RT－PCR、反向PCR與PCR定點(diǎn)誘變技術(shù)(時(shí)間：40分鐘)專題練151.(2025·山東青島模擬)將草甘膦抗性基因轉(zhuǎn)入甘藍(lán)植株，獲得抗草甘膦轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)。回答下列問題：(1)草甘膦抗性基因一條鏈的兩端序列如圖1所示，采用PCR技術(shù)獲取和擴(kuò)增草甘膦抗性基因時(shí)應(yīng)選用的2種引物序列是___________________________________________(標(biāo)出5′端和3′端)。若初始加入1個(gè)草甘膦抗性基因，則歷經(jīng)4次PCR循環(huán)需要消耗引物數(shù)量為________個(gè)。5′－CTTGGATGAT－3′和5′－TCTGTTGAAT－3′30(2)圖2中步驟③將農(nóng)桿菌與甘藍(lán)愈傷組織共培養(yǎng)后，在步驟④的培養(yǎng)基中添加________以便篩選出含目的基因的甘藍(lán)植株。添加此抗生素而不選用添加另一種抗生素篩選的原因是________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。潮霉素由圖可知，潮霉素抗性基因在T－DNA片段，卡那霉素抗性基因不在T－DNA片段，所以潮霉素抗性基因可隨T－DNA轉(zhuǎn)移到被侵染的細(xì)胞中，并且隨其整合到該細(xì)胞的染色體DNA上，從而使含目的基因的甘藍(lán)植株有抗潮霉素的抗性，所以能在含潮霉素的培養(yǎng)基上篩選含目的基因的甘藍(lán)植株(3)若要獲得抗除草劑能力更強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)植株，可以用草甘膦抗性基因進(jìn)行改造，最終得到相應(yīng)的蛋白質(zhì)，該過程需用到________工程。檢測轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)植株是否產(chǎn)生抗除草劑蛋白，所用的方法是________________。蛋白質(zhì)抗原—抗體雜交(4)為確定步驟③中T－DNA(堿基序列已知)的插入位置，往往需要用反向PCR技術(shù)測定插入部位的堿基序列，其原理如圖3：①不直接在圖3a中的DNA分子的兩端設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行擴(kuò)增，原因是___________________________________________。②PCR測序與反向PCR________(填“可以”或“不可以”)選用相同的一對引物，原因是_________________________________________________________。T－DNA兩端序列未知，無法設(shè)計(jì)引物可以PCR測序與反向PCR擴(kuò)增的片段相同，可選用相同的一對引物解析(1)圖1所示堿基序列磷酸端為5′端，羥基端為3′端，在進(jìn)行PCR操作時(shí)，引物應(yīng)分別從基因兩條鏈的3′端根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則結(jié)合，根據(jù)圖中兩端序列可推知選用的2種引物序列是5′－CTTGGATGAT－3′和5′－TCTGTTGAAT－3′。若初始加入1個(gè)草甘膦抗性基因，則歷經(jīng)4次PCR循環(huán)可形成16個(gè)DNA分子，其中原有2條母鏈的沒有引物，其余子鏈都有引物，故需要消耗引物數(shù)量為15×2＝30(個(gè))。(2)圖2中步驟③將農(nóng)桿菌與甘藍(lán)愈傷組織共培養(yǎng)后，在步驟④的培養(yǎng)基中添加潮霉素以便篩選出含目的基因的甘藍(lán)植株。由圖可知，潮霉素抗性基因在T－DNA片段中，卡那霉素抗性基因不在T－DNA片段中，所以潮霉素抗性基因可隨T－DNA轉(zhuǎn)移到被侵染的細(xì)胞，并且隨其整合到該細(xì)胞的染色體DNA上，從而使含目的基因的甘藍(lán)植株有抗潮霉素的抗性，所以能在含潮霉素的培養(yǎng)基上篩選含目的基因的甘藍(lán)植株。(3)對草甘膦抗性基因進(jìn)行改造，最終得到相應(yīng)的蛋白質(zhì)，該過程需用到蛋白質(zhì)工程。檢測轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)植株是否產(chǎn)生抗除草劑蛋白，可以用抗原—抗體雜交的方法。(4)①不直接在圖3a中的DNA分子的兩端設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行擴(kuò)增，原因是T－DNA兩端序列未知，無法設(shè)計(jì)引物。②由于PCR測序與反向PCR擴(kuò)增的片段相同，所以PCR測序與反向PCR可選用相同的一對引物。2.(2025·山西臨汾質(zhì)檢)沿海灘涂土壤鹽堿化程度高，作物產(chǎn)量低。