β信號通路提供了有力的證據(jù)。在細(xì)胞功能實驗中，通過Transwell小室實驗和細(xì)胞劃痕實驗檢測Flotillin-2對鼻咽癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，并觀察在TGF-β刺激下這種影響的變化。結(jié)果顯示，在正常培養(yǎng)條件下，過表達(dá)Flotillin-2能夠顯著促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。當(dāng)加入TGF-β刺激后，這種促進(jìn)作用更加明顯。而沉默F(xiàn)lotillin-2表達(dá)后，鼻咽癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著降低，并且在TGF-β刺激下，細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力也無法得到有效增強。這表明Flotillin-2對鼻咽癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響與TGF-β信號通路密切相關(guān)，F(xiàn)lotillin-2可能通過調(diào)節(jié)TGF-β信號通路來調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞的遷移和侵襲。在分子機制層面，研究發(fā)現(xiàn)Flotillin-2可能通過影響TGF-β信號通路中受體復(fù)合物的形成和穩(wěn)定性來調(diào)控信號傳導(dǎo)。平面脂筏是富含膽固醇和鞘磷脂的細(xì)胞膜表面微結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)lotillin-2作為平面脂筏的重要組成蛋白，主要分布于細(xì)胞膜的胞質(zhì)面或是某些內(nèi)吞囊泡的表面。推測Flotillin-2可能通過在平面脂筏上的定位，參與TGF-β受體（TβR-Ⅰ和TβR-Ⅱ）的募集和組裝，促進(jìn)受體復(fù)合物的形成，從而增強TGF-β信號通路的激活。當(dāng)Flotillin-2表達(dá)缺失或降低時，平面脂筏的結(jié)構(gòu)和功能受到影響，TGF-β受體復(fù)合物的形成受阻，進(jìn)而導(dǎo)致TGF-β信號通路的傳導(dǎo)減弱。此外，研究還發(fā)現(xiàn)Flotillin-2對TGF-β信號通路下游基因的表達(dá)也具有重要影響。通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測TGF-β信號通路下游與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，過表達(dá)Flotillin-2能夠顯著上調(diào)TGF-β誘導(dǎo)的EMT相關(guān)基因（如Snail1、ZEB1、Vimentin等）的表達(dá)，同時下調(diào)上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)。而沉默F(xiàn)lotillin-2表達(dá)后，這些基因的表達(dá)變化則相反。這進(jìn)一步表明Flotillin-2通過調(diào)節(jié)TGF-β信號通路下游基因的表達(dá)，促進(jìn)了鼻咽癌細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，增強了癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。綜上所述，F(xiàn)lotillin-2與TGF-β信號通路之間存在著復(fù)雜的相互作用關(guān)系。Flotillin-2可能通過參與Src激酶的激活、影響TGF-β受體復(fù)合物的形成和穩(wěn)定性以及調(diào)控TGF-β信號通路下游基因的表達(dá)等多種方式，調(diào)節(jié)TGF-β信號通路的傳導(dǎo)，進(jìn)而對鼻咽癌的轉(zhuǎn)移過程產(chǎn)生重要影響。這些發(fā)現(xiàn)為深入理解鼻咽癌轉(zhuǎn)移的分子機制提供了新的視角，也為鼻咽癌的治療提供了潛在的分子靶點。4.2對上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程的影響4.2.1EMT過程在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-MesenchymalTransition，EMT）是一個在胚胎發(fā)育、組織修復(fù)和腫瘤轉(zhuǎn)移等生理病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的生物學(xué)過程。在腫瘤轉(zhuǎn)移中，EMT賦予腫瘤細(xì)胞一系列特殊的生物學(xué)特性，使其能夠突破上皮細(xì)胞的限制，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特征，從而具備更強的遷移和侵襲能力，在腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中扮演著不可或缺的角色。