項(xiàng)目類別項(xiàng)目批準(zhǔn)號(hào)附件3華南農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生科技創(chuàng)新活動(dòng)項(xiàng)目結(jié)題書項(xiàng)目名稱：送檢病料圓環(huán)病毒PCR檢測與流行病學(xué)調(diào)查申請(qǐng)人：李培龍所在院部：獸醫(yī)學(xué)院專業(yè)年級(jí)：動(dòng)物醫(yī)學(xué)2002級(jí)聯(lián)系電話：指導(dǎo)教師:黃毓茂職稱副教授立項(xiàng)日期：二○○年月日結(jié)題日期：二○○年月日華南農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生科技創(chuàng)新活動(dòng)項(xiàng)目指導(dǎo)中心填表說明一、填寫結(jié)題報(bào)告書前，請(qǐng)先咨詢指導(dǎo)教師或有關(guān)專業(yè)教師。申請(qǐng)書的各項(xiàng)內(nèi)容要求實(shí)事求是，逐條認(rèn)真填寫。表達(dá)明確、嚴(yán)謹(jǐn)，一律要求用打印稿件。二、申請(qǐng)書為A4復(fù)印紙，于左側(cè)裝訂成冊(cè)。一式三份（至少一份原件），由指導(dǎo)教師和所在院（部）審查并簽署意見后報(bào)大學(xué)生科技創(chuàng)新活動(dòng)項(xiàng)目指導(dǎo)中心。三、一級(jí)標(biāo)題三號(hào)宋體加粗，用“一、二、三”標(biāo)示；二級(jí)標(biāo)題四號(hào)楷體加粗，用“（一）（二）（三）”標(biāo)示；三級(jí)標(biāo)題四號(hào)仿宋加粗，用“1、2、3”標(biāo)示；四級(jí)標(biāo)題四號(hào)仿宋，用“①②③”標(biāo)示。示例：一、《XXXX》課題立項(xiàng)與研究的目的意義（一）《XXXX》課題立項(xiàng)與研究的目的的意義1、《XXXX》課題立項(xiàng)與研究的目的意義①《XXXX》課題立項(xiàng)與研究的目的意義四、如表格不夠，可以加附頁。一、簡表項(xiàng)目簡況項(xiàng)目名稱送檢病料圓環(huán)病毒PCR檢測與流行病學(xué)調(diào)查項(xiàng)目類別A、文科類；√B、理科類；申請(qǐng)經(jīng)費(fèi)1200元起止年月2005年6月－2006年5月項(xiàng)目組成員姓名性別出生年月年級(jí)專業(yè)班級(jí)所在學(xué)院上學(xué)年綜合測評(píng)分項(xiàng)目中的分工本人簽字李培龍男1985年8月動(dòng)物醫(yī)學(xué)2002級(jí)4班獸醫(yī)學(xué)院72.3負(fù)責(zé)指導(dǎo)教師情況姓名黃毓茂性別男學(xué)位博士職稱副教授研究方向家畜傳染病學(xué)、豬病的診斷與防治等授課名稱《家畜傳染病學(xué)》《分子生物學(xué)》等項(xiàng)目簡介豬圓環(huán)病毒（Porcinecircovirus，PCV）屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬。是動(dòng)物病毒中最小的一員。該病毒可長期持續(xù)污染PK－15細(xì)胞，不出現(xiàn)巨細(xì)胞病毒細(xì)胞病變（CPE）。臨床上，PCV2對(duì)豬有致病性，是斷奶后仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的主要病原體，PCV=1\*ROMANI對(duì)豬無致病性。目前，由PCV2引起的PMWS的流行已呈世界性的，全世界養(yǎng)豬業(yè)因PMWS而造成的經(jīng)濟(jì)損失已不可估量。北美的加拿大和美國，歐洲的西班牙、英、法、德、丹麥、奧地利，亞洲的日本、泰國、韓國和臺(tái)灣省等一些國家和地區(qū)都先后報(bào)道了PMWS的發(fā)生，并從病料中分離到PCV2(DaftBetal，1996；EllisJetal，1998；Mankertzetal，1999；OnukiAetal，1999)。朗洪武等于1999年7月，從北京、河北某些豬場疑似PMWS的病豬分離到2株病毒。