實(shí)驗(yàn)人員將植物乙中的耐鹽堿基因a導(dǎo)入作物甲，獲得了轉(zhuǎn)基因耐鹽堿的作物甲。實(shí)驗(yàn)人員通過PCR技術(shù)對轉(zhuǎn)基因作物甲中的基因a進(jìn)行檢測，過程如圖1所示?；卮鹣铝袉栴}：(1)實(shí)驗(yàn)人員提取轉(zhuǎn)基因作物甲的總DNA作為PCR擴(kuò)增的______，PCR擴(kuò)增所依據(jù)的原理是__________________。模板DNA半保留復(fù)制(2)PCR擴(kuò)增時(shí)除要加入耐高溫的DNA聚合酶外，還需要引物。設(shè)計(jì)圖1中引物1和引物2的核苷酸序列時(shí)需要注意的事項(xiàng)有____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________(答出1點(diǎn)即可)。引物1和引物2中的核苷酸序列能夠與耐鹽堿基因a母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對、引物1和引物2中的核苷酸序列不能進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對、引物內(nèi)部的堿基序列不能進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對、引物片段不能過短、引物片段不宜過長(3)實(shí)驗(yàn)人員用引物1和引物2分別對植物乙(P1)，轉(zhuǎn)基因作物甲(P2)和轉(zhuǎn)基因作物甲(P3)的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，結(jié)果如圖2所示。耐鹽堿基因a的長度介于____________bp之間，轉(zhuǎn)基因作物甲(P2)除含有耐鹽堿基因a的條帶外，還含有另外一條帶，推測該條帶出現(xiàn)的原因可能是___________________________________________________________________________(答出1點(diǎn)即可)。1000至1200轉(zhuǎn)基因作物甲基因組中存在其他能與引物1和引物2進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對的DNA序列(4)常規(guī)PCR只能擴(kuò)增兩引物間的DNA片段，要擴(kuò)增已知DNA序列兩側(cè)的未知DNA序列，可用反向PCR技術(shù)，反向PCR技術(shù)擴(kuò)增的原理如圖3所示。PCR擴(kuò)增時(shí)選用的一對引物是________________，從a到b的過程中是否需要使用限制酶將PCR產(chǎn)物剪切成鏈狀？________，理由是________________________________________________。引物3和引物4不需要可能會(huì)破壞已知DNA序列兩側(cè)的未知DNA序列解析(1)進(jìn)行擴(kuò)增PCR時(shí)需要模板，可提取轉(zhuǎn)基因作物甲的總DNA作為PCR擴(kuò)增的模板。PCR是一項(xiàng)根據(jù)DNA半保留復(fù)制的原理，在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。(2)設(shè)計(jì)擴(kuò)增的引物時(shí)，需要有一段已知的目的基因的脫氧核苷酸序列，使設(shè)計(jì)的引物能與目的基因堿基互補(bǔ)配對。此外，兩個(gè)引物之間以及引物內(nèi)部的堿基序列不能進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對，以免引物與引物結(jié)合影響擴(kuò)增，故設(shè)計(jì)圖1中引物1和引物2的核苷酸序列時(shí)需要注意的事項(xiàng)有引物1和引物2中的核苷酸序列能夠與耐鹽堿基因a母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對、引物1和引物2中的核苷酸序列不能進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對、引物內(nèi)部的堿基序列不能進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對、引物片段不能過短、引物片段不宜過長。(3)根據(jù)題意可知，實(shí)驗(yàn)人員將植物乙中的耐鹽堿基因a導(dǎo)入作物甲中，獲得了轉(zhuǎn)基因耐鹽堿的作物甲，因此植物乙(P1)和轉(zhuǎn)基因作物甲(P2)中都含有耐鹽堿基因a。由圖2可知，耐鹽堿基因a的長度介于1000bp至1200bp之間。P2組(轉(zhuǎn)基因作物甲)除含有耐鹽堿基因a的條帶外，還含有另外一條帶，由于這兩條條帶都是用引物1和引物2進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)生的，表明轉(zhuǎn)基因作物甲基因組中存在其他能與引物1和引物2進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對的DNA序列。