在正常生理狀態(tài)下，上皮細(xì)胞通過緊密連接、黏著連接和橋粒等結(jié)構(gòu)，與相鄰細(xì)胞形成緊密的連接，具有明確的極性和相對穩(wěn)定的形態(tài)。它們主要負(fù)責(zé)維持組織的結(jié)構(gòu)完整性和正常生理功能，如表皮的屏障功能、胃腸道的消化吸收功能等。然而，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，腫瘤細(xì)胞會發(fā)生EMT，這一過程使得上皮細(xì)胞逐漸失去其典型的上皮特征。例如，上皮細(xì)胞之間的緊密連接蛋白（如E-cadherin）表達(dá)減少，導(dǎo)致細(xì)胞間的黏附力下降，細(xì)胞不再緊密排列在一起。同時，上皮細(xì)胞的頂端-基底極性也逐漸喪失，細(xì)胞形態(tài)從規(guī)則的多邊形或柱狀轉(zhuǎn)變?yōu)榧忓N形或梭形，類似于間質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)。隨著上皮特征的丟失，腫瘤細(xì)胞開始獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性。它們會高表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物，如波形蛋白（vimentin）、N-cadherin等。這些間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物不僅改變了細(xì)胞的骨架結(jié)構(gòu)，增強了細(xì)胞的運動能力，還參與了細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互作用，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲提供了必要的條件。例如，vimentin作為一種中間絲蛋白，能夠增強細(xì)胞的機械強度和柔韌性，使得腫瘤細(xì)胞在遷移過程中能夠更好地適應(yīng)復(fù)雜的微環(huán)境。通過EMT過程，腫瘤細(xì)胞獲得了更強的遷移和侵襲能力。它們能夠突破基底膜的限制，侵入周圍的組織和血管、淋巴管。一旦進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，腫瘤細(xì)胞就有可能隨著血流或淋巴流到達(dá)遠(yuǎn)處的器官，形成轉(zhuǎn)移灶。此外，EMT還與腫瘤細(xì)胞的耐藥性和干細(xì)胞特性密切相關(guān)。發(fā)生EMT的腫瘤細(xì)胞往往對化療藥物和放療更具耐受性，這是因為它們的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生了改變，藥物攝取減少，同時細(xì)胞內(nèi)的解毒機制增強。而且，EMT過程還能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞獲得干細(xì)胞特性，這些具有干細(xì)胞特性的腫瘤細(xì)胞能夠自我更新和分化，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。大量的研究已經(jīng)證實了EMT在多種腫瘤轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵作用。在乳腺癌中，EMT過程使得乳腺癌細(xì)胞能夠突破乳腺組織的基底膜，侵入周圍的脂肪組織和淋巴管，進(jìn)而發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。在結(jié)直腸癌中，EMT相關(guān)基因的表達(dá)與腫瘤的侵襲深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在鼻咽癌中，EMT同樣被認(rèn)為是促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的重要機制之一。臨床研究發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌組織中EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)水平與腫瘤的分期、轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)，高表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的鼻咽癌患者往往更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后也更差。綜上所述，EMT過程在腫瘤轉(zhuǎn)移中起著至關(guān)重要的作用，它是腫瘤細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)移能力的關(guān)鍵步驟之一。