經(jīng)電鏡觀察、間接免疫熒光試驗(yàn)、PCR試驗(yàn)鑒定為PCV－2，首次證明了PMWS在中國大陸的存在。到現(xiàn)在為止，從海南省到黑龍江省，中國的大部分省份和地區(qū)都報(bào)道了PMWS的發(fā)生，并從病料中分離到PCV2，這一切都說明國內(nèi)豬群PCV2的感染程度也相當(dāng)嚴(yán)重。本項(xiàng)目即是對(duì)廣東、廣西地區(qū)某些豬場送檢的疑似PMWS的病死豬進(jìn)行PCR診斷，統(tǒng)計(jì)分析廣東廣西地區(qū)PCV－2的感染情況，并且分離出PCV2，對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增、克隆其ORF2基因段，和Genbank中發(fā)表的國內(nèi)外PCV２參考毒株進(jìn)行核苷酸同源性比較，分析核苷酸序列的差異，在分子水平上對(duì)PCV２的發(fā)生和發(fā)展規(guī)律進(jìn)行初步研究和探討。豬圓環(huán)病毒的檢測對(duì)控制該病極為重要，國內(nèi)外在這方面做了大量研究工作，目前診斷該病的方法有：免疫熒光法、ELISA方法、PCR方法、核酸探針雜交及原位雜交等。本項(xiàng)試驗(yàn)利用分子生物學(xué)技術(shù)（PCR）對(duì)廣州地區(qū)個(gè)別豬場的PCV=2\*ROMANII進(jìn)行調(diào)查研究，提取病料，并對(duì)其中一個(gè)開放式閱讀框ORF2基因段進(jìn)行克隆和測序，以期建立快速診斷法,為PCV=2\*ROMANII的疾病防制、分子生物學(xué)和疫苗研究提供一定的依據(jù)和基礎(chǔ)，減少PCV=2\*ROMANII給養(yǎng)豬業(yè)造成的巨大經(jīng)濟(jì)損失。二、項(xiàng)目研究的內(nèi)容與方法項(xiàng)目研究內(nèi)容：送檢病料圓環(huán)病毒PCR檢測與流行病學(xué)調(diào)查基本實(shí)驗(yàn)方法：第一部分：Ⅱ型圓環(huán)病毒(PCV2)PCR診斷方法的建立與流行病學(xué)調(diào)查分析1.引物設(shè)計(jì)：根據(jù)ORF2進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，并由上海博亞生物技術(shù)公司合成。2.病料收集與抽提DNA：收集病料，研磨，用試劑盒抽提DNA。3.PCR：PCR條件優(yōu)化。4.電泳分析：加樣電泳后觀察結(jié)果。5流行病學(xué)調(diào)查分析；數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，對(duì)所有調(diào)查結(jié)果進(jìn)行分析總結(jié)。完成流行病學(xué)調(diào)查并保存PCV陽性的病料。第二部分：PCV2ORF2基因段的克隆和測序6.PCR產(chǎn)物的回收與純化。7.PCR產(chǎn)物純化后與PMD18－T載體連接8.連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a9.提取重組質(zhì)粒DNA。10.對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定。11.測序三、項(xiàng)目研究過程與資料查閱情況項(xiàng)目研究過程：本項(xiàng)目從廣東、廣西地區(qū)部分豬場送檢的病死豬提取病料，然后采取PCR方法進(jìn)行診斷，記錄檢測結(jié)果，再進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查分析。然后對(duì)保存的PCV2陽性病料的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并克隆其ORF2基因，最后對(duì)所提重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒送上海博亞公司進(jìn)行測序。資料查閱情況：[1]粱紅虎，羅滿林，劉鎮(zhèn)明等.2003.豬圓環(huán)病毒2型的一種PCR檢測方法[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）.24（3）：91－92[2]王忠田，楊漢春，郭鑫.2002.