(4)PCR過程需要兩種引物，能分別與目的基因兩條鏈的3′端通過堿基互補(bǔ)配對結(jié)合，為保證延伸的是已知序列兩側(cè)的未知序列，應(yīng)該選擇引物3和引物4，且二者間不能互補(bǔ)配對。在反向PCR技術(shù)中，環(huán)狀DNA分子的形成是為了允許PCR擴(kuò)增跨越已知序列，進(jìn)入其兩側(cè)的未知區(qū)域，如果使用限制酶將PCR產(chǎn)物剪切成鏈狀，可能會(huì)破壞已知DNA序列兩側(cè)的未知DNA序列。3.(2025·山東濟(jì)寧模擬)PCR技術(shù)的實(shí)用性和極強(qiáng)的生命力使其成為生物科學(xué)研究的一種重要方法，極大地推動(dòng)了分子生物學(xué)以及生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。下面是兩個(gè)具體實(shí)驗(yàn)中的PCR技術(shù)應(yīng)用，請根據(jù)資料回答下列問題： (1)重疊延伸PCR技術(shù)是一種通過寡聚核苷酸鏈之間重疊的部分互相搭橋、互為模板，通過多次PCR擴(kuò)增，從而獲得目的基因的方法。利用該技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)基因的定點(diǎn)誘變。它在需要誘變的位置合成兩個(gè)帶有變異基因堿基的互補(bǔ)引物，然后分別與引物a和引物d做PCR，這樣得到的兩個(gè)PCR引物產(chǎn)物都帶有變異基因，并且彼此重疊，再將重疊部位進(jìn)行重組PCR就能得到誘變PCR產(chǎn)物，如圖所示：①PCR擴(kuò)增DNA的過程中，引物a、b、c、d中，PCR1應(yīng)選擇圖1中引物________，大量擴(kuò)增突變產(chǎn)物AD則應(yīng)選擇引物________。②重疊延伸PCR通過_____________________實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)突變。PCR1和PCR2需要分別進(jìn)行的原因是_________________________________________。a和ba和d在引物b和c上引入突變引物b和引物c可以互補(bǔ)配對，導(dǎo)致引物失效③若正?；蚩杀幌拗泼窪pnⅠ識(shí)別并切割，特定位點(diǎn)突變后的基因不能被DpnⅠ識(shí)別，請?jiān)O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)思路鑒定上述過程獲得的突變產(chǎn)物AD是否為突變基因：_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。用限制酶DpnⅠ分別處理正?；蚝蜕鲜鲞^程獲得的突變產(chǎn)物AD，然后進(jìn)行電泳；若上述過程獲得的突變產(chǎn)物AD的電泳條帶只有一條且大于正常基因的電泳條帶，則為突變基因(2)反向PCR可用于擴(kuò)增未知序列，其原理如下圖所示。下圖鏈狀DNA分子內(nèi)側(cè)是已知序列，外側(cè)為未知序列。①不直接在圖3中DNA分子的兩端設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行擴(kuò)增，原因是_____________________________________。②圖4中環(huán)狀DNA進(jìn)行PCR的過程中，沿引物A延伸子鏈的延伸方向是________(填“順時(shí)針”或“逆時(shí)針”)，PCR產(chǎn)物________(填“含有”或“不含”)EcoRⅠ的酶切位點(diǎn)。DNA兩端序列未知，無法設(shè)計(jì)引物逆時(shí)針含有解析(1)①PCR擴(kuò)增DNA的過程中，新合成的兩條單鏈延伸方向相反，根據(jù)圖中引物的方向可知，PCR1應(yīng)選擇引物a和b，得到產(chǎn)物AB。PCR2應(yīng)選擇引物c和d，得到產(chǎn)物CD。突變產(chǎn)物AD擴(kuò)增應(yīng)選擇的引物是a和d。重疊延伸時(shí)，可以分別以AB上鏈和CD下鏈為引物進(jìn)行延伸，所以不需要引物。②重疊延伸PCR通過在引物b和c上引入突變實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)突變。由于引物b和引物c可以互補(bǔ)配對，導(dǎo)致引物失效，所以PCR1和PCR2需要分別進(jìn)行。③據(jù)題意可知，正?；蚩杀幌拗泼窪pnⅠ識(shí)別并切割，特定位點(diǎn)突變后的基因不能被DpnⅠ識(shí)別，因此要鑒定獲得的突變產(chǎn)物AD是否為突變基因，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路為：用限制酶DpnⅠ分別處理正常基因和上述過程獲得的突變產(chǎn)物AD，然后進(jìn)行電泳；若上述過程獲得的突變產(chǎn)物AD的電泳條帶只有一條且大于正?；虻碾娪緱l