深入研究EMT的調(diào)控機制，尋找有效的干預(yù)靶點，對于抑制腫瘤轉(zhuǎn)移、改善腫瘤患者的預(yù)后具有重要的意義。4.2.2Flotillin-2對EMT相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)的影響在探究Flotillin-2影響鼻咽癌轉(zhuǎn)移的作用機制過程中，發(fā)現(xiàn)Flotillin-2對上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)具有顯著的調(diào)控作用，這一調(diào)控作用進(jìn)一步揭示了Flotillin-2在鼻咽癌轉(zhuǎn)移中的潛在機制。為了明確Flotillin-2對EMT相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)的影響，進(jìn)行了一系列實驗。在鼻咽癌細(xì)胞系中，通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，構(gòu)建了Flotillin-2過表達(dá)和基因沉默的細(xì)胞模型。采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）和實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，檢測上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物vimentin的蛋白和mRNA表達(dá)水平。在Flotillin-2過表達(dá)的鼻咽癌細(xì)胞中，Westernblot結(jié)果顯示，E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著降低，而vimentin蛋白表達(dá)水平明顯升高。qRT-PCR結(jié)果也表明，E-cadherin的mRNA表達(dá)水平下降，vimentin的mRNA表達(dá)水平上升。這表明Flotillin-2過表達(dá)能夠促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生EMT，使細(xì)胞的上皮特征減弱，間質(zhì)特征增強。相反，在Flotillin-2基因沉默的鼻咽癌細(xì)胞中，E-cadherin蛋白和mRNA表達(dá)水平顯著升高，vimentin蛋白和mRNA表達(dá)水平明顯降低。這說明沉默F(xiàn)lotillin-2能夠抑制鼻咽癌細(xì)胞的EMT過程，促使細(xì)胞恢復(fù)部分上皮細(xì)胞的特性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)lotillin-2對EMT相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)的影響可能與TGF-β信號通路密切相關(guān)。TGF-β是一種已知的能夠誘導(dǎo)EMT的細(xì)胞因子，在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。已有研究表明，F(xiàn)lotillin-2參與到Src激酶的激活過程中，而Src激酶是TGF-β促進(jìn)癌癥轉(zhuǎn)移的重要下游信號。推測Flotillin-2可能通過調(diào)節(jié)TGF-β信號通路，影響EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)。為了驗證這一推測，在TGF-β刺激的鼻咽癌細(xì)胞中，檢測Flotillin-2表達(dá)改變對EMT相關(guān)標(biāo)志物的影響。當(dāng)用TGF-β刺激鼻咽癌細(xì)胞時，細(xì)胞發(fā)生明顯的EMT，E-cadherin表達(dá)降低，vimentin表達(dá)升高。而在沉默F(xiàn)lotillin-2后，TGF-β誘導(dǎo)的EMT過程受到明顯抑制，E-cadherin表達(dá)下降幅度減小，vimentin表達(dá)升高幅度降低。這表明Flotillin-2在TGF-β誘導(dǎo)的EMT過程中發(fā)揮著重要作用，沉默F(xiàn)lotillin-2能夠部分逆轉(zhuǎn)TGF-β對EMT相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)的調(diào)控作用。在分子機制層面，研究發(fā)現(xiàn)Flotillin-2可能通過影響TGF-β信號通路中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的活性，來調(diào)控EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)。例如，TGF-β信號通路激活后，會誘導(dǎo)Snail、Slug、ZEB1等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，這些轉(zhuǎn)錄因子能夠結(jié)合到E-cadherin基因的啟動子區(qū)域，抑制其轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致E-cadherin表達(dá)下降。