規(guī)?；i場豬圓環(huán)病毒2型感染的流行病學(xué)調(diào)查[J].中國獸醫(yī)雜志.38（10）：3－5[3]朗洪武，張廣川，吳發(fā)權(quán)等.2000.斷奶豬多系統(tǒng)衰弱綜合癥血清抗體檢測[J].中國獸醫(yī)科技.30（3）：3－5[4]劉正飛，陳煥春，琚春梅等.2002.豬圓環(huán)病毒研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展.23（2）：14－16[5]朗洪武，王力，張廣川等.2001.豬圓環(huán)病毒分離鑒定及豬斷奶多系統(tǒng)衰弱綜合癥的診斷[J].中國獸醫(yī)科技.31（3）：3－5[6]王忠田，楊漢春。呂艷麗.2003.豬圓環(huán)病毒=2\*ROMANII型ORF2基因的克隆及序列分析[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展.24（1）：84－87[7]梁國棟.2001.最新分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù).北京：科學(xué)出版社.53－54[8]分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作指南.廣州：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院傳染病教研室實(shí)驗(yàn)材料四、項(xiàng)目成果完成形式和價(jià)值1初步建立了Ⅱ型圓環(huán)病毒(PCV2)的PCR檢測方法。2通過流行病學(xué)調(diào)查，獲知了廣東、廣西兩地PCV2感染情況，給廣大養(yǎng)殖戶提供了第一手資料，為兩地PCV2防治做出了一定的貢獻(xiàn)。3克隆表達(dá)了PCV2的ORF2段基因，為臨床研制五、經(jīng)費(fèi)使用情況科研業(yè)務(wù)費(fèi)：包括有資料的收集和復(fù)印、論文印制、DNA序列測定等：1200元實(shí)驗(yàn)材料費(fèi)：包括有樣品的收集、分子生物學(xué)試劑盒、實(shí)驗(yàn)消耗性材料：1600元六、申請(qǐng)人對(duì)該項(xiàng)目研究工作完成后的認(rèn)識(shí)總結(jié)本項(xiàng)研究建立了豬=2\*ROMANII型圓環(huán)病毒（PCV2）的PCR診斷方法，并且分析統(tǒng)計(jì)出廣東廣西地區(qū)圓環(huán)病毒的感染情況，為該地區(qū)廣大養(yǎng)殖戶提供了第一手參考資料，減少了PCV2給當(dāng)?shù)仞B(yǎng)豬業(yè)帶來的損失。另外，在項(xiàng)目研究工作完成后還對(duì)PCV2ORF2段基因進(jìn)行了克隆和測序，為為臨床研制PCV2基因工程苗提供理論基礎(chǔ)。在實(shí)驗(yàn)過程中，在老師和師兄的指導(dǎo)下，我對(duì)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)有了初步的了解，并掌握了一些基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，為以后從事更深層的研究打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。本人在這次創(chuàng)新課題中收獲較大。七、指導(dǎo)教師對(duì)項(xiàng)目完成情況的意見該生在老師的指導(dǎo)下獨(dú)力完成了PCV2臨床送檢病料PCR診斷、流行病學(xué)資料統(tǒng)計(jì)分析，克隆了PCV2ORF2全基因片段。該生為兩廣地區(qū)的養(yǎng)豬生產(chǎn)做出了一定的貢獻(xiàn)，本論文設(shè)計(jì)合理，技術(shù)路線正確，方法先進(jìn)，結(jié)果可靠，結(jié)論正確。該生工作態(tài)度端正，能吃苦耐勞，圓滿按期完成了本項(xiàng)研究任務(wù)。實(shí)驗(yàn)達(dá)到了預(yù)期效果，研究結(jié)果將在多方面具有參考價(jià)值。簽字：2006年4八、項(xiàng)目所在單位專家評(píng)審意見簽字：