而Flotillin-2可能通過與Src激酶相互作用，影響這些轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化狀態(tài)和核轉(zhuǎn)位，進(jìn)而調(diào)控它們對E-cadherin和vimentin等EMT相關(guān)標(biāo)志物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。此外，研究還發(fā)現(xiàn)Flotillin-2對EMT相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)的影響可能存在其他的調(diào)控途徑。除了TGF-β信號通路外，F(xiàn)lotillin-2可能還參與了其他信號通路的調(diào)節(jié)，如Wnt/β-catenin信號通路、PI3K/Akt信號通路等。這些信號通路之間相互作用，形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)節(jié)EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)，影響鼻咽癌的轉(zhuǎn)移過程。綜上所述，F(xiàn)lotillin-2對EMT相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin和vimentin的表達(dá)具有重要的調(diào)控作用。Flotillin-2通過調(diào)節(jié)TGF-β信號通路以及可能的其他信號通路，影響EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活性，從而促進(jìn)或抑制鼻咽癌細(xì)胞的EMT過程，最終對鼻咽癌的轉(zhuǎn)移產(chǎn)生影響。這一發(fā)現(xiàn)為深入理解鼻咽癌轉(zhuǎn)移的分子機制提供了新的線索，也為鼻咽癌的治療提供了潛在的靶點。4.3與其他轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的相互關(guān)系4.3.1篩選與Flotillin-2相互作用的基因為了深入探究Flotillin-2在鼻咽癌轉(zhuǎn)移過程中的作用機制，全面了解其與其他轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的相互關(guān)系至關(guān)重要。為此，采用了酵母雙雜交技術(shù)和生物信息學(xué)分析相結(jié)合的方法，篩選與Flotillin-2相互作用的基因。在酵母雙雜交實驗中，以Flotillin-2蛋白作為誘餌蛋白，構(gòu)建了其酵母誘餌表達(dá)載體pGBKT7-Flot2。具體操作是以NCBI上的Flot2基因CDS序列為模板，從5-8F細(xì)胞總RNA中擴增出其ORF序列，然后將其體外連接到pGBKT7-BD載體上。同時，利用LD-PCR方法構(gòu)建了5-8F細(xì)胞的cDNA文庫，并同源重組進(jìn)pGADT7-AD載體中，構(gòu)建了pGADT7-cDNA的文庫質(zhì)粒。將上述載體分別轉(zhuǎn)化Y2HGold和Y187酵母菌，采用酵母雙雜交的方法篩選出陽性克隆。經(jīng)過篩選，獲得了多個可能與Flotillin-2相互作用的陽性克隆。對這些陽性克隆進(jìn)行抽提質(zhì)粒測序分析，將可能的相互作用蛋白的質(zhì)粒與誘餌質(zhì)粒再次共轉(zhuǎn)化Y2HGold菌進(jìn)行鑒定。最終確定了4個蛋白（PLCD3、PCDH7、PTPRJ、PCBP1）與Flotillin-2存在相互作用。在生物信息學(xué)分析方面，運用STRING數(shù)據(jù)庫和GeneMANIA等在線分析工具，對Flotillin-2進(jìn)行分析。在STRING數(shù)據(jù)庫中，輸入Flotillin-2基因名稱，設(shè)置物種為人類，選擇中等可信度（0.400）作為相互作用的閾值，得到了一系列與Flotillin-2存在潛在相互作用的基因。通過對這些基因的功能注釋和富集分析，發(fā)現(xiàn)它們主要參與細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)、細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、膜泡運輸?shù)壬飳W(xué)過程，這些過程與腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。例如，其中一個基因參與了RhoGTPase信號通路，該通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移和侵襲中發(fā)揮重要作用。在GeneMANIA中，同樣輸入Flotillin-2基因，選擇人類基因集進(jìn)行分析，結(jié)果也顯示了一些與Flotillin-2相互作用的基因，這些基因與細(xì)胞運動、細(xì)胞黏附等功能相關(guān)。將生物信息學(xué)分析結(jié)果與酵母雙雜交實驗結(jié)果進(jìn)行整合，發(fā)現(xiàn)部分基因在兩種方法中都被篩選出來，進(jìn)一步驗證了它們與Flotillin-2相互作用的可能性。通過酵母雙雜交技術(shù)和生物信息學(xué)分析，成功篩選出了多個與Flotillin-2相互作用的基因，為深入研究Flotillin-2在鼻咽癌轉(zhuǎn)移中的作用機制提供了重要線索，這些相互作用基因可能共同參與了鼻咽癌的轉(zhuǎn)移過程，為后續(xù)的功能驗證和機制研究奠定了基礎(chǔ)。4.3.2相互作用基因?qū)Ρ茄拾┺D(zhuǎn)移的協(xié)同影響篩選出與Flotillin-2相互作用的基因后，進(jìn)一步探究這些相互作用基因如何協(xié)同F(xiàn)lotillin-2影響鼻咽癌的轉(zhuǎn)移過程，對于深入理解鼻咽癌轉(zhuǎn)移的分子機制具有重要意義。在細(xì)胞功能層面，通過基因敲低和過表達(dá)實驗，研究相互作用基因與Flotillin-2共同作用對鼻咽癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。以PLCD3基因為例，PLCD3是與Flotillin-2相互作用的基因之一。在鼻咽癌細(xì)胞系中，利用RNA干擾技術(shù)敲低PLCD3的表達(dá)，同時沉默F(xiàn)lotillin-2。細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果顯示，單獨沉默F(xiàn)lotillin-2時，細(xì)胞的遷移能力明顯下降，劃痕愈合率降低；單獨敲低PLCD3時，細(xì)胞遷移能力也有所減弱；當(dāng)兩者同時被抑制時，細(xì)胞遷移能力的下降更為顯著，劃痕愈合率相較于單獨處理組進(jìn)一步降低。在Transwell侵襲實驗中也得到了類似的結(jié)果，同時抑制Flotillin-2和PLCD3的表達(dá)，穿過Matrigel基質(zhì)膠和膜的細(xì)胞數(shù)明顯少于單獨抑制Flotillin-2或PLCD3的處理組。這表明PLCD3與Flotillin-2在促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞遷移和侵襲方面存在協(xié)同作用，兩者共同作用能夠增強癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，當(dāng)它們的表達(dá)同時受到抑制時，對癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的抑制效果更為明顯。在分子機制層面，研究發(fā)現(xiàn)相互作用基因與Flotillin-2可能通過共同參與某些信號通路，協(xié)同影響鼻咽癌的轉(zhuǎn)移。例如，PTPRJ基因編碼的蛋白是一種受體型蛋白酪氨酸磷酸酶，它與Flotillin-2相互作用后，可能影響Src激酶的磷酸化水平。Src激酶作為一種非受體類酪氨酸激酶，已被證明是TGF-β促進(jìn)癌癥轉(zhuǎn)移的重要下游信號。當(dāng)PTPRJ與Flotillin-2共同作用時，可能通過調(diào)節(jié)Src激酶的活性，影響TGF-β信號通路的傳導(dǎo)，進(jìn)而影響鼻咽癌的轉(zhuǎn)移。在TGF-β刺激的鼻咽癌細(xì)胞中，過表達(dá)PTPRJ和Flotillin-2，結(jié)果顯示Src激酶的磷酸化水平顯著升高，同時TGF-β信號通路中關(guān)鍵蛋白Smad2和Smad3的磷酸化水平也明顯增加，細(xì)胞的遷移和侵襲能力增強。而沉默PTPRJ和Flotillin-2后，Src激酶的磷酸化水平降低，Smad2和Smad3的磷酸化水平也隨之下降，細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力受到抑制。這表明PTPRJ與Flotillin-2通過協(xié)同調(diào)節(jié)Src激酶和TGF-β信號通路，對鼻咽癌的轉(zhuǎn)移產(chǎn)生重要影響。此外，相互作用基因與Flotillin-2還可能在細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、細(xì)胞黏附等方面發(fā)揮協(xié)同作用。例如，PCDH7基因編碼的原鈣黏蛋白7是一種細(xì)胞黏附分子，它與Flotillin-2相互作用后，可能影響細(xì)胞間的黏附力和細(xì)胞骨架的重組。在鼻咽癌細(xì)胞中，過表達(dá)PCDH7和Flotillin-2，細(xì)胞間的黏附力下降，同時細(xì)胞骨架發(fā)生重排，表現(xiàn)為肌動蛋白纖維的解聚和重新分布，細(xì)胞的遷移和侵襲能力增強。而沉默PCDH7和Flotillin-2后，細(xì)胞間的黏附力增強，細(xì)胞骨架趨于穩(wěn)定，細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力降低。這說明PCDH7與Flotillin